CN110231484A - 一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用 - Google Patents

一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用。利用噬菌体展示技术将抗癌胚抗原的单链抗体展示在辅助噬菌体M13KO7表面，以构建抗癌胚抗原单链抗体文库。用这个文库作为探针，特异性靶向结合表达癌胚抗原的细胞，然后利用经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获这类细胞。通过PCR扩增M13KO7的g3p基因从而达到快速、灵敏检测单个表达癌胚抗原细胞或低含量的循环肿瘤细胞的目的。

Description

一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种检测表达癌胚抗原的细胞的方法及其应用。
背景技术
肿瘤细胞标志物根据位置分布可以分为肿瘤细胞内标志物(miRNA和转录因子等)和肿瘤细胞膜上标志物(上皮细胞黏附分子、甲胎蛋白、癌胚抗原等)。
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种GPI-连接的细胞表面细胞粘附糖蛋白，具有28个潜在的N-糖基化位点，分子量为180-200kDa，是一种重要的肿瘤标志物。癌胚抗原在细胞浆产生，可经细胞膜分泌到细胞外，游离在组织液或血液等体液中。癌胚抗原存在于2-6个月胚胎的胰腺、肝脏、胃肠组织、以及内胚层来源的恶性肿瘤患者血清当中，研究表明，癌胚抗原可在超过90％的结直肠癌、胰腺癌，80％以上的非小细胞肺癌和50％的乳腺癌等肿瘤细胞表面表达。正常人血清中也能检测到低浓度的癌胚抗原(<2.5ng/mL)，检测血清中的癌胚抗原对恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面具有重要价值。
循环肿瘤细胞(CTC)是指在血液中传播的癌细胞[4,5]，其中一部分具有增加的转移能力，高达90％的癌症相关死亡与癌细胞的转移性扩散有关。此外，患者血液样本中循环肿瘤细胞的检测和计数，也称为液体活检，提供了一种非侵入性工具，用于实时监测治疗反应和估计转移复发的风险。大量研究表明，通过监测循环肿瘤细胞在血液中的水平可预测转移性结直肠癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌。
临床中常用于检测人血清中癌胚抗原的方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫测定(FIA)、放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、安培免疫测定、免疫金标记技术(ICG)以及蛋白芯片技术等。但目前临床上已有的检测技术大多需要耗费较长的检测时间，或需要特定的、昂贵的检测仪器配合才能完成。此外，对于低浓度的循环肿瘤细胞则无法检测出。
M13噬菌体是一种丝状病毒，病毒长约880nm，直径6.6nm，表面为具有螺旋形表面的纤维形状。由单链DNA(6407bp)和五种不同的蛋白质衣壳(PIII、PVI、PVII、PVIII和PIX)组成。M13噬菌体具有强大的展示功能，可将外源蛋白、多肽、抗体的DNA序列插入到M13噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，通过外壳蛋白的表达、组装从而将外源基因表达并组装在M13噬菌体表面。目前，国际上已有许多研究工作者利用这种M13噬菌体的展示技术，构建基于M13噬菌体的纳米探针用于能量发生器、生物传感器、药物递送、组织再生、疾病检测等。但目前国内外将这种技术应用于肿瘤检测的相关研究报道未见报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明构建一种新型生物探针，并提供了检测单个表达癌胚抗原细胞或低含量的循环肿瘤细胞的方法及过程，不仅能实现快速、低成本的检测，还能精确到血液中检测单个循环肿瘤细胞的检测，比现有的方法更加灵敏。
本发明的第一个目的是提供一种检测表达癌胚抗原细胞的方法，包括以下步骤：
(1)通过噬菌体展示技术，利用辅助噬菌体M13KO7构建抗癌胚抗原单链抗体噬菌体文库M13KO7-ACEAscFv，作为探针；
