CN108586613A - 靶向cd19的人源抗体及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶向CD19的人源抗体,所述靶向CD19的人源抗体的重链可变区序列信息分别为:SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4所示;所述靶向CD19的人源抗体的轻链可变区序列信息分别为:SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9所示。本发明所筛选的靶向CD19的人源抗体序列,可以有效的与靶标蛋白CD19进行结合,并表现出不同的亲和力,该人源抗体可用于靶向CD19的多种不同应用,包括嵌合抗原受体技术、构建成为单抗以ADCC或CDC作用机制对肿瘤细胞进行杀伤、或者与其他的抗体结合构建成为双特异性抗体。
Description
技术领域
本发明涉及人源抗体的开发制备领域,具体来说涉及一种靶向CD19的人源抗体及其制备和应用。
背景技术
CD19蛋白广泛的表达在B淋巴细胞表面,存在于B细胞的发育分化的整个过程,是重要的B细胞表面标志蛋白,已有的临床前研究和临床研究均显示了CD19蛋白在B细胞恶性肿瘤免疫治疗中的潜在价值,包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤等。靶向CD19蛋白的治疗方案在临床上广泛应用于B细胞恶性肿瘤治疗,如单克隆抗体、双特异性抗体和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)。CD19蛋白在整个B细胞的发育和成熟过程中均高表达,直至B细胞分化为浆细胞时,表达量下调,其在成熟B细胞中的表达是未成熟细胞的3倍。CD19蛋白通过同时调节B细胞受体(B cell recertor,BCR)依赖和非依赖信号建立B细胞信号阈值,对B细胞的发育,增殖和分化起着重要的调控作用。目前临床上常将CD19蛋白作为诊断B淋巴细胞系肿瘤和鉴定B淋巴细胞的表面标志,大多数B细胞恶性肿瘤CD19蛋白的表达处在较高的水平。
以CD19蛋白为靶点设计的药物目前已有多种,如抗体-药物偶联物,通过二硫键将人源化的CD19 IgG抗体与天然抗肿瘤药物美登木素衍生物药物DM4连接,44例难治/复发性B细胞NHL患者通过静脉注射SAR3419,客观缓解率(Objective Response Rate,ORR)为33%,完全缓解率14%;第二种方案是Fc段修饰的人源化CD19抗体,通过抗体介导的细胞毒作用(ADCC)对肿瘤细胞进行杀伤,该方案在43例患者中客观缓解率(Objective ResponseRate,ORR)为26%,其中包含12%的完全缓解率(complete remission rate,CRR);第三种方案是制备有两种特异性抗原结合位点的人工双特异性抗体,可以分别识别T细胞和肿瘤细胞表面抗原,将T细胞与肿瘤细胞关联在一起,直接介导效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤,如由CD19和CD3两个单链抗体(scFV)结合组成,可特异性针对CD3和CD19抗原,II期临床研究20例B急淋微小残留病变(minimal residual disease,MRD)患者,客观缓解率(Objective Response Rate,ORR)为80%,33个月无复发生存率为61%;第四种方案是嵌合抗原受体T细胞方案,I期临床研究中81%的患者微小残留为阴性(MRD-),6个月总生存期(OS)超过78%。
发明内容
本发明的目的在于以CD19蛋白为靶点,以人源抗体基因噬菌体展示库为基础,淘选识别CD19蛋白的人源抗体序列,制备一种靶向CD19的人源抗体,应用于嵌合抗原受体、抗体偶联药物及双特异性抗体等领域,靶向杀伤B淋巴细胞恶性肿瘤。
为解决上述技术问题,本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
靶向CD19的人源抗体,其重链可变区序列信息分别为:SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4所示;其轻链可变区序列信息分别为:SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9所示;
其中:
所述SEQ 1重链可变区的HCDR1区序列为SEQ10所示、HCDR2区序列为SEQ11所示、HCDR3区序列为SEQ12所示;
所述SEQ2重链可变区的HCDR1区序列为SEQ13所示、HCDR2区序列为SEQ14所示、HCDR3区序列为SEQ15所示;
所述SEQ3重链可变区的HCDR1区序列为SEQ16所示、HCDR2区序列为SEQ17所示、HCDR3区序列为SEQ18所示;
