CN112824541A - 用于检测链球菌的方法、寡核苷酸和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了用于检测链球菌的寡核苷酸、试剂盒和方法，其都涉及用于检测链球菌属基因组中一个保守性区域的第一引物对和第一探针；用于检测B族链球菌基因组中第一个保守性区域的第二引物对和第二探针；用于检测B族链球菌基因组中不同于所述第一个保守性区域的第二个保守性区域的第三引物对和第三探针，采用荧光PCR技术，同时检测链球菌属及其成员B族链球菌，并且在检测B族链球菌时，同时扩增B族链球菌基因组中的两个不同的保守性区域，可以避免漏检。
Description
技术领域
本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测链球菌属及B族链球菌的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，对临床样本中可能存在的B族链球菌进行多重检测。
背景技术
链球菌属(Streptococcus)是化脓性球菌中的一大类常见的革兰阳性球菌。链球菌属目前有69个种和亚种，广泛分布于自然界、人类和动物的粪便、健康人的鼻咽部等处，大多数并不致病。链球菌在人体中引起的疾病主要有各种化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎以及风湿热、肾小球肾炎等超敏反应性疾病。
根据在血琼脂培养基上的溶血特征，链球菌属可分为三种不同类型：(1)甲型溶血性链球菌，又称为草绿色链球菌，菌落周围出现草绿色溶血环，通常寄居在人的口咽腔、呼吸道及肠道中，致病力弱，多为条件性致病菌；(2)乙型溶血性链球菌，产生强烈的溶血毒素，在血琼脂培养基上，可使菌落周围出现宽2～4毫米、界限分明、无色透明的溶血环，致病力强，能引起人类和动物患上多种疾病；(3)丙型链球菌，不溶血，菌落周围无溶血环，一般不致病。
根据链球菌的抗原构造不同，又分成A、B、C、D等20个群，在每一群中，因表面蛋白抗原的不同，又分成若干亚群。对人类有致病性的链球菌菌株，90％左右属于A群，B、C、D、G群偶见。
链球菌所致疾病具有复杂而多样的特点，一方面，由于细菌类型多，且既有侵袭力也有毒素；另一方面，人体各组织器官均高度易感，且有变态反应机制参与发病。链球菌产生的侵袭性酶有：透明质酸酶、链激酶和链道酶等；产生的毒素有：链球菌溶血素、红疹毒素。变态反应性疾病如风湿热、急性肾小球性肾炎等，均可由A群链球菌感染引发。
B族链球菌(group B Streptococcus,GBS)，也称为无乳链球菌，是一种常见的革兰阳性链球菌，以其细胞壁中的多糖类C物质属于兰斯菲尔德抗原结构分类中的B群而得名。根据它的荚膜多糖抗原性的不同，B族链球菌又分为9种血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅷ型)。B族链球菌常存在于直肠与阴道，可引起产妇羊膜腔感染、胎膜早破、胎儿早产、流产等情况。据统计，约10％～30％的孕妇感染B族链球菌，其中40％～70％在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿携带这种菌，大约有1％～3％会出现早期侵入性感染，发生脑膜炎、肺炎、败血症，其中有5％会导致死亡。相关研究表明，抗菌药物的针对使用可有效地预防产妇胎膜早破等不良妊娠结局的发生。
基于B族链球菌感染引起孕妇和新生儿相关不良症状，产前筛查B族链球菌显得极为重要。2010年美国疾病预防中心指定了《围产期B族链球菌预防指南》，建议孕妇在妊娠35～37周进行B族链球菌筛查。
在过去相当长的时间里，对GBS的诊断主要是通过对孕产妇直肠或阴道拭子、新生儿的血液或脑脊液进行培养来实现的，但是常规的培养方法在检测孕妇B族链球菌感染方面的假阴性率可高达50％。应用选择性培养基可以抑制其他微生物的生长，这种选择性培养一直是确定B族链球菌感染的金标准。但是选择性培养得出阴性结果要72小时，阳性结果至少也要48小时才能得出，所以需要快速检测B族链球菌的方法来弥补这一缺憾。
由于B族链球菌的抗生素预防策略的实施以及抗生素的广泛应用，对轻度感染和经抗生素治疗的患者，传统的培养和血清学检测方法难免会出现敏感性不足的问题，假阴性也时有发生。分子生物学技术的出现和飞速发展，为B族链球菌的快速灵敏诊断提供了新的技术平台。主要有以下几类方法用于对B族链球菌的临床诊断和(或)菌株研究：分子杂交诊断、聚合酶链反应(PCR)及相关技术诊断以及分子生物学分型技术等。
分子杂交诊断是通过特异性探针来检测B族链球菌的DNA或RNA而实现的。常用技术有原位杂交，Southern印迹杂交(southern blot)以及斑点杂交(dot blot)。国外常用针对B族链球菌的rRNA设计杂交试剂盒来检测B族链球菌感染，其在孕妇中检测的灵敏度为94.17％～100％，特异性为96.19％～99.15％。最近报道应用荧光原位杂交(FISH)的方法检测孕妇B族链球菌带菌率，发现FISH可以诊断98.13％的带菌者，而标准的培养方法只有64.14％阳性率。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。
聚合酶链反应(PCR)技术的发展为快速、灵敏、特异性地检测各种临床样本中的病原体提供了强有力的工具。通过对核糖体操纵子基因进行巢式PCR检测也是近年来的一个研究方向，这种方法通过扩增核糖体16S rRNA基因或16S-23S间隔区来检测B族链球菌。它的特异性达87％～96％，但有一定的假阳性，可能由于核糖体操纵子在细菌种属之间有较高同源性所致，如难辨链球菌(S.difficile)和B族链球菌的16S-23S rDNA之间就有70％的同源性。B族链球菌全基因组序列的测定，为选择B族链球菌中除核糖体操纵子外的其他特异性检测靶点提供了更多信息。有学者针对编码C5a肽酶的scpB基因设计引物对B族链球菌进行检测。还有人针对编码Cα蛋白的基因bca、Cβ蛋白的bac基因和编码Cα样蛋白的alp2、alp3以及编码rib蛋白的rib基因设计引物，对B族链球菌表面蛋白的基因分布和变异进行研究。
然而，现有技术中尚没有在检测B族链球菌的同时对链球菌属进行检测，这样即便临床样本不存在B族链球菌，也可指出存在其他的链球菌，这有助于临床医生开展进一步的病原体排查。此外，现有的PCR技术往往针对B族链球菌的单个基因片段进行检测，这容易出现漏检的问题。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供一种用于检测链球菌的方法、寡核苷酸和试剂盒，选择了B族链球菌基因组中两个不同的保守区域(比如一个保守区域来自Sip基因，另一个保守区域来自Cfb基因)设计两组引物和探针，同时根据链球菌属基因组中的一个保守序列(比如，来自16S rRNA基因、23S rRNA基因或16S-23S rDNA间隔区的保守序列)设计了一组引物和探针作为内对照，再者引入人基因组管家基因β-globin作为内参照，建立双质控、双靶标验证体系，可以有效地避免检测临床样本时遇到的一系列结果异常，同时还可解决B族链球菌漏检的问题。
在本发明中，位于每条探针5’端的x1、x2、x3和x4为荧光报告基团，位于每条探针5’端的y1、y2、y3和y4为发出荧光或不发出荧光的淬灭基团。
本发明中的同一条探针的荧光报告基因和淬灭基团以诸如“FAM-TARMA/BHQ1”或“VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1”之类的形式给出，“-”左边的表示荧光报告基团，“-”右边的表示淬灭基团。FAM-TARMA/BHQ1表示一条探针的荧光报告基因为FAM，淬灭基团可选自TARMA或BHQ1。VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1表示，一条探针的荧光报告基因可选自VIC、HEX或JOE，淬灭基团可选自TAMRA或BHQ1。
本发明提供用于检测链球菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括(1)用于检测链球菌属基因组中一个保守性区域的第一引物对和第一探针；(2)用于检测B族链球菌基因组中第一个保守性区域的第二引物对和第二探针；(3)用于检测B族链球菌基因组中不同于所述第一个保守性区域的第二个保守性区域的第三引物对和第三探针。
进一步地，所述寡核苷酸还包括(4)用于检测内标基因的第四引物对和第四探针。
进一步地，所述链球菌属基因组的保守性区域来自16S rRNA基因、23S rRNA基因或16S-23S rDNA间隔区。
进一步地，所述第一个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
进一步地，所述第二个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
进一步地，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3。
进一步地，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6。
进一步地，所述第三引物对和第三探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:7～9。
进一步地，所述第四引物对和第四探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:10～12。
进一步地，每条探针的荧光报告基因和淬灭基团选自FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。
本发明还提供一种检测链球菌的方法，所述方法包括：(1)提取样本中的DNA；(2)在一组引物和探针存在下，在单管中对(1)中的DNA进行荧光PCR扩增；(3)确定样本中是否存在B族链球菌，若不存在，则确定是否存在其他的链球菌属细菌，所述一组引物和探针包括用于检测链球菌属基因组中一个保守性区域的第一引物对和第一探针；用于检测B族链球菌基因组中第一个保守性区域的第二引物对和第二探针；用于检测B族链球菌基因组中不同于所述第一个保守性区域的第二个保守性区域的第三引物对和第三探针。