(2)将步骤(1)构建得到的探针M13KO7-ACEAscFv与待检测样本靶向结合；
(3)制备经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子；
(4)采用步骤(3)制备得到的经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获步骤(2)得到的结合细胞；
(5)通过M13KO7 g3引物PCR扩增步骤(4)结合细胞中噬菌体的g3p蛋白基因，1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如待检测样本包括表达癌胚抗原的细胞，则出现阳性条带。
进一步的，所述步骤(1)的具体步骤为：
(a)将抗癌胚抗原单链抗体序列重链可变区和轻链可变区经(Gly4Ser)3连接，克隆至pCANTAB 5E载体的SfiI和NotI克隆位点，得到重组质粒pCANTAB 5E-ACEAscFv；
(b)将重组质粒pCANTAB 5E-ACEAscFv转化至TG1感受态细胞，挑选阳性克隆接种至2xYT培养基，菌液培养至OD600为0.6-0.8时，将菌液以1:100接种至新的2xYT培养基扩大培养，培养至OD600为0.5时，以病毒感染复数0.01的比例加入辅助噬菌体M13KO7；培养，收集菌液，离心，收集沉淀；
(c)将步骤(b)中收集的沉淀重新加入2xYT重悬沉淀培养物，培养12h，收集菌液，离心收集上清并加入2.5MNacl/20％PEG 8000，冰浴1h，离心，沉淀用1xPBS重悬，该悬液为表达抗癌胚抗原单链抗体的噬菌体抗体库，命名为M13KO7-ACEAscFv。
进一步的，步骤(2)的具体步骤为：
(a)探针M13KO7-ACEAscFv与待检测样本以病毒感染复数不低于0.01的比例混合，在某些具体方案中，MOI为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2和5，于旋转混匀仪上室温混匀15～120min；优选的，混匀30min。
(b)3000rpm离心3min，去除上清，加入HBSS重悬，移至新的EP管3000rpm离心3min去除上清；
(c)重复操作b)3次，以去除多余未结合的M13KO7-ACEAscFv，制备得到与探针M13KO7-ACEAscFv靶向结合的待检测样本；
进一步的，步骤(3)的具体步骤为：
(a)取包被有蛋白G磁纳米粒子和抗癌胚抗原抗体(包被有蛋白G的磁纳米粒子：抗癌胚抗原抗体＝1:106～1:109，摩尔比)于新的EP管中，1xPBST定容，置于旋转混匀仪上室温混匀4h；
(b)磁性分离后去除上清，加入1x PBST洗涤3次；
(c)加入2％BSA置于旋转混匀仪上室温封闭2h，重复操作b)，1x PBST重悬备用，得到经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子。
进一步的，步骤(4)的具体步骤为：
(a)取HBSS重悬步骤(2)制备得到的与探针M13KO7-ACEAscFv靶向结合的待检测样本细胞，加入步骤(3)制备得到经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子，于旋转混匀仪上室温混匀30min，，使经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获步骤(2)得到的结合细胞；
(b)磁性分离，去除上清中未结合的M13KO7-ACEAscFv和细胞，HBSS清洗3次，加入HBSS重悬。
进一步的，步骤(5)所述M13KO7 g3p引物包括：
M13KO7 g3p-F：5’-CCGATGAAAACGCGCTACAG-3’(SEQ ID NO.1)；
M13KO7 g3p-R：5’-AAGGGCGACATTCAACCGAT-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步的，步骤(5)所述PCR反应体系为：2xTaq Master Mix 12.5μL；M13KO7 g3p-F 2μL；M13KO7 g3p-R 2μL；模板DNA 2μL；ddH2O 6.5μL。
进一步的，步骤(5)所述PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸15s，25个循环；72℃延伸5min。