所述SEQ4重链可变区的HCDR1区序列为SEQ19所示、HCDR2区序列为SEQ20所示、HCDR3区序列为SEQ21所示;
所述SEQ5轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ22所示、LCDR2区序列为SEQ23所示、LCDR3区序列为SEQ24所示;
所述SEQ6轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ25所示、LCDR2区序列为SEQ26所示、LCDR3区序列为SEQ27所示;
所述SEQ7轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ28所示、LCDR2区序列为SEQ29所示、LCDR3区序列为SEQ30所示;
所述SEQ8轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ31所示、LCDR2区序列为SEQ32所示、LCDR3区序列为SEQ33所示;
所述SEQ9轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ34所示、LCDR2区序列为SEQ35所示、LCDR3区序列为SEQ36所示。
优选的,所述单链抗体SEQ1-SEQ5、SEQ1-SEQ6、SEQ2-SEQ7、SEQ3-SEQ8和SEQ4-SEQ9的组合可以特异性的结合CD19蛋白,表现出不同的结合力。
优选的,所述单链抗体SEQ1-SEQ5、SEQ1-SEQ6和SEQ2-SEQ7的组合表现出最高的亲和力。
以CD19为靶点,以人源抗体基因噬菌体展示库为基础,利用纯化的单链抗体与表达CD19的CHO-CD19重组细胞株进行共孵育,进行流式细胞检测分析,淘选识别CD19的人源抗体序列,得到所述靶向CD19的人源抗体。
所述的靶向CD19的人源抗体的制备方法由以下步骤制备而成:
1)噬菌体展示库的建立:
使用Trizol将分离的PBMC充分裂解离心后,加入氯仿/Trizol裂解液混合,离心后,向上清中加入异丙醇充分混匀后再进行离心,加入乙醇洗涤,弃去上清分离沉淀,沉淀干燥后,采用RNase-free水进行溶解沉淀,提取到总mRNA样品;
2)cDNA制备:
将步骤1)中提取到的总mRNA样品进行PCR扩增,其反应体系为:Oligo dT Primer(50μM)、dNTP Mixture(10mM each)、总RNA样品和RNase-Free水,使mRNA样品变性后再进行反转录,其反应体系为:变性后的反应液、5×PrimeScript II Buffer、RNase Inhibitor(40U/μl)、PrimeScript II RTase(200U/μl)和RNase-Free水,得到cDNA样品,将cDNA样品置于冰上或-20℃长期保存;
3)PCR克隆扩增Vk或Vλ及VH:
将步骤2)中得到的cDNA样品模板分别准备重链、轻链的上下游引物组合,进行PCR扩增,其反应体系为:上游引物、下游引物、5×PrimeSTAR GXL Buffer、dNTP Mixture(2.5mM each)、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、cDNA样品模板和无菌水,得到PCR产物:轻链产物(Vk或Vλ)、重链产物(VH),取PCR产物,使用琼脂糖进行电泳分析,正确的条带大小为350bp左右,纯化PCR产物,并用NanoDrop测定浓度;
4)Overlap Extension PCR连接VK-VH或Vλ-VH:
将纯化的步骤3)中得到的PCR产物再次进行PCR扩增,其反应体系为:上游引物hRSC F、下游引物hRSC R、5×PrimeSTAR GXL Buffer、dNTP Mixture(2.5mM each)、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、纯化的轻链产物(Vk或Vλ)、纯化的重链链产物(VH)和无菌水,得到Overlap PCR产物,取PCR产物,使用琼脂糖进行电泳分析,正确的条带大小为700bp左右;
5)酶切Overlap PCR产物及pCanTab5F载体:
使用SfiI酶切pCanTab5F载体及步骤4)中得到的Overlap PCR纯化产物,其Overlap PCR纯化产物的酶切反应体系为:Overlap PCR纯化产物、SfiI、Buffer和无菌水;其pCanTab5F载体的酶切反应体系为:pCanTab5F、SfiI、Buffer和无菌水,得到的pCanTab5F(SfiI-digested)和Overlap PCR产物(SifiI-digested);使用琼脂糖凝胶纯化Overlap PCR产物(SfiI-digested);使用琼脂糖凝胶分离pCanTab5F载体片段,并分别测定回收产物的浓度;
6)酶切产物连接:
