CN102277332A - 一种抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒免疫学技术领域，具体涉及抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法及制备的抗体的用途，属于口蹄疫防控领域。本发明的可特异性分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8其微生物保藏号是：CCTCC No:C201049。由该杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株6B8产生单抗亚型为IgG1。本发明的杂交瘤细胞系可在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。本发明的单克隆抗体可在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。

Description

一种抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及用途

技术领域

本发明涉及病毒免疫学技术领域，具体涉及抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法及制备的抗体的用途，属于口蹄疫防控领域。 

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种严重危害偶蹄动物的烈性传染病。由于该病可引起幼畜死亡、动物生产性能下降、畜产品质量和数量降低，加之传播迅速，一经发生即给发病国家和地区造成巨大的经济损失，沉重打击对外贸易，因而该病曾一度被称为“政治经济性疾病”。 

作为一种世界范围内的重大动物疫病，口蹄疫一直是世界各国口岸检疫、防控监测的重要目标。目前，对于口蹄疫的检测诊断方法主要包括经典的病毒分离、PCR扩增病毒核酸和血清学检测，但是因为前两种方法需要动用病毒，因而需要配备相应级别的实验室，同时还存在检测周期长的缺点。血清学方法因为回避了上述问题而获得了极大的发展。在各类血清学检测方法中，抗体作为其中的核心试剂，直接决定着检测方法的特异性和灵敏度。目前，虽然包括噬菌体展示、单链抗体等技术提供的抗体类型比以往更加丰富多样，但是口蹄疫检测中所采用的抗体仍以多克隆抗体和单克隆抗体为主，二者常被单独或结合使用。鉴于实验动物的个体差异，难于保证不同批次多克隆抗体水平的完全均一，单克隆抗体正凭借其特异、均匀和可无限供应的优势，被越来越多的研究者选用。自口蹄疫出现至今，有关单克隆抗体的研究亦时有报道，但多属零散且缺乏系统性。这主要是因为单克隆抗体尽管具有上述诸多优点，但同时它也存在制备周期长、结果难以预知的缺点。此外，口蹄疫病毒的抗原结构极其复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原结构存在很大差异。这些都限制了口蹄疫单克隆抗体的研制。基于上述情况，积极开展口蹄疫完整的单克隆抗体库建设，不管对于口蹄疫的理论研究还是口蹄疫的现实防控都具有积极而重要的意义。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一株可特异性分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系；本发明的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞系分泌的抗 口疫病毒的单克隆抗体；本发明的目的之三是将上述单克隆抗体用于诊断、预防和研究口蹄疫。 

本发明的一株能分泌抗O型口蹄疫病毒的血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8，其杂交瘤细胞株已于2010年5月11日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其微生物保藏号是：CCTCC NO.C201049。 

本发明的一种抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201049的杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株6B8产生，该抗体亚型为IgG1。 

本发明的杂交瘤细胞系可在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。 

本发明的单克隆抗体在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。 

现有技术中口蹄疫单克隆抗体的制备多采用完整病毒或人工表达的病毒某一片段为免疫抗原，再采用病毒筛选的方法来制备，由此带来的后果就是获得的单克隆抗体难于直接确定其识别的抗原表位，必须经过一系列的后期鉴定方可确知，这无疑增加了单克隆抗体的工作量和制备周期。近些年，随着口蹄疫病毒抗原位点的一一揭示，人们对于口蹄疫病毒中诱发免疫保护的关键位点越来越明确。同时，伴随着肽合成技术的发展，研究者已经可以按照自己的意愿合成目标蛋白肽段。综合上述种种情况，本发明设计了以蛋白短肽为免疫原，合成肽、载体和病毒三者同时筛选的单克隆抗体制备程序。该设计的优势在于：①以蛋白短肽为免疫抗原，不需要进行病毒培养、纯化、标定、蛋白表达等以病毒和表达产物做抗原时带来的一系列实验操作，从而大大节省前期抗原准备时间；②合成肽、载体和病毒三者同步筛选，只有同时与合成肽和病毒结合而又不与载体结合的杂交瘤细胞才被筛选出来，既排除了误筛与载体结合的杂交瘤细胞，又保证了与病毒具有结合力的杂交瘤细胞的获得；③以蛋白短肽为免疫抗原，蛋白序列可以预先设定，间接限定了制备抗体的识别位点，进而省略了抗原表位的鉴定。本发明的口蹄疫单克隆抗体的制备周期缩短、制备流程简化，从而大大便利了口蹄疫单克隆抗体的研制。 

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：首先，对口蹄疫病毒VP1序列分析，选定用作免疫抗原的片段，通过肽合成技术人工合成目标片段，为增加其免疫原性，在其末端连接载体蛋白KLH；为充分展示抗原位点，在远离抗原区域的一侧进行载体连接；为获得良好连接效果，在合成肽载体连接一端引入一个半胱氨酸。其次，在制定免疫程序时，本发明采用小剂量(20ug/次/小鼠)免疫策略，以提高特异性强、效价高的杂交瘤的获得率；再次，采用合成肽、 载体蛋白、病毒同步筛选方案，有力确保筛选的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与病毒的结合力。最后，在抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体制备中，本发明主要采用体内诱生法的活体采集法，即待小鼠腹水产生后在保证其存活状态下采集，然后继续培养至腹水产生后再次收集如此反复直至不再有腹水产生或者小鼠死亡。该方案既保证了最大限度的腹水收率，又获得了更高的腹水效价。 

具体实施方式

根据本发明的目的和内容，实施例分成三部分完成。实施例一：分泌抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8的建立；实施例二：抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体(以下命名为mab-6B8)的制备及其特性分析；实施例三：抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8的用途。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 

实施例一分泌抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8的建立 

(一)抗原制备 

通过文献报道和生物学软件对不同血清型口蹄疫病毒基因组VP1序列分析，选择该片段上O型口蹄疫特异、线性、中和性抗原位点的关键区段，合成一条包含28个氨基酸的短肽SSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPC-KLH(SEQ ID NO：1)，为提高短肽的免疫原性，在其末端连接载体血蓝蛋白(KLH，购自Sigma公司)。为保证短肽的良好结构，充分暴露其携带的抗原位点，在载体与短肽连接时在二者之间引入一个半胱氨酸。经质谱和液相色谱检测，上述所得的肽合成物获得93％以上的纯度，适于用作免疫抗原。 

1)动物免疫 

取6-8周龄SPF级BALB/c小鼠4只，免疫前一天眼底采血，分离血清用作阴性对照。首次免疫将口蹄疫合成肽的KLH连接物用灭菌PBS溶解，与福氏完全佐剂(购自Sigma公司)等体积混合皮下多点注射小鼠，每只小鼠20ug，即300ul/只。间隔两周后，等量抗原与福氏不完全佐剂(购自Sigma公司)等体积混合腹腔注射进行第二次免疫。两周后同法进行第三次免疫，一周后小鼠尾静脉采血测抗体效价。选取抗体效价最高者于融合前三天，以20ug抗原剂量不加佐剂腹腔注射加强免疫。 

2)细胞融合 

(1)骨髓瘤细胞的准备B细胞融合技术中的骨髓瘤细胞均来自于本动物。鼠源骨髓瘤细胞主要有X-63、NS-1和SP2/0三种，又以SP2/0最为常用，本发明即选用该细胞作为单克隆抗体制备的骨髓瘤细胞。以含10％进口优级胎牛血清(PAA，购自西班牙Nalgene公司)的1640培养基(Nissui，购自日本日水制药株式会社)于融合前两周复苏SP2/0细胞，并调整状态使其处于对数生长期，于融合前36-48小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，并提高其培养基的血清浓度至15％。融合当天，先用1640基础培养基将骨髓瘤细胞洗涤两次，然后用弯头滴管将细胞从瓶壁上轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。1000r/min离心10分钟，弃上清。细胞沉淀重悬于30ml 1640不完全培养基，混匀，取少量骨髓瘤细胞悬液加入0.4％台盼兰染色计数后备用。计算公式如下：每毫升细胞数＝4个大方格细胞数×10⁵/4；或每毫升细胞数＝5个中方格细胞数×10⁶/2。 

