CN111172118A - 抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111172118A
CN111172118A CN202010220553.3A CN202010220553A CN111172118A CN 111172118 A CN111172118 A CN 111172118A CN 202010220553 A CN202010220553 A CN 202010220553A CN 111172118 A CN111172118 A CN 111172118A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouth disease
cells
monoclonal antibody
foot
type foot
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010220553.3A
Other languages
English (en)
Inventor
米晓云
魏玉荣
马文戈
黄炯
王延
汪萍
魏婕
苗书魁
夏俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinjiang Academy Of Animal Sciences Veterinary Research Institute
Original Assignee
Xinjiang Academy Of Animal Sciences Veterinary Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinjiang Academy Of Animal Sciences Veterinary Research Institute filed Critical Xinjiang Academy Of Animal Sciences Veterinary Research Institute
Priority to CN202010220553.3A priority Critical patent/CN111172118A/zh
Publication of CN111172118A publication Critical patent/CN111172118A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1009—Picornaviridae, e.g. hepatitis A virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及一种抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用。该抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株XJ14‑2F7，已于2017年09月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201790。本申请对A型口蹄疫全病毒抗原进行处理，免疫Balb/c小鼠，获得分泌抗A型口蹄疫全病毒抗原的脾淋巴细胞，将其与SP2/0细胞融合获得抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株XJ14‑2F7，从而获得抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体，该抗体作为诊断试剂，可灵敏的检测出A型口蹄疫全病毒抗原的感染。从而区分疫苗感染和自然感染，为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。

Description

抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗A型口蹄疫抗 原单克隆抗体及其应用
技术领域
本申请涉及一种抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体及其应用。
背景技术
口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是国际兽疫局规定的A类动物传染病，并被列为18种A类传染病之首，世界卫生组织（OIE）列为通报疾病（List disease），我国列为1类动物传染病。它传播途径多、速度快，是传染病中危害最大的能造成跨国界爆发流行的恶性传染病之一，严重威胁畜牧业的发展、畜产品的进出口贸易、影响人民群众的生产生活及社会经济、政治的稳定发展，故又被称为“政治经济病”。FMD发现至今已有上百年的历史，迄今尚未在全球范围内得到控制和根除。口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）共有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亚洲1型）7种血清型，且极易发生突变，现已知80 多个亚型，目前我国流行的口蹄疫主要为O、A两个血清型。由于该病毒各型之间无交叉保护反应，且同型内的不同亚型的抗原性也存在差别，使得口蹄疫的诊断和控制存在很大的难度。获得一种快速准确地鉴别FMD各种血清型的检测试剂可有效提高FMD的诊断效率，为FMD的控制提供有力依据。
自1975年英国剑桥大学Kohler 和 Milstein两位研究者建立杂交瘤单克隆抗体(单抗)技术以来，1982 年英国普布里斯动物病毒研究所K.c.McCullough等人首次研究出抗口蹄疫病毒O型单抗细胞株，1985 年中国农科院兰州兽医研究所首次在国内建立了分泌O型口蹄疫病毒单抗杂交瘤细胞株，1987年建立了口蹄疫A型单抗细胞株，之后新疆兽医研究所伊米提等、东北农业大学孙静等也先后制备出口蹄疫A型单抗细胞株。随后各种抗FMD单克隆抗体细胞株的获得不仅为动物检疫部门提供了一种快速、方便、灵敏的检疫方法，也为流行病学调查、新疫苗研制和基础理论研究开辟了一条新的途径。
鉴于现阶段口蹄疫疫苗在全国范围内进行免疫的同时，仍有部分地区存在口蹄疫疫病的的局部发生，为区分所爆发的疫病是新的野毒感染还是疫苗未彻底灭火而感染，用疫苗度制备单克隆抗体从而制备免疫鉴别试剂盒是这类问题的突破口。本发明所公布的XJ14-2F7单克隆抗体作为诊断试剂，通过抗原检测可灵敏的鉴别检测出是否为野毒感染。为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