本发明的第二个目的是提供前述的检测表达癌胚抗原细胞的方法在检测单个表达癌胚抗原细胞中的应用。
本发明的第三个目的是提供前述的检测表达癌胚抗原细胞的方法在检测低含量的循环肿瘤细胞中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明构建的抗癌胚抗原单链抗体融合病毒探针为一种新型生物探针，它能与癌胚抗原特异性结合，靶向结合表达癌胚抗原的细胞或血液中的循环肿瘤细胞，然后用抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获这类细胞。通过PCR扩增M13KO7的g3p基因从而达到快速、灵敏检测单个表达癌胚抗原细胞或低含量的循环肿瘤细胞的目的。从而，本发明建立的方法不仅能实现快速、低成本的检测，还能精确到血液中检测单个循环肿瘤细胞的检测，比现有的方法更加灵敏。
附图说明
图1 M13KO7-ACEAscFv探针制备及筛选表达癌胚抗原细胞的过程图
图2间接ELISA鉴定9株抗癌胚抗原单链抗体文库的特异性
图3间接免疫荧光鉴定抗癌胚抗原单链抗体文库的特异性，其中：
A.辅助噬菌体M13KO7感染Caco-2细胞2h；
B.抗癌胚抗原单链抗体库M13KO7-ACEAscFv分别感染Caco-2、HT29、HEK293T细胞2h。
图4qPCR定量M13KO7的g3p基因，其中：
A.M13KO7-ACEA scFv以MOI为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2和5感染Caco-2细胞2h；
B.M13KO7-ACEA scFv以MOI为1感染Caco-2细胞15min、30min、1h、2h。
图5表征M13KO7-ACEAscFv和磁纳米探针Dynabeads@ACEAAb。其中：
A.SDS-PAGE表征Dynabeads与抗癌胚抗原抗体的结合效率。M：p蛋白标准品：1：2μg抗癌胚抗原抗体；2：8μlDynabeads；3.8μlDynabeads@ACEA Ab；4.8μl未与Dynabeads结合的剩余抗体上清。
B.激光共聚焦显微镜表征M13KO7-ACEAscFv和Dynabeads@ACEAAb分别与Caco-2和HEK293T细胞结合情况。
C.PCR鉴定经Dynabeads@ACEAAb能捕获到分泌癌胚抗原的Caco-2和HT29细胞中的M13KO7-ACEAscFv。M：核酸标准品；1：Caco-2细胞；2；HT29细胞；3:HEK293T细胞；4:阴性对照。
图6 PCR鉴定g3p基因。其中：
A.不同个数反应的Caco-2细胞。M：核酸标准品；1：10000个细胞反应；2；1000个细胞反应；3:100个细胞反应；4.10个细胞反应；5.0个细胞反应；6:阴性对照。
B.不同pfu的M13KO7。M：核酸标准品；1:2.58×107pfu；2:2.58×106pfu；3:2.58×105pfu；4:2.58×104pfu；5:2.58×103pfu；6:2.58×102pfu；7:2.58×10pfu；8:阴性对照。
具体实施方式
一、主要材料与试剂
辅助噬菌体M13KO7、Universal qPCR Master Mix购自美国NEB公司，DNAMarker、2xTaq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，胎牛血清、DMEM、RPMI1640购自美国Gibco公司，蛋白质标准品购自北京全式金生物技术有限公司，DynabeadsTM Protein G购自美国Invitrogen公司，癌胚抗原重组蛋白购自美国Thermoscientific公司，TG1电转化感受态细胞、人结直肠癌细胞系Caco-2、HT29、人胚肾细胞(HEK293T)购自ATCC，抗M13噬菌体衣壳蛋白g8p抗体、抗癌胚抗原CEA抗体(EPCEAR7)、山羊抗兔IgG H&L(488)、山羊抗鼠IgG H&L(647)购自美国abcam公司，山羊抗小鼠IgG HRP购自biosharp科技有限公司，Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)购自美国Sigma公司，TMB显色剂、Phosphate Buffer Saline(PBS，10x)购自江苏凯基生物技术股份有限公司，引物由南京擎科生物科技有限公司合成(表1)。
表1本专利所用到的引物
Table1 Primers used by qPCR in this study