(2)脾淋巴细胞的准备将免疫好的BALB/c小鼠，摘眼球采血后(用于制备阳性血清)脱臼处死，置75％酒精中浸泡消毒10分钟，于超净台内无菌依次打开腹部皮肤、腹膜，分离脾脏，去除粘连的组织和脂肪后，经1640不完全培养基洗涤后，将脾脏移入200目铜网中。用灭菌注射器内芯轻轻挤压脾脏释放脾细胞，加入不完全培养基洗涤收集细胞悬液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清，将细胞重悬于10ml不完全培养基并混匀。取少量上述脾细胞悬液，加台盼兰染色计数后备用。 

(3)饲养细胞的制备在细胞融合早期，为满足新生杂交瘤细胞对养分及细胞密度的要求，同时清除培养过程中大量死亡的骨髓瘤细胞和脾细胞，常常需要在融合细胞板中加入饲养细胞。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞，小鼠腹腔巨噬细胞因来源方便且制备简单而使用最为广泛。本发明选用小鼠腹腔巨噬细胞作为实验的饲养细胞，其制备方法如下：于细胞融合前一天，按上述脾细胞制备方法采血、处死、消毒小鼠后，无菌剥离小鼠腹部皮肤，暴露腹膜，经酒精棉球消毒后，用注射器将10ml不完全培养基沿腹膜内壁注入腹腔(进针时避免穿入肠管，同时避免脂肪阻塞针头)。一手维持注射器针头留置腹腔内，另一手轻轻按摩小鼠腹部，随后将注入的培养基从小鼠腹腔回吸入注射器。1000r/min离心10分钟，弃上清。细胞沉淀重悬于5ml HAT(购自Sigma公司)培养基，计数，调整细胞浓度为2×10⁵/ml，按96孔培养板每孔2×10⁴个细胞的数量加入饲养细胞，置37℃、5％CO₂培养箱中培养， 备用。 

(4)细胞融合将上述方法准备的脾细胞和骨髓瘤细胞悬液，按5∶1的比例混合于融合管内，1000r/min离心10分钟，尽量吸净上清。轻击融合管底，使细胞沉淀松散并混合均匀。吸取37℃预热的50％PEG1500(PH 8.0，购自Sigma公司)1ml于1分钟内缓慢加入融合管内，边加边轻轻搅拌，静置1分钟后，按由慢到快、由少到多的原则向融合管内加入20-30ml 37℃预热的不完全培养基终止反应，37℃静置10分钟。800r/min离心5分钟，弃上清，加入15％血清的HAT培养基，轻轻重悬细胞，按每孔0.1ml量接种于事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板，置37℃，5％CO₂培养箱培养。融合第5天用HAT培养基进行半换液，7-10天用HT(购自Sigma公司)培养基进行全换液，14天后用普通完全培养基培养。待细胞克隆长至孔底面积的1/4-1/3时取细胞上清检测。 

(二)杂交瘤细胞的筛选 

对于杂交瘤细胞株的筛选有免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、血凝试验等等，据实验设计本发明选用酶联免疫吸附试验对杂交瘤细胞进行筛选。实验中采用口蹄疫病毒、合成肽连接物、载体蛋白三者同时筛查，即一孔杂交瘤培养上清分成三份分别加入上述三种物质包被的ELISA板孔中进行检测。具体方法为：首先通过方阵滴定的方法确定口蹄疫病毒、合成肽连接物的最佳包被浓度，即用包被液(碳酸钠缓冲液，PH9.5)分别将口蹄疫病毒和合成肽连接物进行系列稀释后，按50ul/孔加入ELISA板，轻轻震荡使其充分覆盖孔底，4℃过夜包被，弃掉孔内液体，PBST洗涤三次，每次3min；每孔加入200ul5％脱脂乳和3％BSA配成的封闭液，4℃过夜封闭。弃掉封闭液，同上法洗涤三次后，加入系列稀释的阳性血清，50ul/孔，37℃湿盒孵育1h。同法洗涤，加入HRP标记羊抗鼠IgG(购自Rockland公司)，37℃湿盒中反应1h，洗涤，加入OPD-H₂O₂底物溶液，37℃避光孵育15min，用2M H₂SO₄终止反应，酶标仪OD₄₉₀nm读值。本研究最终确定口蹄疫病毒的最佳包被浓度是1∶500倍，合成肽连接物的最佳包被浓度为2.5ug/ml。为保证试验的严谨性载体KLH也采用2.5ug/ml的剂量包被ELISA板。只有当检测细胞上清仅与病毒和肽结合物反应而不与载体反应且检测孔上清的OD值为阴性对照(SP2/0上清和免疫前采小鼠血清)的2.1倍时检测孔才被判定为阳性孔。 

通过连续4次亚克隆和ELISA筛选，最终获得了一株杂交瘤细胞系，被命名为 6B8，并于2010年5月25日在中国典型培养物保藏中心进行保藏。 

实施例二  抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8的制备及其特性分析 

(一)抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8的制备 

目前单克隆抗体的制备方法主要有体内诱产法和体外培养法。由于前法操作简便、产量高，故本发明采用体内诱生法来生产单克隆抗体。具体操作如下：选用SPF级8-10周龄BALB/c小鼠，腹腔接种灭菌降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3ml。7-10天后向小鼠腹腔接种用PBS或无血清培养基悬浮的处于对数生长期的杂交瘤细胞6B8，每只小鼠5×10⁵个/0.3ml。一周后，每天观察小鼠腹水产生情况，待其腹部明显膨大时，用灭菌12号针头进行活体采集腹水，1-2天后待其腹部再次产生腹水时如上法收集直至不再有腹水产生。用此法制备单克隆抗体，平均每只小鼠可收腹水6-7ml，最多者可收15ml。将采集的腹水合并后，2000r/min离心5分钟，除去细胞和油脂成分，收集中间无色或淡黄色澄清层，经饱和硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化，测定效价，分装，-70℃冻存备用。这样获得了由杂交瘤细胞系6B8分泌的抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8。 

(二)抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8的特性鉴定 

(1)亚类鉴定 

鉴定单克隆抗体类和亚类的方法主要有免疫扩散、ELISA和试纸条法三种，本发明采用Sigma公司ELISA型亚类鉴定试剂盒进行亚类鉴定，具体操作按说明书进行。经鉴定，本发明制备的单克隆抗体mab-6B8亚类为IgG1，结果见表1。 

(2)效价测定 

本发明采用间接ELISA方法测定抗体效价。操作程序如下：首先用预实验确定的O型病毒包被浓度1∶500包被ELISA板，50ul/孔，4℃过夜包被。洗涤，用5％脱脂乳和3％BSA构成的封闭液4℃过夜封闭，200ul/。洗涤，加入梯度稀释的腹水和细胞培养上清，50ul/孔，每个稀释度作两个重复，37℃温浴1h；洗涤，加入1∶1000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，50ul/孔，37℃作用1h；洗涤，加入OPD底物溶液，50ul/孔，避光作用15min，加入2M H₂SO₄终止反应，在酶标仪OD₄₉₀nm波长下读取结果。当检测腹水时，以SP2/0腹水为阴性对照，当检测细胞培养上清时，以SP2/0培养上清为阴性对照，当检测孔OD值大于阴性 对照的2.1倍判为阳性，结果显示(见表1)本发明获得的单克隆抗体mab-6B8效价高，适于进行口蹄疫诊断试剂开发和研究使用。 

表1  单克隆抗体mab-6B8亚类鉴定和效价测定结果 

(3)特异性检测 

本发明采用间接ELISA方法检测所制备的抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体mab-6B8的特异性，具体方法如下：首先将口蹄疫A、O、C、Asia 1四个血清型和猪水泡病(SVDV)的细胞毒通过分光光度计测定其浓度，然后以预实验确定的O型口蹄疫的最佳包被量将口蹄疫的上述四个血清型病毒和猪水泡病病毒包被酶标板，按前述ELISA程序进行特异性检测，结果显示(见表2)本发明制备的单克隆抗体mab-6B8专一性识别O型口蹄疫病毒，与A、C、Asia1和SVDV无交叉反应，具有良好的特异性。 

表2  单克隆抗体mab-6B8特异性鉴定结果 

注：NC为阴性对照SP2/0腹水 

(4)中和试验 

病毒滴度(TCID50)测定：将病毒从10^-1开始进行10倍梯度稀释直至10^-11接种于96孔细胞培养板中的单层BHK-21细胞，每个稀释度四个重复，置37℃、5％CO₂培养箱培养2-3天，记录细胞病变，按Karber法计算TCID50为10^-6.3。 

中和试验：为消除热源等物质对实验的影响，试验前将血清、腹水和细胞培养上清经56℃灭活30min。将灭活的腹水或细胞培养上清用无血清培养基做1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256等系列稀释，按50ul/孔，每个稀释度两个重复，加入96孔细胞培养板。用无血清培养基将O型口蹄疫病毒稀释至200TCID50，按50ul/孔量加入各稀释孔内(即每孔终浓度100TCID50)，置37℃、5％CO₂培养箱作用1h。将长至单层的BHK细胞用胰酶消化使其分散成单 个细胞，计数，调整浓度至10⁶个细胞/ml，50ul/孔加入96孔细胞培养板，置37℃、5％CO₂培养箱培养至48-72h，观察细胞病变，按Karber法计算中和指数。每次实验均设细胞对照、血清对照、病毒对照和腹水毒性对照。只有当所有对照均成立时，才可进行判定，50％以上细胞保护者判为阳性。实验结果显示本发明制备的单克隆抗体mab-6B8对同种病毒具有中和活性，中和指数1.81，中和滴度1∶64(稀释度大于等于1∶45判为阳性)。 

实施例三：抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8的用途 

由杂交瘤细胞系6B8产生的抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8具有特异性强、亲和强和效价高的特点，所以，mab-6B8具有如下的应用前景： 

(1)用于口蹄疫病毒的检查，诊断口蹄疫。mab-6B8通过与其它的单克隆抗体组合，可以形成单克隆抗体双夹心ELISA诊断试剂盒。Mab-6B8即可以作为捕获抗体，用来包被ELISA板，也可以通过与辣根过氧化物酶HRP偶联后，作为检测抗体。此外，mab-6B8可以单独使用，用于免疫组织化学检测，也可以用于免疫印迹分析等这些免疫学的诊断方法。 

(2)用于口蹄疫病毒的研究领域。单克隆抗体是研究蛋白质结构与功能的有力工具，是研究目的蛋白与其它蛋白，例如受体等，相互作用的工具。Mab-6B8可以用于研究O型口蹄疫病毒的结构以及与该病毒有关的受体等各种相关蛋白的存在。 

(3)可以用于防控口蹄疫疫病。Mab-6B8具有中和O型口蹄疫病毒的作用，所以，当O型口蹄疫暴发时，Mab-6B8可以作为应急免疫蛋白对邻近疫区的猪、牛、羊等偶蹄目动物进行应急免疫，保护这些易感动物免于感染口蹄疫病毒。 

总之，抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mab-6B8在口蹄疫的诊断、基础研究和防控方面具有广泛的用途，应用前景良好。 

Claims (4)

1.一株能分泌抗O型口蹄疫病毒的血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系6B8，其特征是微生物保藏号是：CCTCC NO.C201049。

2.一种抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体，其特征在于该抗体由保藏号为CCTCC NO：C201049的杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株6B8产生，该抗体亚型为IgG1。

3.由权利要求1所述杂交瘤细胞系在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。

4.由权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断O型口蹄疫的试剂方面的应用。