发明内容
本申请的目的在于提出一种抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体及其应用。
本申请的目的是这样实现的：本申请的抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株XJ14-2F7，已于2017年09月25日保藏于中国典型培养物保藏中心 (China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201790。
抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备抗A型口蹄疫全病毒检测试剂盒中的应用，为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
本申请还提供了一种抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体，该抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体即由上述的抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得的。
抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体在检测A型口蹄疫全病毒中的应用。
一种A型口蹄疫检测试剂盒，包含有所述的抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体。
一种抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备A型口蹄疫全病毒抗原；
步骤二、A型口蹄疫全病毒抗原免疫Balb/c小鼠；
步骤三、制备SP2/0细胞；
步骤四、制备饲养细胞；
步骤五、从小鼠身上制备待融合的脾淋巴细胞；
步骤六、将1.0×108个脾淋巴细胞和2.0×107个骨髓瘤细胞(购自上海细胞库)进行细胞融合；
步骤七、融合细胞的选择培养：脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中存活下来，并不断增殖；
步骤八、阳性杂交瘤细胞株的筛选：待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，换液3-4d后即可取细胞培养上清液100µL，不作稀释用间接ELISA（酶联免疫吸附试验）实验进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照；免疫后取脾脏细胞进行细胞融合的小鼠血清做阳性对照；检测为阳性的细胞可进行扩大培养，同时选择强阳性的孔进行亚克隆，并注意随时冻存保种；
步骤九、采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆及扩增，最终获得杂交瘤细胞株XJ14-2F7；
步骤十、选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞进行阳性杂交瘤细胞的冻存。
由于实施上述技术方案，本申请对A型口蹄疫全病毒抗原进行处理，免疫Balb/c小鼠,获得分泌抗A型口蹄疫全病毒抗原的脾淋巴细胞，将其与SP2/0细胞融合获得分泌抗A型口蹄疫全病毒抗原的杂交瘤细胞株，从而获得抗A型口蹄疫全病毒抗原的抗体，该抗体作为诊断试剂，通过抗原检测可灵敏的检测出A型口蹄疫全病毒抗原（新疆阿克陶58 FMD A型病毒）的感染。从而区分疫苗感染和自然感染，为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
附图说明
本申请的具体结构由以下的附图和实施例给出：
图1是本申请中单克隆抗体的杂交瘤细胞株XJ14-2F7培养上清液与缅甸98、0s99泛亚谱系I、 A型阿克陶58等特异性反应的Western blot结果；
图2是本申请中杂交瘤细胞株XJ14-2F7染色体形态（10×100倍）放大图；
图3是本申请中通过试纸条鉴定获得杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的亚型为免疫球蛋白G1(Immunoglobulin G1，Ig G1) 轻链为Kappa型的结果图；
图4是本申请中获得的单克隆抗体的杂交瘤细胞株效价示意图；
图5是本申请中杂交瘤细胞株XJ14-2F7细胞培养上清与接种疫苗毒的BHK细胞反应(10×10倍)放大图；
图6是本申请中SP2/0细胞培养上清与接种疫苗毒的BHK细胞反应(10×10倍)放大图。
具体实施方式
本申请不受下述实施例的限制，可根据本申请的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例：在产生单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株前需作下列准备：
一、实验试剂的准备：Triton X-100，牛血清白蛋白（BSA）、protein assayconcertration 、蛋白marker、聚乙二醇（PEG1500）、RPMI-1640、胎牛血清购自Hyclone公司、100×HT、100×HAT购自Hyclone公司、其余试剂均为国产分析纯、低分子质量标准蛋白Marker购自Promega公司； Tween-20、过硫酸铵（APS）、四甲基二乙胺（TEMED）、20×PBS浓缩液牛血清白蛋白（BSA）、邻苯二胺（OPD）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG（HRP-IgG）、二甲亚砜（DMSO）、ELISA包被液（pH7.4）、8-氮鸟嘌呤、血清稀释液为本实验室自制；其余试剂均为国产分析纯；
二、实验动物与细胞的准备：8周龄清洁级BALB/c雌性小鼠购自新疆实验动物研究中心、SP2/0（小鼠骨髓瘤细胞）购自中科院上海细胞库。
三、主要仪器与设备的准备：电泳仪 ，台式离心机（Eppendorf 德国）、制冰机（Scotsman，美国）、倒置显微镜（Olympus CK30）、CO2培养箱（Sanyo公司，日本）、台式电子天平（上海精天公司）、细胞培养板、生物安全柜、DYNEX-OPSYS酶标检测仪（USA）、-80℃冷冻冰箱、台式电子天平（上海精天公司）、细胞培养板、细胞冻存管，液氮罐。