将步骤5)中得到的pCanTab5F(SfiI-digested)与Overlap PCR产物(SfiI-digested)进行连接,其反应体系为:pCanTab5F(SfiI-digested)、Overlap PCR产物(SfiI-digested)、10×T4 buffer、T4 ligase和无菌水;首先经过加热处理,使T4 ligase失活,然后加入醋酸钠和Glycogen混匀后,再加入酒精混匀,超低温的状态下静置过夜,然后离心去掉上清,在沉淀中加入酒精洗涤,空气中稍加干燥后,加入无菌水溶解DNA沉淀,得到连接产物;
7)电转化及phage rescue:
将步骤6)中得到的连接产物进行电转化,将电转杯、连接产物置于冰上解冻电转感受态,将DNA/感受态混合物分装转移到电转杯中,然后用预设的电转程序电击,每次电击结束后,向每个电转杯中立即加入2x YT-G培养基重悬菌体,电击结束后,收集菌液,向菌液中加入氨苄青霉素和辅助噬菌体M13KO7培养,离心后去掉上清,在沉淀中再加入2x YT-AK培养基重悬菌体,离心后将含有重组噬菌体的上清转移至一个新的无菌锥形瓶中,同时收集菌体沉淀,用质粒大抽试剂盒抽提其中的phagemid;向上清中加入PEG8000和NaCl,离心去掉上清,用TBS缓冲液重悬沉淀,得到重组噬菌体库;
8)淘选:
每孔包被抗原,加入BSA封闭缓冲液进行密封后,加入步骤7)中得到的重组噬菌体库,同时,在一个离心管中,加入ER2738菌的培养基及相应浓度的四环素摇菌培养,每种抗原准备一管;将孵育好重组噬菌体库的孔板从培养箱中取出,甩掉孔内的液体,每孔加入Tween20进行洗涤,最后每孔加入胰酶,密封之后,将消化下来的噬菌体加入到上面步骤准备的ER2738菌中,加入预热的培养基及相应浓度的四环素后,合并菌液转移至一个新的离心管中摇菌培养,向菌液中加入氨苄青霉素和辅助噬菌体M13KO7培养后离心去掉上清,用2x YT-AK培养基重悬菌体沉淀,加入氨苄青霉素和卡那霉素过夜培养,离心后将含有重组噬菌体的上清转移至一个新的无菌锥形瓶中,同时收集菌体沉淀,用质粒大抽试剂盒抽提其中的phagemid;向上清中加入PEG8000和NaCl震荡后静置离心,小心去掉上清后,用TBS缓冲液重悬沉淀,将重悬后的沉淀离心;将上清通过PES材质的滤膜过滤至一个新的离心管中后,重复以上淘选步骤3-4次,得到单克隆噬菌体抗体并获取单链抗体序列信息;
9)单链抗体的表达及纯化:
将步骤8)中得到的单克隆噬菌体抗体和PBS混匀,然后加入PEI混匀,得到DNA/PEI复合物,将DNA/PEI复合物转染至293F细胞株中,在培养箱中培养完成后,将含有转染试剂的培养基去掉,收集培养基上清进行离心,去除细胞碎片,然后将离心后的上清液通过Protein A的柱子进行重力沉降,使培养基上清中的单链抗体结合到Protein A上,然后使用洗脱液将单链抗体洗脱下来,使用BCA法进行定量并进行纯化处理;
10)单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力分析:
将步骤9)中得到的纯化的单链抗体加入从液氮中复苏的CHO-K1-CD19重组细胞株,使用PBS重悬,然后加入上述纯化的单链抗体孵育后洗涤,加入PE标记的Anti-humanIgG抗体孵育后洗涤,最后用PBS重悬细胞,得到靶向CD19的人源抗体,使用流式细胞仪分析人源化单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力。
使用未经人源化处理的鼠源单链抗体作为对照来检测人源化单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力。
所述的靶向CD19的人源抗体应用于嵌合抗原受体技术、构建单抗体偶联药物以ADCC或CDC作用机制对肿瘤细胞进行杀伤及其他的抗体结合构建成双特异性抗体。
本发明的有益效果在于:
本发明所筛选的靶向CD19的人源抗体序列,可以有效的与靶标蛋白CD19进行结合,并表现出不同的亲和力,该人源抗体可用于靶向CD19的多种不同应用,包括嵌合抗原受体技术、构建成为单抗以ADCC或CDC作用机制对肿瘤细胞进行杀伤、或者与其他的抗体结合构建成为双特异性抗体。
附图说明
图1-图5为流式细胞仪分析单链抗体序列与靶标蛋白的结合过程示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做进一步的详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式,但本发明的保护范围不限于下述实施例。
以CD19为靶点,以人源抗体基因噬菌体展示库为基础,利用纯化的单链抗体与表达CD19的CHO-CD19重组细胞株进行共孵育,进行流式细胞检测分析,淘选识别CD19的人源抗体序列,得到所述靶向CD19的人源抗体。
实施例:
如图1-图5所示,流式细胞仪分析单链抗体序列与靶标蛋白的结合过程,与对照组相比,克隆组能够向右偏移,表示能够与靶蛋白CD19结合。
