CN104031145B - 一种基因a型鸭甲肝病毒的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明以混合多肽与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓细胞进行融合，筛选得到杂交瘤细胞系3L1‑6，微生物保藏号CCTCC NO:C2013134。用获得的杂交瘤细胞系制备的单克隆抗体特异性强，稳定性好，可在制备基因A型鸭病毒性肝炎抗体检测试剂方面得到广泛的应用。用获得抗体研制的ELISA试剂盒特异性强，稳定性好，可应用于基因A型鸭甲肝病毒抗体的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及一种能够治疗鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法及制备抗体的用途，属于基因A鸭病毒性肝炎防控领域。
背景技术
鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitisvirus, DHV）引起的一种主要危害3周龄以内雏鸭的急性、高度致死性传染病。DHV包括小RNA病毒科和星状病毒科成员，而小RNA病毒科的DHV又被命名为鸭甲肝病毒(duckhepatitis A virus, DHAV)，根据基因型结构的差异，DHAV又分为基因A型（DHAV-A）、B型（DHAV-B）和C型（DHAV-C）三种基因型。其中在我国流行的传统Ⅰ型DHV为基因A型DHAV，台湾地区新发的为基因B型，而近年来，韩国样新型或称基因C型的DHAV在我国的地区分布已较为广泛，基因A型和C型DHAV在我国许多养鸭地区的同时流行是我国许多鸭场针对传统的Ⅰ型DHV采取措施后仍发生DVH的根本原因。
然而，目前还没有单克隆抗体用于基因A型DHAV检测及治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因A型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）合成多肽AEENRGNGWL，PVFDIQPWGV，PFDNQGKRKP，PFDNQGKRKP，ERDIGQLGLE，MLRTEKDYI，SNIYDDSFIM，GVAKLRAYTA，EDATVNIIGS，每条多肽的C-端加上半胱氨酸残基；
（2）将上述多肽混合并与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原；
（3）将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠：抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫1次，抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫一次，第4次增强免疫注射抗原，免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合；
（4）杂交瘤细胞株的制备与筛选：按常规的细胞融合技术融合：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓细胞进行融合，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养；以步骤（1）合成的多肽作为包被抗原，用间接ELISA方法和系列稀释法进行筛选，经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100 %，获得稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株；
（5）取6～8周龄Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5 ml/只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，-80℃冻存得到单克隆抗体的粗品；
（5）粗品经纯化得到单克隆抗体，所述单克隆抗体为分子量为50 KD左右为重链蛋白与分子量为25 KD左右轻链蛋白的组合，为IgG2亚类。
采用本发明的方法所制备的单克隆抗体特异性强，稳定性好，可以广泛应用于鸭甲肝病毒的治疗。
微生物信息
杂交瘤细胞株3L1-6保存在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCC NO.C2013134，保藏日期为2013年10月30日。
附图说明
图1：DHAV-A 与5株单抗的Western blotting杂交结果(单克隆抗体活性鉴定)
图2-5：基因A型鸭甲肝病毒单克隆抗体特异性的鉴定
图2：DHAV-A与5株单抗的Western blotting杂交结果（单克隆抗体与C型鸭肝炎的特异性鉴定）
图3：DPV与5株单抗的Western blotting杂交结果（单克隆抗体与鸭瘟病毒的特异性鉴定）
图4：NDV与5株单抗的Western blotting杂交结果（单克隆抗体与新城疫病毒的特异性鉴定）
图5：AIV与5株单抗的Western blotting杂交结果（单克隆抗体与禽流感病毒的特异性鉴定）
M: 蛋白分子量标准; 1: 5I-8单抗; 2: 3L1-6单抗; 3: 5M2-7单抗; 4: 3H3-6单抗; 5: 1F5-3单抗；（代号没有特殊意义，只是筛选单抗过程中区分的标识）
具体实施方式
实施例1
1.1 抗原制备
合成AEENRGNGWL，PVFDIQPWGV，PFDNQGKRKP，PFDNQGKRKP，ERDIGQLGLE，MLRTEKDYI，SNIYDDSFIM，GVAKLRAYTA，EDATVNIIGS，每个多肽合成500 μg。
在合成多肽过程中在多肽的C-端加上半胱氨酸残基，用thermo的SMPH双性多肽耦联试剂将多肽片段和KLH载体蛋白通过半胱氨酸耦联,作为抗原。提供抗
偶联过程:
1、将 20 mg SMPH 溶于2 ml DMF。 2、将0.8 ml KLH加入到25 ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使蛋白终浓度为 15 mg/ml。 3、将溶解好的SMPH溶液缓慢滴加到120 mgKLH 蛋白体系中，室温搅拌反应1h。 4、用1 L 1×PBS (PH 7.4) 溶液于4℃下透析 6 小时，除去游离的SMPH。 5、将透析后的KLH蛋白倒入50 ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mg KLH-SMPH溶液转移到5 ml离心管中。 6、将 3.0 mg 合成的混合多肽用 0.6 ml 1×PBS(pH 7.2) 溶液溶解。 7、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100 μl Ellman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412 nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。 Ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的Cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽Cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。 8、将多肽液滴加到KLH-SMPH管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。9、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100 μl Ellman试剂储备液，再加入10μl 教练后的多肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412 nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80%以上；OD值>0.03则再补加SMPH活化好的KLH蛋白继续交联。如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。
1.2 动物免疫
将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠。抗原（100微克）与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫1次，抗原（100微克）与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫一次，第4次增强免疫注射100微克抗原，免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。
1.3 杂交瘤细胞株的制备与筛选
按常规的细胞融合技术融合：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓细胞进行融合，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养。
以合成的多肽作为包被抗原，用间接ELISA方法和系列稀释法进行筛选，经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100 %，获得1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株，命名为3L1-6。
1.4 单克隆抗体腹水的制备
取6～8周龄Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5 ml/只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，-80℃冻存得到单克隆抗体的粗品备用。
实施例2：抗基因A型鸭甲肝病毒的单克隆抗体的特性鉴定
2.1 单克隆抗体的腹水效价鉴定
方法：采用间接ELISA法对步骤1.4所得到的单克隆抗体的腹水效价进行鉴定。
结果：本发明所述的单克隆抗体腹水效价为1:128 000。
2.2 单克隆抗体活性鉴定
方法：DHAV-A经SDS-PAGE电泳后半干转印至PVDF膜上进行Western blot分析。一抗为1:200稀释的MAb，二抗为1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG。
结果：该单克隆抗体与DHAV-A病毒发生特异性反应，如图1，杂交结果显示5株单克隆抗体能与病毒杂交显示出条带,说明5株单克隆抗体是有活性的，可以与抗原发生反应。
M: 蛋白分子量标准;1: 5I-8单抗;2: 3L1-6单抗;3: 5M2-7单抗; 4: 3H3-6单抗; 5: 1F5-3单抗
2.3 单克隆抗体的特异性鉴定
方法：DHAV-C，DPV，NDV和AIV经SDS-PAGE电泳后同3方法鉴定。
结果：MAb的特异性Western blot显示， 3L1-6MAb不与DHAV-C, DPV, NDV和AIV反应，说明3L1-6 MAb是DHAV-A的特异性单抗，如图2。
2.4 单克隆抗体的稳定性鉴定
方法：将阳性杂交瘤细胞体外连续传代培养，每隔3代检测细胞上清液的效价。将冻存的杂交瘤细胞复苏并多次传代，检测培养上清的抗体效价，分析杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。