一种抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、A型口蹄疫全病毒抗原的制备：
1、A型口蹄疫全病毒抗原的制备：A型FMDV细胞种毒接种于单层BHK-21细胞上培养，收获100%病变的细胞组织液，用二乙烯亚胺（BEI）灭活，-80℃冻存、备用；
2、测A型口蹄疫全病毒抗原蛋白浓度：
dye-reagent 测定：参照BIO-RAD protein assay concerntration 试剂盒测定。具体方法如下:dry-reagent按1份显色液加4份水稀释。每孔加稀释的显色液200ul，待测蛋白按1:10,1:20稀释后加入10ul，充分混匀，在避光下作用5分钟。在酶标仪595nm下读值。以牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，分别按1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml稀释，按以上方法加样测定。测得结果以BSA蛋白的读值做Y=kX+b为曲线，得出待测蛋白浓度。
步骤二、A型口蹄疫全病毒抗原免疫Balb/c小鼠；
用制备的病毒抗原免疫8周龄BALB/c雌性小鼠，免疫时，100µg/只，皮下多点注射，共免疫三次，每次间隔2周。首免时，用弗氏完全佐剂与抗原等体积混合乳化，第二、三次免疫时，用弗氏不完全佐剂与抗原等体积混合乳化，每次乳化都必须使混合物达到油包水状态才可免疫。第3次免疫3d后，可取阳性组部分小鼠的脾细胞进行细胞融合试验。
步骤三、SP2/0细胞的制备：
1、融合前30d左右，进行SP2/0细胞的复苏，将SP2/0细胞连续传代三次，以保持HGPRT（次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺陷型；
2、1000r/min离心5min收集8-氮鸟嘌呤处理过的SP2/0细胞， PBS缓冲液洗涤三次，加入完全培养液，放入细胞培养瓶中37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中传代培养；
3、融合前24～48h，选择生长良好和形态典型的SP2/0细胞。进行半传代培养，SP2/0细胞的状态比其数量更重要，也是融合成功的关键因素之一。
步骤四、饲养细胞的制备：
1、在融合前2～3d，选择与免疫小鼠相同品系的BALB/c雌性小鼠，将其移入超净台使之安乐死，75%酒精浸泡消毒3 min后固定于解剖板上；
2、用镊子提起小鼠腹部皮肤，无菌剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露；
3、用酒精擦拭消毒，用高温消毒过的无菌注射器吸取含20%胎牛血清HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择培养液10mL注入小鼠腹腔，小心反复吹打注射器内的液体（此时勿将针头拔出），大约3～4次之后，用该注射器吸出腹腔内液体（内含巨噬细胞），注入灭菌平皿中，进行细胞计数；
4、调整HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液体积，使细胞浓度在1×105个/mL左右，分装于96孔细胞培养板中，100µL/孔，37℃、饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。18～24h后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁紧密，折光性好时可用。
步骤五、脾细胞的制备：
1、用安乐法处死小鼠，在75%的酒精中浸泡5min；
2、无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；
3、将脾脏移入另一盛有20mL基础培养液的平皿中。用灭菌注射器吸取营养液插入脾脏的一端，推入培养液，将脾脏内细胞冲洗出来，反复冲洗数次，直至脾脏的颜色变白为止；
4、吸出平皿内的脾细胞悬液到管口设有200目的不锈钢筛网的50mL离心管内，拔出筛网去除脂肪和大的结缔组织块，以1000r/min离心5min，沉淀细胞，弃上清液；
5、用4℃的0.91%氯化铵溶液5mL混悬沉淀的细胞，置细胞悬液于水浴条件下5min，破坏从脾脏释出的红细胞；
6、加入基础培养液15mL终止氯化铵的作用。取样进行脾淋巴细胞计数；
7、将脾淋巴细胞以1000r/min离心5min，弃上清液。再加入10mL基础培养液重新悬浮沉淀的脾淋巴细胞。此即为待融合的脾淋巴细胞。
步骤六、细胞融合：
1、将1.0×108个脾细胞2.0×107个骨髓瘤细胞混合于50mL的离心管中，轻轻混匀；
2、1000r/min离心10min，弃上清液，尽可能除得干净；
3、用手指轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状，此步为融合关键步骤；
4、将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL37℃预温的50% PEG缓缓滴入离心管内，在1min内加完，边滴加边摇动，使细胞保持在混和状态；
5、在15sec内加入1mL基础培养液（37℃），且不断摇动离心管，继续摇动离心管45sec；
6、在30sec内加入2mL基础培养液（37℃），且不断摇动离心管，继续摇动离心管2min；
7、在30sec内加入4mL完全培养液（37℃），且不断摇动离心管，继续摇动离心管2min；
8、在30sec内加入8mL完全培养液（37℃），且不断混匀，使PEG(聚乙二醇)作用终止。由于稀释使PEG(聚乙二醇)停止作用，注意尽可能不要搅动细胞；
9、将终止反应后的细胞悬液以1000r/min离心10min，弃上清液，加入适量的HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液：以每2×107个脾淋巴细胞中加入10mlHAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液，并以100ul/孔的量加入到一块已含有饲养细胞的96孔细胞培养板中；