所述的靶向CD19的人源抗体的制备方法由以下步骤制备而成:
1、噬菌体展示库的建立:
1.1使用Trizol将分离的PBMC充分裂解后,加入200uL氯仿/1mL Trizol裂解液,盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色;
1.2 12,000g、4℃离心15分钟,从离心机中小心取出离心管,吸取上清液转移至另一新的离心管中,向上清中加入500uL异丙醇/管,上下颠倒离心管充分混匀后,12,000g、4℃离心10分钟;
1.3小心弃去上清,加入1mL/管75%乙醇,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,7,500×g、4℃离心5分钟后小心弃去上清;
1.4打开离心管盖,室温干燥沉淀几分钟,沉淀干燥后,每管加入30uL的RNase-free水溶解沉淀。
2、cDNA制备:
2.1在PCR管中配制下列反应混合液:
2.2 65℃保温5min后,冰上迅速冷却;(注:本处理可使模板RNA变性,提高反转录效率)
2.3在上述Microtube管中配制下列反转录反应液,总量为160μL
2.4缓慢混匀后,置于42℃反转录1小时;
2.5然后70℃孵育15分钟;
2.6最后将cDNA样品置于冰上或-20℃长期保存,进行下游PCR时,每100uL PCR反应体系,使用1-2uL cDNA样品作为模板;
3、PCR克隆扩增Vk或Vλ及VH:
3.1引物准备:按照下表中的组合,分别准备重链、轻链的上下游引物组合;
3.2配置PCR反应体系【100μL体系/反应,Vk共配置9个反应】:
3.3 PCR反应程序如下:
3.4琼脂糖电泳分析:
取5-10uL PCR产物,使用2%的琼脂糖进行电泳分析,正确的条带大小为350bp左右。
3.5纯化PCR产物,并用NanoDrop测定浓度,至少需要2-4ug/链PCR产物。
4、Overlap Extension PCR连接VK-VH或Vλ-VH:
4.1配置PCR反应体系
4.2PCR反应程序如下:
4.3琼脂糖电泳分析:
取5-10uL PCR产物,使用2%的琼脂糖进行电泳分析,正确的条带大小为700bp左右;
5、酶切Overlap PCR产物及pCanTab5F载体:
使用SfiI酶切pCanTab5F载体及步骤4)中得到的Overlap PCR纯化产物,得到的pCanTab5F(SfiI-digested)和Overlap PCR产物(SfiI-digested);
PCR产物的酶切体系如下:
pCanTab5F载体的酶切体系如下:
置于50℃酶切5小时;
使用1%的琼脂糖凝胶纯化PCR产物;用0.6%的琼脂糖凝胶分离载体片段,并分别测定回收产物的浓度。
6、酶切产物连接:
Overlap PCR产物连接:
Control ligation 1:
Control ligation 2:
6.1 16℃过夜连接后,65℃加热处理15min使T4 ligase失活;
6.2加入0.1倍体积的3M醋酸钠(pH5.2-6)、5ug Glycogen,混匀后,再加入2倍体积的100%酒精,混匀后,-80℃放置2小时或过夜;
6.3 12000g、4℃离心15分钟后,去掉上清,加入70%的酒精后,轻轻上下颠倒数次,洗涤沉淀2次;
6.4 12000g、4℃离心15分钟后,去掉上清,空气中稍加干燥后,加入15uL无菌水溶解DNA沉淀;
7、电转化及phage rescue:
7.1将电转杯、连接产物置于冰上10分钟;同时在冰上解冻电转感受态500uL;
7.2将500uL感受态加入到200uL的连接产物中,将移液枪头用剪刀剪去一截,上下吹打一次后,将DNA/感受态混合物分装转移到电转杯中(50uL/0.2cm电转杯),避免气泡,置于冰上1分钟,然后用预设的电转程序电击(25μF,2.5kV at 200ohms、3.5ms);
7.3每次电击结束后,向每个电转杯中立即加入1mL 2x YT-G培养基重悬菌体,然后转移至一个50mL离心管中,电击结束后,共收集到约10mL菌液,按以下两步分别处理:
7.3.1制备甘油菌保种:取1mL菌液,37℃、250RPM培养1小时后,加入甘油至终浓度为20%,混匀后,保种于-80℃;
7.3.2向剩余的9mL菌液中加入6mL新鲜的室温2x YT-G培养基,37℃、250RPM培养1小时;
7.4向菌液中加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素,向菌液中加入6×1010pfu的辅助噬菌体M13KO7,37℃、250RPM培养1小时;
M13KO7体积=6×1010pfu/M13KO7滴度
7.5 2000xg室温或4℃离心10分钟,将上清完全去掉;
7.6用200mL预热至37℃的2x YT-AK培养基重悬菌体沉淀,37℃、250RPM过夜培养;
7.7 3000xg、4℃离心15分钟,将含有重组噬菌体的上清转移至一个新的无菌锥形瓶中,同时收集菌体沉淀,用质粒大抽试剂盒抽提其中的phagemid;向上清中加入PEG8000至终浓度为W/V=4%和NaCl至终浓度为W/V=3%,200RPM、37℃震荡10分钟后,将锥形瓶置于冰中静置30分钟;
7.8 15000xg、4℃离心15分钟,小心去掉上清后,用2mL 1%BSA的TBS缓冲液重悬沉淀;
8、淘选:
8.1每孔包被0.1-1ug抗原,每孔25uL;使用密封膜密封包被的孔,置于4℃过夜;
8.2甩干孔内的包被液,加入150uL 3%BSA进行封闭,密封后,置于37℃1小时;
8.3甩干孔内的封闭缓冲液,加入50uL/孔新鲜制备的重组噬菌体库,密封后,置于置于37℃2小时;
8.4同时,在一个15mL离心管中,加入2mL ER2738菌的培养基及相应浓度的四环素,250RPM、37℃摇菌培养,直至O.D600达到1.0;每种抗原准备一管;
8.5将孵育好重组噬菌体的孔板从培养箱中取出,甩掉孔内的液体,每孔加入150uL 0.5%的Tween20,室温静置5分钟后,甩掉所有的液体;重复洗涤5次;
8.6最后每孔加入50uL 10mg/mL的胰酶,密封之后,置于37℃、30分钟;用移液器吹打10次,将消化下来的噬菌体加入到上面步骤准备的ER2738菌中,室温静置15分钟;
8.7加入6mL预热的培养基及相应浓度的四环素后,将总共8mL菌液转移至一个新的50mL离心管中,250RPM、37℃摇菌培养1小时;
8.8向菌液中加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素、1mL的辅助噬菌体M13KO7(1012-1013pfu),37℃、250RPM培养1小时;
8.9 2000xg室温或4℃离心10分钟,将上清完全去掉;
8.10用200mL预热至37℃的2x YT-AK培养基重悬菌体沉淀,加入100ug/mL的氨苄青霉素、50ug/mL的卡那霉素、37℃、250RPM过夜培养;同时准备包被第二天淘选用的孔板;
8.11 3000xg、4℃离心15分钟,将含有重组噬菌体的上清转移至一个新的无菌锥形瓶中,同时收集菌体沉淀,用质粒大抽试剂盒抽提其中的phagemid;向上清中加入PEG8000至终浓度为W/V=4%和NaCl至终浓度为W/V=3%,200RPM、37℃震荡10分钟后,将锥形瓶置于冰中静置30分钟;
8.12 15000xg、4℃离心15分钟,小心去掉上清后,用2mL 1%BSA的TBS缓冲液重悬沉淀;
8.13将重悬后的沉淀转入2mL离心管中,用1mL移液器吹打混匀后,12000xg、4℃离心5分钟;将上清通过PES材质的0.45um的滤膜过滤至一个新的离心管中后,重复以上淘选步骤3-4次;
8.14将最终获得的单克隆噬菌体进行测序,获取单链抗体序列信息;
9、单链抗体的表达及纯化:
从液氮中复苏293F细胞株,连续培养2周左右时间,使细胞处于对数生长期。将上述获得的单链抗体表达载体分别转染至293F细胞株中,使其分泌表达单链抗体。转染过程如下:从冰箱中取出100μM PEI及单链抗体表达质粒,室温解冻后,用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液,温热至室温。制备PEI/DNA复合物:取2mL PBS至6孔板的一个孔,分别加入20ug单链抗体表达质粒,移液枪上下吹打充分混匀后,加入30uL 100μM PEI,立即用移液器上下吹打混匀,室温下静置10分钟。转染:将上述DNA/PEI复合物加入到细胞中。将细胞置于37℃、5%CO2培养箱,培养6小时后,将含有转染试剂的培养基去掉,更换为新鲜的完全培养基连续培养4天,收集培养基上清;
将收获的培养基上清进行离心,1200g 4℃离心10分钟,去除细胞碎片,然后将离心后的上清液通过Protein A的柱子进行重力沉降,使培养基上清中的单链抗体结合到Protein A上,然后使用洗脱液将单链抗体洗脱下来。使用BCA法进行定量;
10、单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力分析:
从液氮中复苏CHO-K1-CD19重组细胞株连续培养2周左右时间,使细胞处于对数生长期。取1×106个细胞,使用100uL PBS重悬,然后加入1ug上述纯化的单链抗体,室温孵育30分钟后,加入1mL PBS洗涤细胞3次,然后用100uL PBS重悬细胞,加入5uL PE标记的Anti-human IgG抗体,室温避光孵育30分钟后,加入1mL PBS洗涤三次,最后用500uL PBS重悬细胞,使用流式细胞仪分析人源化单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力。
使用未经人源化处理的鼠源单链抗体作为对照来检测人源化单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力。
靶向CD19的人源抗体,其重链可变区序列信息分别为:SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4所示;其轻链可变区序列信息分别为:SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9所示。
优选的,所述单链抗体SEQ1-SEQ5、SEQ1-SEQ6、SEQ2-SEQ7、SEQ3-SEQ8和SEQ4-SEQ9的组合可以特异性的结合CD19蛋白,表现出不同的结合力。
优选的,所述单链抗体SEQ1-SEQ5、SEQ1-SEQ6和SEQ2-SEQ7的组合表现出最高的亲和力。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式,而且本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南泰和医药科技有限公司
<120> 靶向CD19的人源抗体及其制备和应用
<160> 36
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> SEQ1
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSGWGNWKEFDYWGQGTLVTVSS
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> SEQ 2
QVQLQQWGAGLVKPSETLSLTCAVYGGSFSIYYWTWIRQSPGKGLEWIGEINQSGDTKYNPSLTGRVTISIDTSKTQFSLMLTSVTAADTAVYYCARYCGGGGCHPYYFDSWGQGTLLTVSS
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> SEQ 3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGDCTNGVCYTKAVNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ 4
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLSCGVYGGFSNVYYWSWLRQPPGKGLEWIGDINHGGEANYSPSLKSRASISVDRAKSQFSLKLSSVTAADTATYYCAMNLGYTTNWYGSDSWGQGTVVTVSS
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> SEQ5
ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPRTFGQGTKVEIK
<210> 6
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> SEQ6
ELMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSGGSIVNDYVQWYQERPGTSPTALIFQNDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEGDYYCQSYGGSTVVFGGGTKLTVLG
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> SEQ7
ELALTQPPSVSGSPGQSITISCTGTNSDVGKYNRVSWYQHHPGKAPKLIIYEDTERPSGVSNRLSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSFDSSLSGYVFGTGTKLTVLG
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> SEQ8
ELVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPRTFGQGTKLEIK
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ9
ELALTQPPSVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLVFGGGTKVTVLG
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ10
GYTFTGY
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ11
NPNSGG
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ12
SGWGNWKEFDY
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ13
GGSFIY
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ14
NQSGD
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ15
YCGGGGCHPYYFDS
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ16
GYTFTSY
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ17
SAYNGN
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ18
GDCTNGVCYTKAVNYYYGMDV
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ19
GGFSNVY
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ20
NHGGE
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ21
NLGYTTNWYGSDS
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ22
RASQSISSYLN
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ23
AASSLQS
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ24
QQSYSTPPRT
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ25
TRSGGSIVNDYVQ
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ26
QNDQRPS
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ27
QSYGGSTVV
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ28
TGTNSDVGKYNRVS
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ29
EDTERPS
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ30
QSFDSSLSGYV
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ31
RASQSISSYLN
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ32
AASSLQS
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ33
QQSYSTPPRT
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ34
TGTSSDVGGYNYVS
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ35
DVSKRPS
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>SEQ36
SSYTSSSTLV
Claims (7)
1.靶向CD19的人源抗体,其特征在于:
所述靶向CD19的人源抗体的重链可变区序列信息分别为:SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4所示;所述靶向CD19的人源抗体的轻链可变区序列信息分别为:SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9所示;
其中:
所述SEQ1重链可变区的HCDR1区序列为SEQ10所示、HCDR2区序列为SEQ11所示、HCDR3区序列为SEQ12所示;
所述SEQ2重链可变区的HCDR1区序列为SEQ13所示、HCDR2区序列为SEQ14所示、HCDR3区序列为SEQ15所示;
所述SEQ3重链可变区的HCDR1区序列为SEQ16所示、HCDR2区序列为SEQ17所示、HCDR3区序列为SEQ18所示;
所述SEQ4重链可变区的HCDR1区序列为SEQ19所示、HCDR2区序列为SEQ20所示、HCDR3区序列为SEQ21所示;
