CN107643405A - 一种检测抗tsc22d3等血液自身抗体的肺癌诊断试剂盒和检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诊断肺癌的方法/试剂盒，属于医学诊断技术领域，用于检测血清/血浆中的抗TSC22D3、抗BASP1、抗TFAP2A、抗MAGEB6、抗ZNF655、抗GPT2、抗DDB1、抗ETV2、抗DNAJC12或抗TSPY3自身抗体的存在和/或含量。其优点表现在：本发明首次通过蛋白质芯片筛选发现上述自身抗体能够作为肺癌诊断的靶标，并提供了一种用于肺癌诊断的试剂盒，其构成包括固相基质、以上自身抗体的特异性结合配偶体、第二种特异性结合配偶体和可检测基团。本发明应用于肺癌的早期诊断、可疑肺癌的风险预测及良恶性分组、复发监控和用药伴随诊断等，具有更高的诊断效能。

Description

一种检测抗TSC22D3等血液自身抗体的肺癌诊断试剂盒和检 测方法及其应用

技术领域

本发明涉及医学诊断技术领域，具体地说，是一组离体血清或血浆的抗TSC22结构域家族蛋白3等十种自身抗体在肺癌诊断中的检测方法和用途。

背景技术

癌症的早期诊断对于癌症治疗方式的选择和治疗疗效具有重要的意义。然而对于许多类型的癌症而言，目前仍缺乏好的早期诊断指标和筛查技术，导致确诊时已为晚期。以肺癌为例，尽管医学影像技术的普及提高了早期检测肺癌的能力，然而大部分肺癌患者确诊时已是晚期疾病。即使医学影像发现肺部小结节，也有相当患者因无法确定小结节的良恶性而延迟治疗机会。因此基于血液的早期检测策略具有必要性。

目前已知早期肿瘤细胞可表达产生某些异常蛋白，可被机体免疫系统识别后产生特异的抗体，这蛋白被称为肿瘤相关抗原,其抗体则称为自身抗体。检测自身抗体可间接反应肿瘤相关抗原的存在。许多研究表明肿瘤抗原产生的自身抗体是肿瘤早期诊断较好指标，并亦可用于肿瘤的复发监控、疗效监控及用药伴随诊断等。早期的研究分别采用SEREX(重组cDNA表达文库血清学筛选)法，噬菌体肽库淘选法，SERPA(血清蛋白组学)等方法对肿瘤的自身抗体进行筛选，获得了一批已公开的肿瘤自身抗体用于肿瘤的诊断。如p53、Annexin I、14-3-3θ、LAMR1、PGP9.5、c-myc、HER2、NY-SEO-1、CAGE、GBU-4-5、SOX2等自身抗体用于肺癌诊断；p62、HCC1等自身抗体用于肝癌诊断、NPM1、MDM2、PLAT、c-Myc、p53、RalA等自身抗体用于卵巢癌诊断；p53、HSP70、HCC-22-5、peroxiredoxin VI、KM-HN-1、p90等自身抗体用于胃癌诊断。然而以上述已公开的自身抗体检测用于肺癌诊断仍有不足，一般而言，目前已公开的单独的自身抗体的诊断灵敏度仅在5％-20％之间，多个自身抗体的联合可以有效提高灵敏度，然而目前即便是最好的自身抗体联合方案的灵敏度也仅在40％-60％左右，造成临床诊断的精确度不足。因此发现新的肺癌自身抗体，进而形成更好的检测方案，对于改善诊断精确度具有重要价值。

目前国内外研究表明不同疾病的自身抗体谱均不同，因此获得特定疾病的自身抗体谱对相关诊断具有重要意义。特定疾病自身抗体的发现是通过其识别抗原来进行定义和筛选，方法均基于抗原-抗体特异性结合的免疫检测。抗原的来源包括重组表达蛋白、cDNA表达库、细胞或组织分离的蛋白组等，筛选方法主要是免疫印迹，高通量蛋白质芯片，酶联免疫吸附等。本发明通过自身抗体的芯片筛选技术，发现了一组新的肺癌外周血自身抗体，并经过临床标本的验证，可用于肺癌的早期诊断和伴随诊断。本发明采用基因重组技术获得了所述的肺癌相关抗原，并通过免疫学检测技术建立了检测血清自身抗体的方法，对该组自身抗体用于肺癌诊断的价值进行了验证。

国际公布WO2008107134A1公开了BASP1基因诊断肝癌的用途。中国专利文献CN101492712公开了MAGEB6基因在诊断肝癌中的应用。国际公布WO2009124090A1公开了DNAJC12基因在诊断哮喘中的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一组离体血清或血浆的抗TSC22结构域家族蛋白3等十种自身抗体在肺癌诊断中的检测方法和用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：抗TSC22D3(TSC22结构域家族蛋白3)自身抗体、抗BASP1(脑胞膜结合信号蛋白1)自身抗体、抗TFAP2A(AP-2转录因子A)自身抗体、抗MAGEB6(MAGE抗原B6)自身抗体、抗ZNF655(锌指蛋白655)自身抗体、抗GPT2(谷丙转氨酶2)自身抗体、抗DDB1(损伤特异性DNA结合蛋白1)自身抗体、抗ETV2(ETS转录因子变异蛋白2)自身抗体、抗DNAJC12(DNAJ热休克家族蛋白C12)自身抗体或抗TSPY3(Y连锁睾丸特异蛋白)自身抗体作为诊断标志物在制备诊断肺癌的试剂盒中的应用。采用基因重组技术体外表达人TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3的全蛋白或片段作为检测上述自身抗体的特异性结合配偶体。采用反向酶联免疫吸附测定原理，建立基于免疫学检测技术的上述血清/血浆自身抗体的体外检测试剂盒。

本发明可应用于肺癌的早期诊断、可疑肺癌的风险预测及良恶性分组、肺癌的复发监控和肺癌的用药伴随诊断等。本发明包括了检测人类血清/血浆中上述自身抗体的试剂盒，其主要构成为固相基质，上述自身抗体的特异性结合配偶体，第二种特异性结合配偶体和可检测基团。

所述的试剂盒包括固相基质，自身抗体的特异性结合配偶体，第二种特异性结合配偶体和可检测基团，其中固相基质与特异性结合配偶体结合或缀合，第二种特异性结合配偶体与可检测基团结合或缀合。

本发明所述的固相基质为平面或曲面固相基质，主要用于将特异性结合配偶体结合于固相基质表面，以便于后期反应残余物的清洗。最常见的固相基质是微孔板的聚苯乙烯底面，硝酸纤维素、尼龙膜，PVDF膜的表面，玻璃基质的表面，及各种有机聚合物或无机微球的表面等，均可作为试剂盒的固相基质。

本发明所述的自身抗体特异性结合配偶体可采用微孔板、微球体、多孔膜构成作为固相支持基质。特异性结合配偶体与固相基质的结合可通过物理吸附、静电吸附或共价结合等多种结合形式，此类结合/缀合方法是本领域技术人员所知晓的应用方法。

所述的特异性结合配偶体为全抗原或其片段的任意组合。本发明所述的上述自身抗体的特异性结合配偶体可以采用本领域技术人员所知晓的基因工程方法或人工合成的方法予以合成。如采用基因工程的方法进行合成，可以依据需要选择原核表达系统或者真核表达系统，原核表达系统主要以大肠杆菌表达系统为代表，真核表达系统则以酵母表达系统，昆虫细胞表达系统，哺乳动物表达系统为代表。如采用人工合成的方式，则直接通过经典的多肽固相合成法进行具的抗原片段的合成。无论采用何种方法，均以获得具有免疫原性的抗原蛋白或其片段为目的，均可作为自身抗体的特异性结合配偶体，并作为试剂盒的组成成分。

本发明所述的第二种特异性结合配偶体，是用于同自身抗体的特异性结合配偶体特异结合且可被可检测基团直接或间接标记的第二种配偶体，包括但不限于抗人免疫球蛋白的抗体、抗体片段或抗体标记物。第二种特异性结合配偶体与可检测基团的标记方法可依据可检测基团的不同而采用相应的已为业内所广泛认可的方法，或直接采用已商品化的标记产品。本发明所述试剂盒的可检测基团，是指与第二种特异性结合配偶体相结合或缀合的具有检测信号的基团或分子。通过医学设备检测可获得可检测基团相应的定量光信号、电信号或放射信号的化学基团，因获得的定量信号同自身抗体的存在/含量存在函数关系，从而表征出样品中自身抗体的存在/含量。

一般而言，可检测基团可采用本技术领域专业人员所共知的酶标记、荧光标记、胶体发色标记或放射性标记等。酶标记可采用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶等及其底物溶液，检测仪器采用可见光酶标仪等；荧光标记可采用本领域人员所知晓的各类荧光染料或时间分辨荧光染料，如FITC,PE,Cy3，Cy5，稀土金属等，检测仪器可采用荧光酶标仪，流式细胞仪或特定的荧光检测设备。胶体发色标记可采用胶体金标记，结果可肉眼观察。放射性标记可采用各种医用放射性核素如I-131,I-125等，检测仪器采用γ-计数器或放射性曝光。本发明所涉及试剂盒的可检测基团，应至少由酶标记、荧光标记、胶体发色标记或放射性标记之一组成。

所述的试剂盒可单独或联合检测抗TSC22D3自身抗体、抗BASP1自身抗体、抗TFAP2A自身抗体、抗MAGEB6自身抗体、抗ZNF655自身抗体、抗GPT2自身抗体、抗DDB1自身抗体、抗ETV2自身抗体、抗DNAJC12自身抗体和抗TSPY3自身抗体。

所述的试剂盒联合检测抗TSC22D3自身抗体、抗BASP1自身抗体、抗TFAP2A自身抗体、抗MAGEB6自身抗体、抗ZNF655自身抗体、抗GPT2自身抗体、抗DDB1自身抗体、抗ETV2自身抗体、抗DNAJC12自身抗体、抗TSPY3自身抗体和抗NY-ESO-1自身抗体。

所述的试剂盒检测离体血清或血浆中上述自身抗体的存在和/或含量。

本发明优点在于：

1、本发明通过蛋白质芯片筛选，优选了肺癌患者血清中存在的抗TSC22D3(TSC22结构域家族蛋白3)自身抗体、抗BASP1(脑胞膜结合信号蛋白1)自身抗体、抗TFAP2A(AP-2转录因子A)自身抗体、抗MAGEB6(MAGE抗原B6)自身抗体、抗ZNF655(锌指蛋白655)自身抗体、抗GPT2(谷丙转氨酶2)自身抗体、抗DDB1(损伤特异性DNA结合蛋白1)自身抗体、抗ETV2(ETS转录因子变异蛋白2)自身抗体、抗DNAJC12(DNAJ热休克家族蛋白C12)自身抗体、或抗Y连锁睾丸特异蛋白(TSPY3)自身抗体能够作为肺癌诊断的靶标。采用基因重组技术，本发明体外表达了人TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3的全抗原蛋白或抗原片段作为检测上述自身抗体的特异性结合配偶体。利用反向酶联免疫吸附测定原理，本发明采用抗原包被酶标板，建立了体外检测上述血清/血浆自身抗体的ELISA试剂盒。采用上述自身抗体检测的试剂盒，研究上述自身抗体诊断肺癌的性能，结果表明TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3的自身抗体检测或联合检测肺癌(含早期)具有较好的敏感性和特异性，优于目前已公开的肺癌诊断自身抗体。

2、本发明主要应用于但不限于肺癌的早期诊断、可疑肺癌的风险预测及良恶性分组、确定肺癌的分子分期、肺癌的复发监控和肺癌的用药伴随诊断等。

附图说明

附图1：蛋白芯片技术筛选肺癌患者血清自身抗体，图示为具有代表性的TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3杂交阴性点和阳性点。

附图2：特异性结合配偶体的表达和制备，图示为TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3全蛋白或片段经大肠杆菌或酵母表达纯化后的电泳鉴定图。

附图3：本发明自身抗体检测对肺癌治疗疗效监测和复发监测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：蛋白芯片技术筛选肺癌患者血清自身抗体

人类蛋白质组芯片包含约14,000个人源重组蛋白质。筛选血清抗体的流程为：收集不同类型肺癌患者血清；血清样本同蛋白质芯片进行孵育杂交，使血清抗体与固定于芯片的抗原进行结合；清洗后，再用抗人IgG/M荧光标记二抗(抗人IgG-cy3，呈现绿色，抗人IgG-cy5，呈现红色孵育)，清洗后用荧光扫描仪读取信号，信号的强弱与自身抗体的亲和力和数量呈正相关。步骤如下：

1.采集肺癌患者血清，患者肺癌分期为I,II,III,IV期，采集年龄匹配的健康人血清和肺部非恶性疾病血清作为对照。

2.血清样本离心稀释后取300uL，加至蛋白质芯片上，进行37℃孵育杂交3小时或4℃过夜，使血清自身抗体与固定于芯片的抗原进行结合。

3.采用0.2％Tween20-PBS磷酸缓冲液清洗三次。

4.再滴加抗人IgG-Cy3标记绿色荧光抗体和抗人IgM-Cy5红色荧光标记抗体的混合液300uL，室温孵育1-2小时，采用0.2％Tween20-PBS磷酸缓冲液清洗三次。

5.用荧光扫描仪读取芯片荧光信号，每个点的荧光信号的强弱与自身抗体的亲和力和数量呈正相关。具有代表性的TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3杂交阴性点和阳性点见附图1。

6.数据分析，每张芯片的荧光强度数据经过归一化处理后，分别计算出～14000种蛋白点的相对荧光强度，以健康人和非恶性肺部疾病为对照，依照自身抗体在肺癌组中的阳性率和表达强度挑选出目标自身抗体。

实施例2：特异性结合配偶体的表达和制备

本项目筛选出的上述自身抗体的特异性结合配偶体可以采用本领域技术人员所知晓的基因工程方法或人工合成的方法予以合成。如采用基因工程的方法进行合成，可以依据需要选择原核表达系统或者真核表达系统，原核表达系统主要以大肠杆菌表达系统为代表，真核表达系统则以酵母表达系统，昆虫细胞表达系统，哺乳动物表达系统为代表。如采用人工合成的方式，则直接通过经典的多肽固相合成法进行具的抗原片段的合成。无论采用何种方法，均以获得具有免疫原性的抗原蛋白或其片段为目的，均可作为自身抗体的特异性结合配偶体。

(1)大肠杆菌表达人TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3的抗原蛋白，其中DDB1和ETV2为抗原片段。

1.1采用人TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3基因序列设计克隆插入序列，对按大肠杆菌进行偏好密码子改造，并分别设计His标签/Trx标签、NcoI和XhoI酶切位点、裂解位点后，用基于PAS(PCR-based AccurateSynthesis)的方法进行全基因合成。

1.2合成的目的基因DJ片段双酶切后，连接克隆到载体pET28a的NcoI和XhoI点之间，获得的重组质粒pET28a-DJ。连接产物转化TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子，抽提质粒后双酶切验证和测序验证。

1.3将pET28a-DJ载体转化至大肠杆菌Arctic Express中

1.3.1将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20分钟；

1.3.2 42℃热激90秒，迅速置冰中5分钟；加入600μl LB培养液；

1.3.3 37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜。

1.4 IPTG诱导pET28a-DJ载体融合蛋白的表达

1.4.1挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中，11℃220rpm振摇过夜；

1.4.2次日按1：100接种于50μg/ml Kan的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2小时)；

1.4.3取出1ml培养物，10000g室温离心2分钟，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

1.4.4向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇4小时，诱导融合蛋白表达；

1.4.5取出1ml培养物，10000g室温离心2分钟，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000g，离心10分钟，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

1.4.6进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。

1.5表达鉴定结果分析

利用IPTG诱导蛋白表达，经12％SDS-PAGE分析，目标蛋白主要存在于上清中。

1.6融合蛋白的Ni柱亲和纯化

1.6.1利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；

1.6.2用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

1.6.3用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

1.6.4用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

1.6.5上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15MNaCl，pH8.0进行透析过夜；

1.6.6纯化结果分析：获得的目标蛋白，进行12％SDS-PAGE分析和Western Blot分析验证，结果如附图2所示。此目的蛋白即作为本项目的特异性结合配偶体。

(2)酵母表达抗原蛋白：

2.1密码子改造和全基因合成，重组至克隆质粒。

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因XG，通过克隆位点EcoR I与Not I连入表达载体pYe-GAPα；

2.2获得的重组质粒pYe-GAPα-XG转入TOP10克隆菌株，抗性平板挑选阳性克隆。对阳性克隆进行质粒小抽，经双酶切及测序验证无误。

2.3提取阳性克隆质粒20ug左右，使用BspHI线性化，冻干浓缩待用，电泳检测。

2.4电转酵母细胞GS115：冰浴电转杯，将10uL线性化质粒加入到装有80uL毕赤酵母感受态细胞的1.5mL EP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5分钟。电击条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10毫秒。电击完成后，将650uL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中，30度静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于100ug/ml Zeocin抗生素YPD平板上，30度恒温培养3-4d。

2.5 PCR鉴定阳性克隆菌株：待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500uL YPD液体培养基离心管(抗生素Zeocin，100ug/ml)，30度，180rpm过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组DNA，电泳检测。

2.6小试表达

2.6.1取鉴定的阳性菌株50uL接入装有10ml YPD的锥形瓶中，30度、220rpm培养，每24h从培养基中取样，10000rpm、2分钟离心收集上清液检测。

2.6.2三氯乙酸沉淀法浓缩表达产物

(1)在离心管中加入500μL培养液上清和1/9体积的100％的TCA，振荡混合，4℃沉淀过夜；

(2)12000rpm离心10分钟，沉淀为粘稠带黄褐色胶状物，弃上清，收集沉淀，另将EP管倒置于吸水纸上，37℃烘箱静置10～20分钟，使管壁无明显液体残留；

(3)加入200μL冷丙酮，振荡混匀，样品在室温下静置10分钟，洗去管壁和管底残留的TCA；

(4)12000rpm离心10分钟，弃上清，重复步骤(2)和(1)，2～3次；

(5)加入上样缓冲液30μL，37℃孵育1h，溶解沉淀；如果沉淀不溶解，可用100μL枪头吹打至沉淀溶解。

2.6.3采用SDS-PAGE电泳和Western Blot检测表达产物：

使用His抗体Western Blot检测诱导后的阳性的菌株发酵液。步骤如下：

(1)电泳条件：5％浓缩胶：90V 30分钟；10％分离胶：120V 20分钟。

(2)转膜：分别叠放好三层滤纸、SDS-PAGE胶和PVDF膜(PVDF膜事先需要甲醇活化15s左右)，使用转膜仪进行湿法转膜，恒压100V，60分钟。

(3)封闭：5％脱脂奶粉PBST溶液封闭膜，摇床37℃，2小时，PBS漂洗5分钟。

(4)一抗孵育及染色

一抗孵育：4℃过夜；PBST在37℃漂洗5分钟×3；二抗孵育：抗体1:1500稀释，37℃1小时；PBST在37℃漂洗5分钟×4

(5)曝光2分钟，获取图像。

经过表达鉴定分析实验结果有目的条带的表达。

2.7融合蛋白的Ni柱亲和纯化

2.7.1 Ni柱纯化

(1)诱导72h的发酵液离冷冻浓缩十倍，在PBS中透析过夜。

(2)利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱。

(3)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(4)用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

(5)用Ni-IDAElution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。

(6)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜。

(7)进行12％SDS-PAGE分析。

2.7.2纯化结果分析

通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12％SDS-PAGE分析。结果如附图2所示。此目的蛋白即作为本项目的特异性结合配偶体。

实施例3：特异性结合配偶体与固相基质的结合包被

固相基质包括平面/曲面固相基质，固相基质主要用于将特异性结合配偶体结合于固相表面，以便于后期反应残余物的清洗。最常见的固相基质是微孔板的聚苯乙烯底面，硝酸纤维素、尼龙膜，PVDF膜的表面，玻璃基质的表面，及各种有机聚合物或无机微球的表面。本发明所涉及的自身抗体特异性结合配偶体可采用微孔板、微球体、多孔膜构成作为固相支持基质。特异性结合配偶体与固相基质的结合可通过物理吸附、静电吸附或共价结合等多种结合形式，此类结合/缀合方法是本领域技术人员所知晓的应用方法。

(1)微孔板的包被

1.用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸缓冲液pH9.6)稀释特异性结合配偶体至1ug/mL。

2.按100uL/孔分装至96孔酶标板，4℃过夜。

3.去包被液，用300uL PBS清洗2次。加入300uL封闭液(5％脱脂奶粉-PBS)，室温2-4小时。

4.甩去封闭液，用300uL PBS清洗3次。

(2)微球体的包被

1.用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸缓冲液pH9.6)稀释特异性结合配偶体至1ug/mL。

2.按每mL 10mg用量加入已清洗的聚苯乙烯微球体，旋转式摇床75转/分4℃过夜。

3.离心1000rpm/分，吸去包被液，用300uL PBS离心清洗2次。加入300uL封闭液(5％脱脂奶粉-PBS)，室温旋转式摇床75转/分2-4小时。

4.用300uL PBS离心1000rpm/分，清洗3次。

(3)多孔膜的包被

1.多孔膜分别可采用硝酸纤维素膜，PVDF膜，尼龙膜。标记好点样点。

2.用点样缓冲液(0.05mol/L碳酸缓冲液pH9.6)稀释特异性结合配偶体至5ug/mL。

2.用点样针吸取样品，点于膜上指定位置，室温自然干燥。

3.将膜加入20mL 5％牛血清白蛋白-PBS中进行封闭2-4小时。在水平摇床上用PBS清洗膜3次，每次5分钟。

实施例4：酶/荧光标记法检测血清自身抗体

本发明所涉及的第二种特异性结合配偶体是指能够与人免疫球蛋白特异性结合的一种配偶体，一般而言，是一种抗人免疫球蛋白(IgG、IgM，IgA，IgE等)的抗体或其标记物。

本发明所涉及可检测基团，是指与第二种特异性结合配偶体相结合或缀合的具有检测信号的基团或分子。一般而言，可检测基团可采用本技术领域技术人员所共知的酶标记、荧光标记、胶体发色标记或放射性标记等。酶标记可采用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶等及其底物溶液，检测仪器采用可见光酶标仪等；荧光标记可采用本领域人员所知晓的各类荧光染料如FITC,PE,Cy3,Cy5等，检测仪器可采用荧光酶标仪，流式细胞仪或特定的荧光检测设备。胶体发色标记可采用胶体金标记，结果可肉眼观察。放射性标记可采用各种医用放射性核素如I-131,I-125等，检测仪器采用γ-计数器或放射性曝光。

(1)酶标记法检测

1.取患者血清或稀释血清100uL，加入已包被好特异性结合配偶体的96孔板中，室温孵育1.5小时。PBST清洗三次。

2.采用抗人IgG-HRP标记二抗，用PBST 1:1000稀释后，按每孔100uL加入96孔板，室温孵育1小时后，用PBST清洗四次。

3.加入TMB显色液100uL，反应10-15分钟后加入2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD450。以OD450值大于空白组2个标准偏差为阳性。

(2)荧光标记法检测

1.取患者血清或稀释血清100uL，加入已包被好特异性结合配偶体的96孔板中，室温孵育1.5小时。PBST清洗三次。

4.采用抗人IgG-Eu³⁺标记二抗，用PBST 1:1000稀释后，按每孔100uL加入96孔板，室温孵育1小时后，用PBST清洗四次。

5.再加入增强液200μL，25℃振荡反应5分钟，在时间分辨酶标仪上检测，以读取值大于空白组2个标准偏差为阳性。

实施例5：检测的特异性和敏感性

(1)酶联免疫吸附(EIA)检测血清自身抗体

1.取已包被特异性结合配偶体的微孔板，加稀释血清100uL,室温孵育90分钟。

2.PBS清洗三次，每次5分钟。

3.加入Anti-IgG-HRP二抗工作液100uL，室温孵育1小时。

4.PBS清洗三次，每次5分钟。

5.加入TMB显色液200uL，25℃显色10分钟。显色液配方：

6.加入终止液(2N H₂SO₄)50uL。

7.在酶标仪上测定OD450。

(2)血清自身抗体诊断肺癌的特异性和敏感性测定

采集I，II期肺癌患者血清45例，肺部非恶性疾病患者血清30例，年龄匹配的健康人血清15例，采用本发明的EIA试剂盒检测血清自身抗体。为了对比单个自身抗体的诊断效能，采用肺癌中已公认的自身抗体之一NY-ESO-1作为对比。

阳性孔判断标准：对于每种自身抗体，以OD值大于空白孔均值1.5倍判断为阳性。

检验金标准：已手术或活检的病理检测为金标准。以病理诊断为金标准，敏感性＝真阳性例数/(真阳性例数+假阴性人数)，特异性＝真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)。

每种自身抗体及多种自身抗体联合检测的敏感性、特异性见下表：

*联合检验1：10种自身抗体(不含Anti-NY-ESO-1)其中任意一个为阳性，则结果判为阳性。

**联合检验2：11种自身抗体(含Anti-NY-ESO-1)其中任意一个为阳性，则结果判为阳性。

NY-ESO-1自身抗体是公认的具有较好的诊断效能的自身抗体之一。在本实验中，作为对比的NY-ESO-1自身抗体敏感性仅为13％，特异性为98％，这也符合文献报道的一般结果。本实验数据表明除Anti-TSPY3(敏感性9％)以外，其余自身抗体的单独应用敏感性均高于NY-ESO-1，有望成为更好的用于肺癌诊断的标志物。本发明涉及的10种自身抗体联合检测的敏感性为77％，特异性为94％，表明本发明的自身抗体检测通过组合应用可以极大地提高诊断效能。本发明的自身抗体检测还可以同已公开的其它自身抗体联合应用，如与NY-ESO-1联合，可使诊断效能进一步提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.抗TSC22D3自身抗体、抗BASP1自身抗体、抗TFAP2A自身抗体、抗MAGEB6自身抗体、抗ZNF655自身抗体、抗GPT2自身抗体、抗DDB1自身抗体、抗ETV2自身抗体、抗DNAJC12自身抗体或抗TSPY3自身抗体作为诊断标志物在制备诊断肺癌的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断肺癌为肺癌的早期诊断、可疑肺癌的风险预测及良恶性分组、肺癌的复发监控或用药伴随诊断。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括固相基质，上述自身抗体的特异性结合配偶体，第二种特异性结合配偶体和可检测基团，其中固相基质与特异性结合配偶体结合或缀合，第二种特异性结合配偶体与可检测基团结合或缀合。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的固相基质为平面或曲面固相基质，所述的固相基质包括微孔板、微球体和多孔膜构成的支持基质。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的特异性结合配偶体为TSC22D3、BASP1、TFAP2A、MAGEB6、ZNF655、GPT2、DDB1、ETV2、DNAJC12、TSPY3全蛋白或其片段的任意组合。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的第二种特异性结合配偶体为抗人免疫球蛋白的抗体、抗体片段或抗体标记物。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的可检测基团由酶标记、荧光标记、胶体发色标记或放射性标记的一种或多种组成。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒联合检测抗TSC22D3自身抗体、抗BASP1自身抗体、抗TFAP2A自身抗体、抗MAGEB6自身抗体、抗ZNF655自身抗体、抗GPT2自身抗体、抗DDB1自身抗体、抗ETV2自身抗体、抗DNAJC12自身抗体和抗TSPY3自身抗体。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒联合检测抗TSC22D3自身抗体、抗BASP1自身抗体、抗TFAP2A自身抗体、抗MAGEB6自身抗体、抗ZNF655自身抗体、抗GPT2自身抗体、抗DDB1自身抗体、抗ETV2自身抗体、抗DNAJC12自身抗体、抗TSPY3自身抗体和抗NY-ESO-1自身抗体。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒检测离体血清或血浆中自身抗体的存在和/或含量。