10、将接种了融合细胞的96孔培养板，置37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养；
11、每2～3天换一次HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液，连续两周。观察杂交瘤细胞是否出现。2周后，可改用HT（次黄嘌呤、胸腺嘧啶）培养基。
步骤七、融合细胞的选择培养：细胞融合后，在培养液中存在有五种细胞成分，即：未融合的脾细胞，未融合的骨髓瘤细胞，脾细胞与脾细胞融合而成的同核体，骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合而成的同核体，以及脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体。然而由于存在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基，其中的骨髓瘤细胞及其相互融合形成的同核体细胞的DNA合成的主要途径被氨基喋呤阻断，因为缺乏HGPRT (次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，DNA合成旁路途径也不能进行，故它们在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中不能增殖而很快死亡。小鼠脾细胞及其相互融合形成的同核体虽然具有HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，但缺乏在体外培养中增殖的能力，一般在5～7d内也会死亡，唯有脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中存活下来，并不断增殖。融合后的细胞每3d更换培养液一次，换液时，先吸去原有培养孔1/2的培养液，再加入等量新鲜培养液，所用的培养液按培养时间的不同而有所不同，在融合后第2周内用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液；第3周用HT（次黄嘌呤、胸腺嘧啶）培养液，第3后用普通的完全培养液。
步骤八、阳性杂交瘤细胞株的筛选：为排除细胞培养上清液中的还未死的小鼠脾细胞所分泌的抗体的影响，可以在检测之前多进行几次半换液，尽可能的减少干扰。待杂交瘤细胞长满孔底1/3～1/2时换液，换液3～4d后即可取细胞培养上清液100µL，不作稀释用间接ELISA（酶联免疫吸附试验）实验进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照。检测为阳性的细胞可进行扩大培养，同时选择强阳性的孔进行亚克隆，并注意随时冻存保种。
步骤九、阳性杂交瘤细胞的克隆及扩增（有限稀释法）：
1、制备饲养细胞，方法步骤四所述，可于阳性杂交瘤细胞克隆化前2～3天制备；
2、将已检测为分泌阳性的96孔细胞培养板特定孔中杂交瘤细胞集落（强阳性孔）吹起，混匀，取所有细胞悬液至一无菌青霉素小瓶中，做适当稀释。将上述无菌小瓶中的细胞直接滴于细胞计数板上，进行细胞计数；
3、取上述细胞悬液，用含20%胎牛血清的HT（次黄嘌呤、胸腺嘧啶）培养液或完全培养液准确进行系列稀释，直至1mL含10个细胞。到第2或第3次亚克隆时，可适当的减少细胞密度，如调整至7～8个/mL，即每块96孔细胞培养板加70～80个细胞，这样可加快单个集落的形成；
4、将稀释好的细胞悬液用灭菌排枪加到事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100µL /孔，将培养板置5% CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养；
5、适时观察细胞的生长状况，待细胞集落生长到孔底1/3～1/2时半换液，并用所换培养液上清检测；
6、注意尽量选取单克隆细胞集落进行检测筛选与克隆化，同时每次将克隆化剩余细胞转入24孔细胞培养板培养，继而转入培养瓶中进行扩大培养，并及时冻存；
7、经过3～4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
8、获得分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时进行扩大培养并冻存。
步骤十、阳性杂交瘤细胞的冻存：
1、选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下；
2、1000r/min离心10min，弃上清，收集细胞沉淀；
3、用冻存液将细胞沉淀悬浮，分装于冻存管中，加盖封严，并注明细胞代码冻存日期；
4、将冻存管先放置4℃，放置2h，再移至－80℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，并做好记录，长期保存。
步骤十一、杂交瘤稳定性测定：细胞株连续传代并定期检测其培养上清，对照传代过程中其分泌能力变化；冻存一个月后复苏检测培养基上清，对照复苏前后分泌能力变化。
步骤十二、腹水制备：将阳性细胞克隆1O6/ml注射入Balb／c雌性小鼠腹腔，二周后收集腹水。
步骤十三、抗体特异性：分别与缅甸98、0s99泛亚谱系I、 A型阿克陶58、亚I江苏05、亚I克州03病毒抗原，进行Western blot反应。
步骤十四、杂交瘤细胞株染色体的鉴定：秋水仙碱处理对数生长期的杂主瘤细胞，经低渗处理后进行常规Giemsa染色．计数分析。
步骤十五、免疫球蛋白亚类鉴定：按照SIGMA公司生产的IsoQuickTMKit for MouseMonoclonal Isotyping试剂盒说明进行。
步骤十六、免疫荧光实验测定XJ14-2F7细胞株分泌的抗体与A型口蹄疫病毒的反应：将A型口蹄疫病毒按适当浓度接种于生长良好的BHK细胞(购自上海细胞库），24小时后弃细胞液，用0.01M PH7.4的PBS洗3遍，用冰无水乙醇固定（过夜），固定好的细胞用PBS洗三遍，自然风干，分两组组分别加入用XJ14-2F7细胞培养上清及SP2/0细胞培养上清，37℃孵育60分钟，用PBS洗3次，自然风干，加入用PBS1：150倍稀释（产品说明）兔抗鼠IGg荧光抗体于细胞图片上，37℃孵育45分钟，用PBS洗3次，自然风干。荧光显微镜下观察并采集图象。
A型口蹄疫全病毒抗原保存：按0.5毫升的体积分装，置-80℃保存备用。