所述SEQ5轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ22所示、LCDR2区序列为SEQ23所示、LCDR3区序列为SEQ24所示;
所述SEQ6轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ25所示、LCDR2区序列为SEQ26所示、LCDR3区序列为SEQ27所示;
所述SEQ7轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ28所示、LCDR2区序列为SEQ29所示、LCDR3区序列为SEQ30所示;
所述SEQ8轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ31所示、LCDR2区序列为SEQ32所示、LCDR3区序列为SEQ33所示;
所述SEQ9轻链可变区的LCDR1区序列为SEQ34所示、LCDR2区序列为SEQ35所示、LCDR3区序列为SEQ36所示。
2.根据权利要求1所述的靶向CD19的人源抗体,其特征在于:
所述单链抗体SEQ1-SEQ5、SEQ1-SEQ6、SEQ2-SEQ7、SEQ3-SEQ8和SEQ4-SEQ9的组合可以特异性的结合CD19蛋白,表现出不同的结合力。
3.根据权利要求2所述的靶向CD19的人源抗体,其特征在于:
所述单链抗体SEQ1-SEQ5、SEQ1-SEQ6和SEQ2-SEQ7的组合表现出最高的亲和力。
4.根据权利要求1所述的靶向CD19的人源抗体的制备方法,其特征在于:
以CD19为靶点,以人源抗体基因噬菌体展示库为基础,利用纯化的单链抗体与表达CD19的CHO-CD19重组细胞株进行共孵育,进行流式细胞检测分析,淘选识别CD19的人源抗体序列,得到所述靶向CD19的人源抗体。
5.根据权利要求4所述的靶向CD19的人源抗体的制备方法,其特征在于:
由以下步骤制备而成:
1)噬菌体展示库的建立:
使用Trizol将分离的PBMC充分裂解离心后,分离沉淀,采用RNase-free水进行溶解沉淀,提取到总mRNA样品;
2)cDNA制备:
将步骤1)中提取到的总mRNA样品进行PCR扩增,再进行反转录,得到cDNA样品;
3)PCR克隆扩增Vk或Vλ及VH:
将步骤2)中得到的cDNA样品模板分别准备重链、轻链的上下游引物组合,进行PCR扩增,得到PCR产物:轻链产物(Vk或Vλ)、重链产物(VH);
4)Overlap Extension PCR连接VK-VH或Vλ-VH:
将纯化的步骤3)中得到的PCR产物再次进行PCR扩增,得到Overlap PCR产物;
5)酶切Overlap PCR产物及pCanTab5F载体:
使用SfiI酶切pCanTab5F载体及步骤4)中得到的Overlap PCR纯化产物,得到的pCanTab5F(SfiI-digested)和Overlap PCR产物(SfiI-digested);
6)酶切产物连接:
将步骤5)中得到的pCanTab5F(SfiI-digested)与Overlap PCR产物(SfiI-digested)进行连接,得到连接产物;
7)电转化及phage rescue:
将步骤6)中得到的连接产物进行电转化,在电转化产物中加入培养基重悬菌体,得到菌液,然后在菌液中加入辅助噬菌体M13KO7进行噬菌体重组,抽提菌体沉淀中的phagemid,得到重组噬菌体库;
8)淘选:
将步骤7)中得到的重组噬菌体库加入ER2738菌包被抗原进行孵育后,将得到的菌液中加入辅助噬菌体M13KO7进行沉淀重组,抽提菌体沉淀中的phagemid,通过淘选得到单克隆噬菌体抗体并获取单链抗体序列信息;
9)单链抗体的表达及纯化:
将步骤8)中得到的单克隆噬菌体抗体分别转染至293F细胞株中,使其分泌表达单链抗体并进行纯化处理;
10)单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力分析:
将步骤9)中得到的纯化的单链抗体加入CHO-K1-CD19重组细胞株进行共孵育,得到靶向CD19的人源抗体,使用流式细胞仪分析人源化单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力。
6.根据权利要求4所述的靶向CD19的人源抗体的制备方法,其特征在于:
使用未经人源化处理的鼠源单链抗体作为对照来检测人源化单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力。
7.根据权利要求1所述的靶向CD19的人源抗体的应用,其特征在于:
所述的靶向CD19的人源抗体应用于嵌合抗原受体技术、构建单抗体偶联药物以ADCC或CDC作用机制对肿瘤细胞进行杀伤及其他的抗体结合构建成双特异性抗体。
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