进一步地，所述一组引物和探针还包括用于检测内标基因的第四引物对和第四探针。
进一步地，所述链球菌属基因组的保守性区域来自16S rRNA基因、23S rRNA基因或16S-23S rDNA间隔区。
进一步地，所述第一个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
进一步地，所述第二个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
进一步地，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3。
进一步地，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6。
进一步地，所述第三引物对和第三探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:7～9。
进一步地，所述第四引物对和第四探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:10～12。
进一步地，每条探针的荧光报告基因和淬灭基团选自FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。
本发明还提供一种用于检测链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括荧光PCR反应液，所述荧光PCR反应液包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)用于检测链球菌属基因组中一个保守性区域的第一引物对和第一探针；(2)用于检测B族链球菌基因组中第一个保守性区域的第二引物对和第二探针；(3)用于检测B族链球菌基因组中不同于所述第一个保守性区域的第二个保守性区域的第三引物对和第三探针。
进一步地，所述寡核苷酸包括(4)用于检测内标基因的第四引物对和第四探针。
进一步地，所述链球菌属基因组的保守性区域来自16S rRNA基因、23S rRNA基因或16S-23S rDNA间隔区。
进一步地，所述第一个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
进一步地，所述第二个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
进一步地，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3。
进一步地，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6。
进一步地，所述第三引物对和第三探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:7～9。
进一步地，所述第四引物对和第四探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:10～12。
进一步地，每条探针的荧光报告基因和淬灭基团选自FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取液1和核酸提取液2，其特征在于，所述核酸提取液1包括10～100mM Tris，10～100mM NaCl和0.1％～2％SDS，所述核酸提取液2包括10～200mM NaCl，10～100mM Tris、0.1～2％巯基乙醇和1～5％Chelex-100
本发明还提供一种用于检测链球菌的试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照和核酸提取液，包括用于(1)用于检测链球菌属的引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3；(2)用于检测B族链球菌Sip基因的引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6；(3)用于检测B族链球菌Sip基因的引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7～9：(4)用于检测内参基因的引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:10～12。
进一步地，每条引物和探针的浓度范围为75～300nM。
进一步地，核酸提取液包括核酸提取液1和核酸提取液2，其中核酸提取液1包括10～100mM Tris，10～100mM NaCl和0.1％～2％SDS；核酸提取液2包括10～200mM NaCl，10～100mM Tris、0.1～2％巯基乙醇和1～5％Chelex-100。
进一步地，所述PCR反应液还包括10～50mM Tris(pH 8.0～9.2)、10～50mM KCl、10～20mM硫酸铵、0.01％～0.1％Tween20、0.2～2mg/mL BSA、0.1～0.3mM dATP、0.1～0.3mM dTTP、0.1～0.3mM dCTP、0.1～0.3mM dGTP、0.1～0.3mM dUTP、3～6mM氯化镁。
进一步地，所述试剂盒操作流程为：(1)两步法提取样本DNA：第一步取1mL样本12000rpm离心，弃上清，加0.5mL核酸提取液1，涡旋混匀，弃上清；第二步加100μL核酸提取液2，100℃煮沸10min，12000rpm离心，上清核酸备用；(2)PCR试剂配制：将PCR反应液和酶混合液混匀，分别加入(1)中提取的样本DNA和阴性质控、阳性质控；(3)荧光PCR检测：进行荧光PCR扩增，扩增结束后确定样本中是否存在链球菌属及其成员B族链球菌。
有益效果：(1)本发明选择了B族链球菌基因组中两个不同的保守区域(比如一个保守区域来自Sip基因，另一个保守区域来自Cfb基因)设计两组引物和探针，同时根据链球菌属基因组中的一个保守序列(比如，来自16S rRNA基因、23S rRNA基因或16S-23S rDNA间隔区的保守序列)设计了一组引物和探针作为内对照，再者引入人基因组管家基因β-globin作为内参照，建立双质控、双靶标验证体系，从而可以有效地避免临床样本采样失误、核酸提取失误等一系列因素导致的结果异常，更重要地，这还可以解决B族链球菌漏检的问题；(2)鉴于B族链球菌也是链球菌属的一个成员，因此当临床样本中存在B族链球菌时，在所要检测的Sip和Cfb基因保守性区域都未发生突变的情形下时，针对16S rRNA、Sip和Cfb基因进行荧光PCR检测都应出现明显的S曲线，因此这就有多个指标来判断临床样本中是否存在B族链球菌，这样就可进一步地降低假阳性的出现；(3)鉴于B族链球菌在不同的人体环境中遭受不同的进化压力，具有不同的突变率，这就可能发生当临床样本中存在B族链球菌时，但因所要检测的基因(以Sip为例进行说明)发生突变而未被检测出来，本发明也可以根据针对16S rRNA和Cfb基因的荧光PCR检测是否出现明显的S曲线来判断是否存在B族链球菌，从而尽可能降低由于基因序列突变而导致的B族链球菌漏检；(4)当临床样本中不存在B族链球菌时，针对Sip和Cfb基因的荧光PCR检测不会出现明显的S曲线，在这种情形下，如果针对16S rRNA基因进行荧光PCR检测时也没有出现明显的S曲线，这表明临床样本中不存在链球菌，如果针对16S rRNA基因进行荧光PCR检测时出现明显的S曲线，这表明临床样本中存在除B族链球菌之外的链球菌，这有助于临床医生开展进一步的病原体排查；(5)本发明可以从复杂样本检测出B族链球菌，具有灵敏度高、特异性好、检测结果快速客观等优点，为诊断链球菌属及其成员B族链球菌感染提供可靠的结果。
附图说明
图1：针对本发明的碱裂解法提取的核酸的检测结果。
图2：针对作为对照的磁珠法提取的核酸的检测结果。
图3：本发明对阳性参考品P1的检测结果。
图4：本发明对阳性参考品P2的检测结果。
图5：本发明对阳性参考品P3的检测结果。
图6：本发明对阳性参考品P4的检测结果。
图7：本发明对阳性参考品P5的检测结果。
图8：本发明针对阴性参考品N1-N10的检测结果。
图9：本发明Cy5通道Cfb基因检测灵敏度初步判断结果图。
图10：本发明ROX通道Sip基因检测灵敏度初步判断结果图。
图11：500copies/mL时，本发明针对Cy5通道Cfb基因检测灵敏度验证结果图。
图12：500copies/mL时，本发明针对ROX通道Sip基因检测灵敏度验证结果图。
图13：1000copies/mL时，本发明针对Cy5通道Cfb基因检测灵敏度验证结果图。
图14：1000copies/mL时，本发明针对ROX通道Sip基因检测灵敏度验证结果图。
图15：2000copies/mL时，本发明针对Cy5通道Cfb基因检测灵敏度验证结果图。
图16：2000copies/mL时，本发明针对ROX通道Sip基因检测灵敏度验证结果图。
具体实施方式
在检测B族链球菌的方法中，通常会选择采用B族链球菌中一段保守序列来设计引物和探针，再结合检测人类基因组DNA中的管家基因，检测临床样本中是否B族链球菌。但是，B族链球菌在不同的人体环境中遭受不同的进化压力，具有不同的突变率。为了尽可能降低由于基因序列突变而导致的B族链球菌漏检，本发明选择了B族链球菌基因组中两段保守序列设计两组引物和探针，同时根据链球菌属基因组中的一段保守序列(比如这段保守序列来自于16S rRNA基因)设计了一组引物和探针作为内对照，再者引入人基因组管家基因(比如β-globin)作为内参照，建立双质控、双靶标验证体系，从而可以有效地避免临床样本采样失误、核酸提取失误等一系列因素导致的结果异常，更重要地，这还可以解决B族链球菌漏检的问题。基于此，设计出的引物和探针如表1所示。
表1.引物和探针
表1共含有4条TaqMan探针，每条探针的5’端(x1、x2、x3和x4)为荧光报告基团，3’端(y1、y2、y3和y4)为发出荧光或不发出荧光的淬灭基团。这4条探针的荧光报告基团可选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640和LCRED705等；淬灭基团可选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse和NFQ等，淬灭基团的选择原则在于淬灭基团的荧光吸收光谱与荧光报告基团的发射光谱存在重叠。表1中的这四条探针的荧光报告基团和淬灭基团优选组合方式为FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。优选地，每条探针的荧光报告基团各不相同，这样就可在单管中同时进行四通道检测。
优选的荧光报告基团为FAM、ROX和Cy5，这是因为这三种荧光报告基团在荧光定量PCR检测中具有本底荧光低和荧光检测信号高的优点。
在进行荧光PCR之前，需要提取临床样本中的核酸(DNA)，提取核酸的方法有很多种，比如碱裂解法、磁珠法和柱提法。为了便于说明，本发明采用碱裂解法提取临床样本中的核酸，所采用核酸提取液包括核酸提取液1和核酸提取液2，其中核酸提取液1包括10～100mM Tris，10～100mM NaCl和0.1％～2％SDS；核酸提取液2包括10～200mM NaCl，10～100mM Tris、0.1～2％巯基乙醇和1～5％Chelex-100。不过注意的是，虽然这里采用碱裂解法提取临床样本中的核酸，但是本发明并不局限于这种核酸提取方法，磁珠法和柱提法等方法均可用于本发明的临床样本核酸提取。
为了便于说明，在以下实施例中，以用于检测链球菌属16S rRNA基因的探针的荧光报告基团和淬灭基团为FAM-BHQ1、用于检测B族链球菌Sip基因的探针的荧光报告基团和淬灭基团为ROX-BHQ2、用于检测B族链球菌Cfb基因的探针的荧光报告基团和淬灭基团为CY5-BHQ3、用于人基因组管家基因β-globin的探针的荧光报告基团和淬灭基团为VIC-BHQ1为例进行说明。在本发明的实施例中使用的菌株购自ATCC，用于制备试剂盒中的阳性质控和参考品。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围，而是提供对本发明的进一步理解。
实施例1：临床样本核酸的提取
为方便说明，本实施例中以孕产妇阴道分泌物作为临床样本，对进行说明。
取孕产妇阴道分泌物样本1mL于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，吸弃上清，加入500μL核酸提取液1，震荡混匀，1200rpm离心10min，吸弃上清；加入50μL核酸提取液2，震荡混匀，100℃水浴或者干浴10min，上清液作为DNA提取液备用。其中核酸提取液1包含50mM Tris、20mM NaCl和1％SDS；核酸提取液2包含50mM Tris、20mM NaCl、0.5％巯基乙醇和2％Chelex-100。
本发明中核酸提取方法为碱裂解法，采用两步法对临床样本分别进行洗涤及核酸提取。采用艾康生物技术(杭州)有限公司生产的核酸(DNA)提取试剂盒(磁珠法)(浙杭械备20150133号)作为对照对同样的临床样本进行核酸提取，采用本发明的试剂盒检测人基因组DNA管家基因β-globin，对检测到的Ct值进行比对，结果如图1和图2所示。由图1和图2可知，本发明的核酸提取方法与磁珠法提取方法检测结果基本一致，同时又具有操作简便、试剂成本低等特点。
实施例2：利用荧光PCR方法检测B族链球菌
本实施例中采用试剂盒对B族链球菌进行荧光定量PCR检测，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阳性质控、阴性质控。优选地，这种试剂盒还可包括实施例1中的核酸提取液1和核酸提取液2。PCR反应液配制体系见表2。酶混合液配制体系见表3。阳性质控为B族链球菌培养物，阴性质控为0.9％NaCl溶液。
表2.PCR反应液配制体系表(1人份)
表3.酶混合液配制体系(1人份)
检测临床样本中病原体B族链球菌时，需将PCR反应液和酶混合液混匀，以及计算所需的样本数n份[n＝临床样本数+1管阳性对照+1管阴性对照]。将36μL PCR反应液加入到不同的反应管中，然后分别往不同的反应管中加入4μL实施例1中提取的DNA溶液、4μL阴性对照和4μL阳性对照。
将各个反应管按一定顺序放入荧光PCR仪(ABI 7500)上，按以下程序进行PCR扩增，扩增程序如表4所示：
表4.荧光PCR扩增程序
PCR扩增结束后，根据FAM通道、VIC通道、ROX通道、Cy5通道的Ct值检测B族链球菌是否存在，其检测结果判断如表5所示。
表5.检测结果Cutoff值及结果判读
临床样本常见检测结果如表6所示，其他异常结果需结合临床进行结果解释。
表6.临床样本常见结果解释
实施例3：内部临床样本验证
从杭州艾迪康医学检验中心收集临床样本，共300例孕产妇阴道分泌物样本，用于内部临床评价。
按照实施例1中的方法提取300例孕产妇宫颈分泌物样本核酸，然后按照实施例2中的方法对这300例样本中的核酸进行荧光PCR扩增，该结果作为实验组1结果进行记录。
按照实施例2中描述的方法，利用序列SEQ ID NO:7～9单独检测Cfb基因(实验组2)，利用序列SEQ ID NO:4～6单独检测Sip基因(实验组3)，配合内标基因检测，分别配制针对B族链球菌的PCR反应液配制体系，平行对这些相同300例孕产妇宫颈分泌物样本中的核酸进行荧光PCR扩增，并记录检测结果。针对三组检测结果的分析如表7所示。
表7：双靶标体系及单靶标检测结果一致性分析
以上结果中实验组2和实验组3检测结果均有1例样本的结果不与实验组1中的相同。对结果不一致的样本进行Sanger测序验证，验证结果与实验组1的检测结果相一致，这表明本发明采用的双靶标检测体系可以有效避免阳性标本的漏检，从而提高检测准确性。
为进一步验证双靶标检测体系的准确性，分别采用现有技术采用的B族链球菌核酸检测试剂(荧光PCR法)(针对Cfb基因设计引物探针,上游引物：5’-AGCAATCACACATGCTGTTGGA-3’，下游引物：5’-TAATGCTGTTTGAAGTGCTGCT-3’，探针：5’FAM-CAGTTGAATCCAAATGTTACGGTACAAC-TAMRA 3’，下称对照试剂1)及B组链球菌核酸测定试剂(荧光PCR法)(针对Sip基因设计引物探针，下称下称对照试剂2，上游引物：5’-TTGACATCGACAATGGCAGC-3’，下游引物：5’-TAACACTTGCCACTCTAGGG-3’，探针：5’FAM-AACAGATACGACGTGGACAG-TAMRA 3’，下称对照试剂2)同时作为对照试剂，平行对这300例相同的孕产妇宫颈分泌物样本中的核酸进行测试。检测结果如表8所示。
表8.临床样本检测结果
表8中的结果表明，对照试剂1中有2例样本的结果不与本发明中的相同；对照试剂2中有1例样本的结果不与本发明中的相同。对结果不一致的样本进行Sanger测序验证，验证结果与实验组1的检测结果相一致，这表明本发明采用的双靶标检测体系可以有效避免阳性标本的漏检，从而提高检测准确性。
实施例4参考品体系建立及评价
本实施例中，针对本发明所述的试剂盒设置如下参考品进行性能评价。阳性参考品设置：选择B组链球菌(血清型Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ)浓度约为5×105copies/mL的标准菌株培养物，作为试剂盒的阳性参考品(P1～P5)。阴性参考品设置：选择1份沙眼衣原体样本、1份淋病奈瑟菌阳性样本、1份解脲支原体阳性样本、1份HSV-2阳性样本、4份HPV阳性样本(包括HPV16、18、52、58各1份)、1份人基因组DNA、1份TE缓冲液作为阴性参考品(依次记为N1～N10)。
按照实施例2种所述的方法对试剂盒中设置的参考品进行阴阳符合率的评价。结果如下所示：
阳性参考品P1～P5检测结果为FAM、ROX、Cy5通道检测结果均为阳性，VIC通道检测结果为阴性。如图3～7所示。
阴性参考品N1～N9共9个阴性参考品FAM、ROX、Cy5通道检测结果均为阴性，仅VIC通道检测结果为阳性；阴性参考品N10检测结果为FAM、VIC、ROX、Cy5通道结果均为阴性。如图8所示。
实施例5检测灵敏度分析
在本实施例中，分别对B组链球菌最常见的血清型Ⅲ高浓度的标准菌株培养产物(约105copies/mL)对半稀释，按照实施例2中的方法对梯度稀释样本进行检测，初步判断试剂盒的检测下限，初步判断在1000copies/mL左右。如图9～10所示。
按照实施例2所述的试剂盒分别对B组链球菌最常见的血清型Ⅲ高浓度的标准菌株培养产物不同浓度(浓度分别为500、1000、2000copies/mL)重复20次检验，以95％检出率来确认试剂盒的检测下限。检测结果详见表8、9，其中表8为ROX通道检测结果统计，表9为Cy5通道检测结果统计，Sip基因扩增引物探针分别对500、1000、2000copies/mL标准菌检测检出率为80％、100％、100％，而Cfb基因扩增引物探针分别对500、1000、2000copies/mL标准菌检测检出率为80％、95％、100％；综上所述，试剂盒检测下限为1000copies/mL。如图11～16所示。
表9.ROX通道Sip基因检测下限结果统计
表10.Cy5通道Cfb基因检测下限结果统计
实施例6检测精密度分析
按照实施例2所述的试剂盒分别对1例中浓度阳性样本(大于105copies/mL)、1例弱阳性样本(约2000copies/mL)、1例阴性样本分别重复8次检测，统计不同通道检测结果，详见表10，从结果可以得出，试剂盒检测Ct值的CV均小于5％，由此可知本发明的试剂盒批内精密度良好。
表11.精密度样本检测结果
序列表
<110> 利多（香港）有限公司
<120> 用于检测链球菌的方法、寡核苷酸和试剂盒
<150> 201911146519.X
<151> 2019-11-21
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttaaagcc agtctcagtt cggat 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacttcgggt gttacaaact ctcgt 25
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<212> DNA
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tgtaggctgc aactcgccta catgaagtc 29
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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ccaccaactt catccacgtt cac 23
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tggagaagtc tgccgttact gccctgt 27
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<212> DNA
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<212> DNA
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taatgctgtt tgaagtgctg ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacagatacg acgtggacag 20
Claims (13)
1.用于检测链球菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括(1)用于检测链球菌属基因组中一个保守性区域的第一引物对和第一探针；(2)用于检测B族链球菌基因组中第一个保守性区域的第二引物对和第二探针；(3)用于检测B族链球菌基因组中不同于所述第一个保守性区域的第二个保守性区域的第三引物对和第三探针。
2.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括(4)用于检测内标基因的第四引物对和第四探针。
3.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述链球菌属基因组的保守性区域来自16S rRNA基因、23S rRNA基因或16S-23S rDNA间隔区。
4.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第一个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
5.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第二个保守性区域来自Sip或Cfb基因。
6.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3。
7.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6。
8.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第三引物对和第三探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:7～9。
9.如权利要求2所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第四引物对和第四探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:10～12。
10.如权利要求1所示的寡核苷酸，其特征在于，每条探针的荧光报告基因和淬灭基团选自FAM-TARMA/BHQ1、VIC/HEX/JOE-TAMRA/BHQ1、ROX/Texas Red-BHQ2和Cy5/LC Red640-BHQ2/BHQ3中的任何一种。
11.一种检测链球菌的方法，所述方法包括：(1)提取样本中的DNA；(2)在一组引物和探针存在下，在单管中对(1)中的DNA进行荧光PCR扩增；(3)确定样本中是否存在B族链球菌，若不存在，则确定是否存在其他的链球菌属细菌，其特征在于：所述一组引物和探针包括如权利要求1～10之一所示的寡核苷酸。
12.一种用于检测链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括荧光PCR反应液，其特征在于，所述荧光PCR反应液包括如权利要求1～10之一所示的寡核苷酸。
13.如权利要求12所示的试剂盒，所述试剂盒还包括核酸提取液1和核酸提取液2，其特征在于，所述核酸提取液1包括10～100mM Tris，10～100mM NaCl和0.1％～2％SDS，所述核酸提取液2包括10～200mM NaCl，10～100mM Tris、0.1～2％巯基乙醇和1～5％Chelex-100。
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