杂交瘤细胞株的建立：将筛选出的阳性细胞孔内的细胞,用有限稀释法经过四次克隆，克隆板阳性率达到100％. 筛选得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。命名为XJ14-2F7。连续传代32代、冻存1个月和冻存1年后复苏，ELISA检测抗体滴度无明显降低，仍保持相同的机体分泌能力。
如图1所示，抗体特异性：Western-biot检测结果，抗体能够与3、A型阿克陶58
病毒抗原结合呈强阳性反应，不与1、O型缅甸98；2、0s99泛亚谱系I；4、亚I江苏05；5、亚I克州03病毒抗原反应。
如图2所示，杂交瘤细胞株的染色体分析：XJ14-2F7细胞染色体数目为98- 102条，有端着修粒及中着丝粒染色体，大部分为端着丝粒，符合杂交瘤细胞的染色体特点。
如图3所示，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分型：经检测证明获得的抗A型口蹄疫单克隆抗体细胞株XJ14-2F7免疫球蛋白亚型为IgG1型,轻链为Kappa型。
如图4所示，获得的单克隆抗体细胞株效价为1:320000。
如图5、6所示，免疫荧光实验测定XJ14-2F7细胞株分泌的抗体与A型口蹄疫病毒的反应结果：从显徽镜下观察，本实验得到的单克隆抗体细胞株培养上清与感染A型口蹄疫的BHK细胞呈亮黄色的阳性反应，而SP2/0细胞培养上清与感染A型口蹄疫的BHK细胞未出现亮黄色的阳性反应(即阴性)。
以上技术特征构成了本申请的最佳实施例，其具有较强的适应性和最佳实施效果，可根据实际需要增减非必要技术特征，来满足不同情况的需要。

Claims (6)

1.一种抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：分类命名为杂交瘤细胞株XJ14-2F7，保藏编号为CCTCC NO：C201790。
2.如权利要求1所述的抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备抗A型口蹄疫全病毒检测试剂盒中的应用。
3.一种抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、制备A型口蹄疫全病毒抗原；
步骤二、A型口蹄疫全病毒抗原免疫Balb/c小鼠；
步骤三、制备SP2/0细胞；
步骤四、制备饲养细胞；
步骤五、从小鼠身上制备待融合的脾淋巴细胞；
步骤六、将1.0×108个脾淋巴细胞和2.0×107个骨髓瘤细胞(购自上海细胞库)进行细胞融合；
步骤七、融合细胞的选择培养：脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中存活下来，并不断增殖；
步骤八、阳性杂交瘤细胞株的筛选：待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，换液3-4d后即可取细胞培养上清液100µL，不作稀释用间接ELISA（酶联免疫吸附试验）实验进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照；免疫后取脾脏细胞进行细胞融合的小鼠血清做阳性对照；检测为阳性的细胞可进行扩大培养，同时选择强阳性的孔进行亚克隆，并注意随时冻存保种；
步骤九、采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆及扩增，最终获得杂交瘤细胞株XJ14-2F7；
步骤十、选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞进行阳性杂交瘤细胞的冻存。
4.一种抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得。
5.如权利要求4所述的抗A型口蹄疫抗原单克隆抗体在检测A型口蹄疫全病毒中的应用。
6.一种A型口蹄疫检测试剂盒，其特征在于：包含有如权利要求4所述的抗A型口蹄疫全病毒抗原单克隆抗体。
CN202010220553.3A 2020-03-25 2020-03-25 抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用 Pending CN111172118A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010220553.3A CN111172118A (zh) 2020-03-25 2020-03-25 抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010220553.3A CN111172118A (zh) 2020-03-25 2020-03-25 抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111172118A true CN111172118A (zh) 2020-05-19

Family

ID=70621898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010220553.3A Pending CN111172118A (zh) 2020-03-25 2020-03-25 抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111172118A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277332A (zh) * 2010-10-30 2011-12-14 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及用途
JP2016132628A (ja) * 2015-01-16 2016-07-25 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 口蹄疫ウイルスと反応する抗体
CN107541500A (zh) * 2017-07-27 2018-01-05 武汉科前生物股份有限公司 一种a型口蹄疫病毒单克隆抗体及应用
KR101960968B1 (ko) * 2017-10-13 2019-03-22 주식회사 메디안디노스틱 구제역 바이러스 혈청형 a 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도