M13KO7 g3p(GenBank:HH807327.1)
实施例1制备抗癌胚抗原单链抗体融合病毒探针
(一)构建抗癌胚抗原单链抗体噬菌体文库作为探针
1.抗癌胚抗原单链抗体序列重链可变区(GenBank:CS681102.1)和轻链可变区(GenBank:CS681104.1)经(Gly4Ser)3连接，由南京德泰生物技术有限公司合成并克隆至pCANTAB 5E载体的Sfi I和Not I克隆位点之间，并将重组质粒命名为pCANTAB 5E-ACEAscFv。
2.将重组质粒pCANTAB 5E-ACEAscFv转化至大肠杆菌TG1感受态细胞，并涂布于氨苄抗性的平板，37℃培养过夜。
3.次日挑选阳性克隆接种至4mL 2xYT(Tryptone 16g,Yeast Extract 10g,Nacl5g,去离子水定容至1L，pH＝7.0)，在摇床设置为37℃、250rpm的条件下培养至OD600为0.6-0.8时，将菌液以1:100接种至100mL 2xYT。
4.菌液培养至OD600为0.5时，以病毒感染复数(multiplicityof infection,MOI)为0.01的比例加入辅助噬菌体M13KO7。在37℃摇床静置培养90min后收集菌液，菌液以4000rpm/min的转速离心15min，收集沉淀。
5.重新加入200mL 2xYT重悬沉淀培养物，在摇床设置为37℃、250rpm的条件下培养12h。
6.收集菌液，以4000rpm/min的转速离心15min，收集上清并加入40mL的2.5MNacl/20％PEG 8000，冰浴1h，以12000rpm/min的转速、4℃离心30min。
7.弃上清，沉淀用4mL 1xPBS重悬，该悬液为表达抗癌胚抗原单链抗体的噬菌体抗体库，命名为M13KO7-ACEAscFv。
(二)抗癌胚抗原单链抗体噬菌体文库滴度测定
1. 1x PBS梯度稀释M13KO7-ACEAscFv，取10μL稀释液加入200μLTG1混合，37℃孵育5min。
2.将上述混合液加至预热的3mL上层含琼脂培养基，倒入无抗性的LA平板，37℃过夜培养。
3.次日计算噬菌斑。
滴度(pfu/μL)＝斑点数x稀释倍数/10
实施例2鉴定抗癌胚抗原的单链抗体融合病毒探针
(一)间接ELISA鉴定抗癌胚抗原单链抗体文库特异性
1.使用抗原包被液(Na2CO3 0.159g,NaHCO30.293g,定容至100mL,pH＝9.6)将癌胚抗原蛋白稀释至2μg/mL，稀释液以每孔100μL加入96孔板中，4℃包被过夜。
2.次日弃去96孔板内多余癌胚抗原蛋白稀释液，1x PBST(含有0.05％土温80的1xPBS，v/v)洗涤3次后，干燥。
3.加入200μL的1％BSA(v/v)，37℃封闭2h后，1xPBST洗涤三次，干燥。
4.加入100倍稀释的M13KO7-ACEAscFv 100μL，37℃孵育1h。
5. 1xPBST洗涤6次后干燥，加入经1xPBS 100倍稀释的抗M13噬菌体衣壳蛋白g8p抗体100μL，37℃孵育1h。
6. 1xPBST洗涤6次后干燥，加入经1xPBS 10000倍稀释的山羊抗小鼠IgG HRP 100μL，37℃孵育30min。
7. 1xPBST洗涤6次后干燥，加入TMB显色剂100μL，反应5-10min。
8.加入终止液(2m H2SO4)50μL，测定OD450nm时的吸光值。
结果显示：
9株重组噬菌体均有分泌抗癌胚抗原抗体的能力，并且能与癌胚抗原重组蛋白结合，第8株抗癌胚抗原单链抗体文库具有更高的特异性(图2)，因此后续试验均用第8株。
(二)间接免疫荧光鉴定抗癌胚抗原单链抗体文库特异性
1.分别将Caco-2、HT29、HEK293T细胞接种至共聚焦小皿上，在条件为37℃、5％CO2的培养箱中培养细胞，待细胞长至50％时，以MOI(病毒感染复数)为1接种M13KO7-ACEAscFv/M13KO7，感染2h。
2. 1xPBS洗3次，每次3-5min，加入1mL的4％多聚甲醛于4℃固定20min。
3. 1xPBS洗3次，每次3-5min，加入1mL的0.1％Triton X-100(v/v)，室温处理10min。
4. 1xPBS洗3次，每次3-5min，加入500μL的10％羊血清(v/v)室温封闭15min。
5. 1xPBS洗3次，每次3-5min，加入经2％BSA200倍稀释的抗M13噬菌体衣壳蛋白g8p抗体和抗癌胚抗原CEA抗体(EPCEAR7)200μL，37℃孵育2h。
6. 1xPBS洗3次，每次3-5min，加入经1xPBS200倍稀释的山羊抗兔IgGH&L(488)和山羊抗鼠IgGH&L(647)200μL，37℃闭光孵育30min。
7. 1xPBS洗3次，每次3-5min，加入200μLDAPI室温避光孵育15min对细胞核染色。
8. 1xPBS洗3次，每次3-5min，使用激光共聚焦显微镜观察结果。
结果显示：
共聚焦显微镜下细胞核显蓝色荧光；癌胚抗原(CEA)显绿色荧光；M13噬菌体核衣壳蛋白g8p显红色荧光。
通过共聚焦显微镜观察到，Caco-2细胞分泌癌胚抗原，但不与辅助噬菌体M13KO7结合，不能观察到特异性的红色荧光(图3A)；
M13KO7-ACEAscFv能与分泌癌胚抗原的细胞Caco-2和HT29细胞结合，并能观察到M13噬菌体核衣壳蛋白g8p特异性红色荧光，相反不分泌癌胚抗原的HEK293T细胞不能观察到特异性红色荧光(图3B)。
实施例3抗癌胚抗原单链抗体融合病毒探针的应用
(一)M13KO7-ACEAscFv以不同的MOI感染Caco-2细胞
1.将Caco-2细胞接种至6孔板，在条件为37℃、5％CO2的培养箱中培养细胞，待细胞长至70-80％时，以MOI为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2和5接种M13KO7-ACEAscFv，以MOI为1接种M13KO7，感染2h。
2.弃去上清，使用预冷的1xPBS将6孔板洗三次，TRIzol法提取细胞全基因组，并反转录。
3.设置M13KO7-ACEAscFv病毒组和β-Actin内参组，进行实时荧光定量PCR。
实时荧光定量PCR的反应体系及条件如下：
20μL反应体系：
反应条件为:
(二)M13KO7-ACEAscFv以不同的感染时间感染Caco-2细胞
1.将Caco-2细胞接种至6孔板，在条件为37℃、5％CO2的培养箱中培养细胞，待细胞长至70-80％时，M13KO7-ACEAscFv/M13KO7以感染时间为15min、30min、1h和2h感染Caco-2细胞。
2.弃去上清，使用预冷的PBS将6孔板洗三次，TRIzol法提取细胞全基因组，并反转录。
3.设置M13KO7-ACEAscFv病毒组和β-Actin内参组，进行实时荧光定量PCR。
显示结果：
M13KO7-ACEAscFv以MOI为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2和5感染Caco-2细胞，感染2h后提取总基因组，当MOI低至0.01时qPCR能检测出M13KO7的g3p基因(图4A)。
M13KO7-ACEAscFv以MOI为1感染Caco-2细胞15min、30min、1h、2h，当感染15min时qPCR能检测出M13KO7的g3p基因(图4B)。
因此，M13KO7的检测限能低至MOI＝0.01，探针结合时间也能缩短为15min。
(三)M13KO7-ACEAscFv感染不同细胞
(A)制备抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子：
1.取DynabeadsTM Protein G 1.2mg于新的1.5mL EP管中，加入5μg抗癌胚抗原CEA抗体(EPCEAR7)，1xPBST定容至200μL，置于旋转混匀仪上室温混匀4h。
2.磁性分离后去除上清，加入1x PBST洗涤3次。
3.加入2％BSA置于旋转混匀仪上室温封闭2h，重复操作步骤2，1x PBST 100μL重悬备用，并命名为Dynabeads@ACEAAb。
(B)将探针M13KO7-ACEAscFv与细胞样本靶向结合：
4.制备分别含有Caco-2、HT29、HEK293T细胞的细胞悬液，细胞计数，3种细胞各取10000个于新的1.5mL EP管中，Caco-2和HEK293T细胞悬液中加入含2％胎牛血清的DMEM(v/v)定容至200μL，HT29细胞悬液中加入含2％胎牛血清的RPMI 1640(v/v)定容至200μL。
5.加入1x109pfu M13KO7-ACEAscFv，室温反应30min。
6.3000rpm离心3min，去除上清，加入400μL HBSS重悬，移至新的1.5mL EP管3000rpm离心3min去除上清。
7.重复操作6，3次，以去除多余未结合的M13KO7-ACEAscFv。
(C)采用抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获靶向结合细胞：
8.200μL HBSS重悬细胞，加入30μL制备好的Dynabeads@ACEAAb，置于旋转混匀仪上室温混匀30min，使经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获结合细胞。
9.磁性分离，去除上清中未结合的M13KO7-ACEAscFv和细胞，避免假阳性的可能性。HBSS清洗三次，加入20μLHBSS重悬。
(D)通过M13KO7 g3p引物PCR扩增靶向结合细胞中噬菌体的g3p蛋白基因，1％琼脂糖凝胶进行电泳分析：
PCR的反应体系及条件如下：
25μL反应体系：
反应条件为：
结果显示：
经SDS-PAGE鉴定，抗癌胚抗原抗体成功连接至Dynabeads(图5A)。
激光共聚焦显微镜观察到Dynabeads@ACEAAb为绿色荧光，分布在细胞膜上；
M13KO7-ACEAscFv为红色荧光，分布在细胞质中和细胞膜上(图5B)。
PCR鉴定结果显示，Dynabeads@ACEAAb能捕获到分泌癌胚抗原的Caco-2和HT29细胞，PCR结果有阳性条带；而不能分泌癌胚抗原的HEK293T细胞则不能被捕获，PCR无条带(图5C)。
(四)M13KO7-ACEAscFv感染不同个数的Caco-2细胞
1.制备Caco-2细胞的细胞悬液，细胞计数，取10000、1000、100、10、0个细胞于新的1.5mL EP管中，加入含2％胎牛血清的DMEM(v/v)定容至200μL。
2.加入1x109pfuM13KO7-ACEAscFv，室温反应30min。
3.3000rpm离心3min，去除上清，加入400μL HBSS重悬，移至新的1.5mL EP管3000rpm离心3min去除上清。
4.重复操作3，3次，以去除多余未结合的M13KO7-ACEAscFv。
5.200μL HBSS重悬细胞，加入30μL制备好的Dynabeads@ACEAAb，置于旋转混匀仪上室温混匀30min。
6.磁性分离，去除上清，HBSS清洗三次，加入20μLHBSS重悬，得到分离磁纳米粒子后的靶向结合细胞。
7.通过M13KO7 g3p引物PCR扩增步骤(6)得到的靶向结合细胞中噬菌体的g3p蛋白基因。
8.1％琼脂糖凝胶进行电泳分析。
结果显示：
在分别计数的10000、1000、100、10、0个细胞反应中，M13KO7-ACEAscFv能捕获低至10个Caco-2细胞中M13KO7-ACEAscFv的g3p基因(图6A)，而PCR能检测到低至25.8pfu的M13KO7的g3p基因(图6B)，即M13KO7-ACEAscFv能捕获单个表达癌胚抗原细胞及低含量的循环肿瘤Caco-2。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种检测表达癌胚抗原细胞的方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgatgaaaa cgcgctacag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagggcgaca ttcaaccgat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctccatcatg aagtgcgacg t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgatctcct tctgcatcct gtc 23

Claims (10)

1.一种检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过噬菌体展示技术，利用辅助噬菌体M13KO7构建抗癌胚抗原单链抗体噬菌体文库M13KO7-ACEAscFv，作为探针；
(2)将步骤(1)构建得到的探针M13KO7-ACEAscFv与待检测样本靶向结合；
(3)制备经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子；
(4)采用步骤(3)制备得到的经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获步骤(2)得到的结合细胞；
(5)通过M13KO7 g3p引物PCR扩增步骤(4)捕获的结合细胞中噬菌体的g3p蛋白基因，1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如待检测样本包括表达癌胚抗原的细胞，则出现阳性条带。
2.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为：
a)将抗癌胚抗原单链抗体序列重链可变区和轻链可变区经(Gly4Ser)3连接，克隆至pCANTAB5E载体，得到重组质粒pCANTAB5E-ACEAscFv；
b)将重组质粒pCANTAB5E-ACEAscFv转化至TG1感受态细胞，挑选阳性克隆接种至2xYT培养基，菌液培养至OD600为0.6-0.8时，将菌液以1:100接种至新的2xYT培养基扩大培养，培养至OD600为0.5时，以病毒感染复数0.01的比例加入辅助噬菌体M13KO7；培养，收集菌液，离心，收集沉淀；
c)将步骤(b)中收集的沉淀重新加入2xYT重悬沉淀培养物，培养12h，收集菌液，离心收集上清并加入2.5MNacl/20％PEG 8000，冰浴1h，离心，沉淀用1xPBS重悬，该悬液为表达抗癌胚抗原单链抗体的噬菌体抗体库，命名为M13KO7-ACEAscFv。
3.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：
a)探针M13KO7-ACEAscFv与待检测样本以病毒感染复数不低于0.01的比例混合，于旋转混匀仪上室温混匀15～120min；优选的，混匀30min；
b)3000rpm离心3min，去除上清，加入HBSS重悬，移至新的EP管3000rpm离心3min去除上清；
c)重复操作b)3次，以去除多余未结合的M13KO7-ACEAscFv，制备得到与探针M13KO7-ACEAscFv靶向结合的待检测样本。
4.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤为：
a)以摩尔比为1:106～1:109取包被有蛋白G的磁纳米粒子和抗癌胚抗原抗体于新的EP管中，1xPBST定容，置于旋转混匀仪上室温混匀4h；
b)磁性分离后去除上清，加入1x PBST洗涤3次；
c)加入2％BSA置于旋转混匀仪上室温封闭2h，重复操作b)，1x PBST重悬备用，得到经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子。
5.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(4)的具体步骤为：
a)取HBSS重悬步骤(2)制备得到的与探针M13KO7-ACEAscFv靶向结合的待检测样本细胞，加入步骤(3)制备得到的经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子，于旋转混匀仪上室温混匀30min，使经抗癌胚抗原抗体修饰的磁纳米粒子捕获步骤(2)得到的结合细胞；
b)将捕获的结合细胞磁性分离，去除上清中未结合的M13KO7-ACEAscFv和细胞，HBSS清洗3次，加入HBSS重悬。
6.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(5)所述M13KO7g3p引物包括：
M13KO7 g3p-F：5’-CCGATGAAAACGCGCTACAG-3’(SEQ ID NO.1)；
M13KO7 g3p-R：5’-AAGGGCGACATTCAACCGAT-3’(SEQ ID NO.2)。
7.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(5)所述PCR反应体系为：2xTaq Master Mix 12.5μL；M13KO7 g3p-F2μL；M13KO7 g3p-R2μL；模板DNA 2μL；ddH2O 6.5μL。
8.根据权利要求1所述检测表达癌胚抗原细胞的方法，其特征在于，步骤(5)所述PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸15s，25个循环；72℃延伸5min。
9.权利要求1至8任一项所述的检测表达癌胚抗原细胞的方法在检测单个表达癌胚抗原细胞中的应用。
10.权利要求1至8任一项所述的检测表达癌胚抗原细胞的方法在检测低含量的循环肿瘤细胞中的应用。
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