结果：在体外连续培养20代， 3L1-6杂交瘤细胞株均能稳定分泌抗体，液氮冻存后复苏，细胞生长良好，且上清液抗体效价无明显变化，说明细胞株的抗体分泌性能很稳定。
实施例3 检测基因A型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA方法的建立
3.1 抗原的制备
DHAV-A临床分离株按0.2 mL/胚剂量经鸭胚尿囊腔途径接种11日龄鸭胚，弃24 h内死亡鸭胚，收集接种后24-96 h死亡和存活的鸭胚尿囊液，反复冻融3次。12 000r/min， 4℃离心15 min，取上清与等量氯仿混合；取上述病毒液与等量氯仿混合，4℃静置l h后，5,000r/min，4℃离心30min，取上清，重复上述操作两次；取上清用0.22 um滤器过滤后于超速离心机中40,000r/min离心2h，沉淀用适量PBS缓冲液溶解后，经20%、30%、40%、50%四个蔗糖密度梯度38,000r/min离心3h。缓慢吸取蔗糖溶液中明显亮带处的悬浮液体，于38,000r/min离心5h，沉淀用PBS缓冲液溶解，-80℃冻存备用。按公式：（mg/mL）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数。纯化的DHAV-C病毒于四川大学分析测试中心透射电镜观察。
3.2 DHAV-A 单克隆抗体的纯化
1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
4、12000r/min，4℃，30min，收集上清。
5、上清液经普通滤纸过滤1次，加入1/10体积的10*PBS（0.1M pH7.4）用1M NaOH调至7.4，冰浴至4℃。
6、根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵（0℃条件下，45%饱和硫酸铵为0.291g/ml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。缓慢加入时为了避免局部的浓度一下子很高，因为硫酸铵不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。冰浴条件是为了保证蛋白的活性，因为硫酸铵加入到辛酸溶液后会产热。
7、硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心。一般采取4℃搅拌30min后，继续静置至少60min（一般过夜）。再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于1.5ml结合缓冲液中。
结果：纯化后经SDS-PAGE鉴定只有二条目的条带，其中50 KD左右为
重链，25 KD左右为轻链，两条链所达标的蛋白组合即为单克隆抗体。
3.3 抗原最佳包被量与单抗最佳稀释度的确定
方法：采用矩阵法，用包被缓冲液将DHAV-A纯化病毒按20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL稀释后包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜；洗涤后5%脱脂奶粉37℃封闭2 h；洗涤后加入稀释的单抗5E3-9，单抗稀释度为1:200、1:300、1:400、1:600、1:800、1:1200、1:1600、1:2400，100μL/孔，37℃孵育1 h。洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:10000)，100 uL/孔，37℃孵育0.5 h；洗涤后加入底物TMB显色，室温避光孵育15min；加入2M H2SO4终止，测定OD450值。OD450值在1.0-1.5之间且与左右相差较大的反应孔使用的抗原浓度与单抗稀释度即为最佳抗原包被量与单抗最佳稀释度。
结果：方阵试验结果显示，当包被的DHAV-A浓度为5 μg/mL，单抗稀释度为1：1200时，OD450 nm 值在1.0左右，且与左右相差较大。因此，抗原包被浓度为5 μg/mL，单抗稀释倍数为1200倍。最佳抗原包被浓度与单抗稀释度条件优化如表1。
3.4 血清最佳稀释倍数的确定
方法：以最佳抗原包被浓度包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。洗涤封闭后加入阳性血清和阴性血清，分别用最佳单抗浓度做1:2、1:4、1:8、1:10、1:16、1:20、1:30、1:40、1:60、1:80、1:120、1:160、1:240倍稀释，并设空白对照孔、完全阳性血清孔、完全阴性血清孔及完全单抗孔，100μL/孔，37℃孵育1 h。洗涤后加入酶标二抗37℃孵育0.5 h，显色终止，测定OD450值。计算抑制率。
结果：血清稀释度为1:4时抑制率最高，故血清的最佳稀释度为1:4。
3.5 酶标二抗最佳浓度的确定
方法：以最佳抗原包被浓度包被酶标板，4℃过夜。洗涤封闭后加入最佳稀释度的单抗和血清，37℃孵育1 h。洗涤后，加入酶标二抗，稀释度分别为1:5000、1:10000、1:15000、1:20000，37℃孵育0.5 h，显色终止，测定OD450值。计算抑制率。
结果：当二抗稀释度为1:10000，抑制率为60.10%，达到最大，故最佳二抗稀释度为1:10000
3.6 酶标二抗最佳孵育时间的确定
方法：以最佳抗原包被浓度包被酶标板，4℃过夜。洗涤封闭后加入最佳稀释度的单抗和血清，37℃孵育1 h。洗涤后，加入最佳浓度酶标二抗，37℃孵育30 min、45 min、60min、75 min，TMB显色，2M H2SO4终止，测定OD450值。计算抑制率。
结果：当二抗孵育时间为45 min时，抑制率最高，及二抗最佳孵育时间为45 min。
3.7 最佳封闭液的确定
方法：分别用1% BSA、2%BSA、5%脱脂奶粉、10%脱脂奶粉、1%明胶做为封闭液，测定测定OD450值，计算抑制率。
结果：当用5%脱脂奶粉作为封闭液时，抑制率最高。
3.8 临界值的确定
方法：按照最佳的ELISA工作条件，对30份不含有DHAV-A抗体的鸭血清进行竞争ELISA测定，测定OD450值，计算血清抑制率，对所有的抑制率进行生物统计学分析，计算样本的平均抑制率和标准偏差，确定临界值（X ±3SD）。
结果：竞争ELISA检测阴性鸭血清的抑制率的平均值为25.68%，标准差为0.032，则临界值= X ±3SD=35.28%，当抑制率大于35.28%为阳性，当抑制率小于或等于35.28%，为阴性。
3.9 特异性
方法：实验用建立的方法对DHAV-C阳性血清、DUCV阳性血清、鸭抗大肠杆菌阳性血清，鸭抗金葡萄球菌阳性血清，鸭抗沙门氏菌阳性血清，鸭抗巴氏杆菌阳性血清进行检测，评价建立方法的特异性。
结果：用建立的方法对以上血清进行检测的抑制率均小于35.28%, 结果为阴性，因此该方法特异性好。
3.10 重复性实验
3.10.1 批内重复
方法：对同次包被的酶标板，测定1份DHAV-A阳性血清和1份DHAV-A阴性血清，每份血清做6个重复，测定OD450值，计算批内变异系数。
结果：组内变异系数为4.75-5.45%。
3.10.2 批间重复
方法：对二次包被的酶标板，测定1份DHAV-A阳性血清和1份DHAV-A阴性血清，每份血清做6个重复，测定OD450值，计算批间变异系数。
结果：组间的变异系数为5.82-8.37%。
结论：通过批内和批间重复试验可以看出该方法的重复性好。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南民族大学
<120> 一种基因A型鸭甲肝病毒的单克隆抗体及其应用
<160> 9
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
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AEENRGNGWL
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<211> 10
<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
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PVFDIQPWGV
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<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
<400> 3
PFDNQGKRKP
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<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
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PFDNQGKRKP
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<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
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ERDIGQLGLE
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<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
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MLRTEKDYI
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<213> Duck hepatitis A virus
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SNIYDDSFIM
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<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
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GVAKLRAYTA
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Duck hepatitis A virus
<400> 9
EDATVNIIGS
Claims (6)
1.一种基因A型鸭甲肝病毒抗原组，其特征在于，该抗原组是由合成的特异性多肽组成，所述多肽序列为AEENRGNGWL，PVFDIQPWGV，PFDNQGKRKP，PFDNQGKRKP，ERDIGQLGLE，MLRTEKDYI，SNIYDDSFIM，GVAKLRAYTA和EDATVNIIGS。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO.C2013134。
3.权利要求2所述杂交瘤细胞株分泌的基因A型鸭甲肝病毒单克隆抗体。
4.权利要求2所述的杂交瘤细胞株在制备用于检测基因A型鸭甲肝病毒抗原检测试剂中的应用。
5.权利要求3所述的基因A型鸭甲肝病毒单克隆抗体在制备用于检测基因A型鸭甲肝病毒抗原检测试剂中的应用。
6.一种基因A型鸭甲肝病毒抗体检测试剂盒，其特征在于包含权利要求3所述的基因A型鸭甲肝病毒单克隆抗体。
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