CN110144329A (zh) * 2019-05-29 2019-08-20 北京标驰泽惠生物科技有限公司 杂交瘤细胞株6b1及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277332A (zh) * 2010-10-30 2011-12-14 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗口蹄疫病毒的单克隆抗体及用途
JP2016132628A (ja) * 2015-01-16 2016-07-25 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 口蹄疫ウイルスと反応する抗体
CN107541500A (zh) * 2017-07-27 2018-01-05 武汉科前生物股份有限公司 一种a型口蹄疫病毒单克隆抗体及应用
KR101960968B1 (ko) * 2017-10-13 2019-03-22 주식회사 메디안디노스틱 구제역 바이러스 혈청형 a 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도
CN110144329A (zh) * 2019-05-29 2019-08-20 北京标驰泽惠生物科技有限公司 杂交瘤细胞株6b1及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2305707C2 (ru) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ LAWSONIA INTRACELLULARIS В КЛЕТКАХ McCoy И ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОК MCCOY ДЛЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ LAWSONIA INTRACELLULARIS
CN107312746B (zh) 一种猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法
CN111269890A (zh) 抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用
Chen et al. Detection and identification of plant and insect mollicutes
CN107937349A (zh) 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用
CN110218668A (zh) 一种惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
CN102807970B (zh) 犬瘟热病毒敏感细胞系及其建立方法和应用
CN111474357B (zh) 非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用
CN107794244A (zh) Vero‑pAPN细胞系及其制备方法
CN110106150A (zh) 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用
CN109593729A (zh) 一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用
CN114107311A (zh) 参与猪传染性胃肠炎病毒感染的靶点及其应用
CN111172118A (zh) 抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗a型口蹄疫抗原单克隆抗体及其应用
US4721675A (en) Production of hepatitis A virus in vitro utilizing a persistently virus infected cell culture system
Zhang et al. Production and characterization of monoclonal antibodies against Enterocytozoon bieneusi purified from rhesus macaques
CN112501129B (zh) 抗ibdv vp2蛋白的单克隆抗体组合及其在鉴别检测ibdv中的用途
AU603774B2 (en) Specific mycoplasma membrane antigen and antibody and their clinical applications
CN105543177A (zh) 分泌抗柑橘黄化脉明病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN109709330B (zh) 一种口蹄疫病毒竞争elisa检测试剂盒
Carmichael et al. A Fatal Septicemic Disease of Infant Puppies Caused by Gytopathogenic Organisms with Characteristics of Mycoplasma
CN108330101B (zh) 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用
CN113801854A (zh) 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用
CN106318899B (zh) 一株牛睾丸传代细胞株的建立及其应用
CN109735477A (zh) 单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用
CN110172448A (zh) 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R及其子代细胞系

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination