CN104961806A - 一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法，属于生物技术和特异性抗体检测领域。本发明方法从具有相对保守氨基酸序列的抗原中筛选出2-5条可覆盖90％以上目标检测人群的肽段，然后将肽段偶联大蛋白以提高其免疫原性，将筛选的肽段组合起来作为检测使用的抗原，用于检测样本中的特异性抗体。本发明的方法不仅可代替单一抗原检测特异性抗体，而且具有可重复性高、数据稳定性高等优点。此外采用保守区肽段，由于突变相对较少，序列简单，临床应用的可行性较高，便于人工合成，易于组合检测；相对单一抗原检测而言，可扩大检测群体的适用范围。

Description

一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法
技术领域
本发明涉及一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法，属于生物技术和特异性抗体检测领域。
背景技术
特异性抗体的检测在医学、生物学等领域的研究中，甚至临床应用中均占有重要地位。其目的主要是协助临床诊断，在某些疾病中及预后的一个指标，在传染病流行病学调查中，特异性抗体的检测也具有特殊的、重要的意义。
针对特异性抗体检测方法的研究已相对成熟。传统方法有沉淀反应、凝集试验、补体结合试验等，而现在医学、生物学研究中更为常见的有酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等标记免疫测定方法。各类特异性抗体的检测方法拥有一个通用原理，即抗原与抗体的特异性结合。
然而病毒、细菌等常见抗原的基因相当复杂多变。遗传多样性，即生物的遗传基因多样性，是生命进化和物种分化的基础，主要是指生物种内基因的变化，包括同一种群内或不同的种群之间的遗传变异。自然界中，种群内的个体之间往往没有完全一致的基因型。微生物作为生物圈不可或缺的重要组成部分，拥有丰富的遗传多样性，尤其是野生型病毒、细菌的基因型，更为复杂。近年来，随着药物的滥用、各类疫苗的普及、环境的污染、机体免疫力普遍下降等诸多因素的共同影响，病毒和细菌变异株的出现频率逐渐升高。二者直接导致病毒型抗原和细菌表面抗原的复杂多变，这种现状加大了使用抗原有效检测特异性抗体的难度。
目前医学、生物学研究领域及临床应用中，通常采用单一抗原进行特异性抗体的检测，由于突变株的增生，加上抗原本身就具有多种基因型，甚至基因亚型(尤其某些突变频繁的流行性病毒)，特异性抗体的检测时常会出现检测信号波动的情况。
比如使用商业诊断试剂盒检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)时，个别基因型的样本或变异株可能由于结合的特异性不足，首次检测信号与再次检测信号出现很大差异。为满足各基因型样本的检测需求，有学者提出，可在抗体检测前，先将样本进行分类，再有针对性的选择对应抗原进行检测，但此举将大大增加样本检测的金钱成本和时间成本，临床应用可行性不足。又如检测梅毒抗体时，ELISA检测试剂盒采用单一梅毒螺旋体(TP)外膜脂蛋白作为抗原进行检测，但基因重组的TP抗原仅具有一级结构，与天然抗原存在差异，有文献报道，阴性样本的复检与初检结果只有19.3％的符合率。种种迹象表明，使用单一抗原检测特异性抗体已经无法满足临床需求。
发明内容
本发明的目的是面对某些抗原复杂多变的情况，或者抗原突变株增生的现状，在传统单一抗原无法有效检测出特异性抗体的前提下，提供一种检测特异性抗体的新方法。传统观念里，当抗原种类较复杂时，在使用单一抗原检测特异性抗体前，为了提高检测特异性，需针对待测样品所感染的抗原进行分类，再选择适合的抗原进行特异性抗体的检测，本发明可节省这一复杂的步骤，并提高检测结果的稳定性。
本发明的第一个目的是提供一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法。
所述方法包括以下步骤：
(1)确定用于检测的抗原具有相对保守的氨基酸序列(序列间差异以不超过20％为佳)；
(2)在相对保守的氨基酸序列中筛选出2-5条可覆盖90％以上目标检测人群的肽段；
(3)当筛选的肽段长度小于50个氨基酸或由于其他原因造成肽段的免疫原性过低时，采用偶联大蛋白的方式提高其免疫原性；将筛选的肽段组合起来，作为检测使用的抗原；
(4)用上一步得到的抗原检测样本中的特异性抗体。
所述肽段组合是指将筛选的肽段分别偶联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合，作为检测抗原。
所述步骤(4)中的检测，可以是任一常规抗体检测手段，比如ELISA。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是用来检测抗乙型肝炎病毒前S1抗体。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：
(1)确定抗乙型肝炎病毒前S1抗体的P94序列相对保守；
(2)获取乙肝患者血样，扩增其血清中病毒DNA的前S1区域并进行测序，将各样本的测序结果翻译为氨基酸序列后，分别与已报道的乙肝病毒P94肽段序列进行比对分析，确定患者感染的P94基因型，从而筛选获得2条以上可覆盖90％以上目标检测人群的肽段(即90％的目标检测人群，含有筛选得到的肽段的任意一条)；
(3)将上一步筛选得到的肽段分别偶联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合，作为抗原；
(4)用上一步得到的抗原检测血清中的P94抗体。
所述步骤(2)筛选得到的肽段，在本发明的一种实施方式中，必须包括序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段。
所述步骤(2)筛选得到的肽段，在本发明的一种实施方式中，还可以包括表1中除SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2序列以外的其他任意1-3种肽段。
所述步骤(3)中的大蛋白，在本发明的一种实施方式中，可以是KLH、OVA、BSA。
所述步骤(4)中的检测，在本发明的一种实施方式中，是将混合后的偶联的复合物作为ELISA包被抗原，采用ELISA法检测抗体。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测抗乙型肝炎病毒抗体的组合抗原，该组合抗原包含序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段。
所述组合抗原，在本发明的一种实施方式中，还包括表1中除SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2序列以外的其他任意1-3种肽段。
所述组合抗原，在本发明的一种实施方式中，是将序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段分别偶联大蛋白后，将偶联后的复合物混合得到的。
本发明还要求保护所述组合抗原在检测抗乙型肝炎病毒抗体方面的应用，以及含有所述组合抗原的试剂盒。
本发明的有益效果：(1)本发明是从单一表位，根据基因型的不同，从保守区肽段筛选获得能够覆盖大部分目标的肽段，通过保守区肽段组合来检测特异性抗体；本发明的保守区肽段组合的方法不仅可代替单一抗原检测特异性抗体，而且具有可重复性高、数据稳定性高等优点，可以克服目前单一抗原检测所存在的准确性低、稳定性低的缺陷；(2)本发明创造性地采用保守区肽段，保守区肽段
的突变相对较少，序列简单，临床应用的可行性较高；而且保守区肽段通常较短，
便于人工合成，同时易于组合检测；(3)保守区肽段组合，相对单一抗原检测而
言，可扩大检测群体的适用范围；(4)保守区肽段与所属物种(如病毒)的发展
进化、生命周期、感染途径等有关，对应的特异性抗体检测意义显著。
附图说明
图1：202例测序成功样本提供者感染的P94基因型分布图；
图2：批间变异系数对比图；其中a为变异系数柱状图；b为单一包被B基因型
P94肽段检测P94抗体时的变异系数散点图；c为单一包被C基因型P94肽
段检测P94抗体时的变异系数散点图；d为组合包被B+C基因型P94肽段
检测P94抗体时的变异系数散点图。
具体实施方式
通过多基因型肽段组合的方式检测抗乙型肝炎病毒前S1(94-117)抗体(简
称P94抗体)来具体说明本发明方法。
实施例1：相对保守氨基酸序列的确定和分析
乙肝病毒基因型分为A-H，共8种，其前S1(94-117)氨基酸序列相对保
守，但有所不同。通过分析从NIH的基因银行(GenBank)获取的39个已报道
的乙肝病毒基因亚型序列，发现乙肝病毒基因亚型的P94肽段平均有5-10％的
差异，极端情况20％(表1)，如C1和H1之间(5/24)。而使用单一前S1(94-117)
多肽(简称P94肽段)作为包被抗原来检测非相应抗体时，由于存在较多非特异
性识别，信号必将出现波动。现有检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的商业诊断
试剂盒也说明了类似问题：在检测变异株的HBsAg时，可能由于结合的特异性
不足，而导致信号波动(如首次检测信号较低不能确定，而再次检测时出现高水
平信号)。
表1不同乙肝病毒基因型的P94肽段序列
注：表中加粗斜体，为同种基因型内细分基因型比较后的差别。
结合实际情况(已验证P94序列相对保守)，本发明的检测P94抗体的方法
为：①确定2个可覆盖大部分患者群(90％以上)的相对保守的P94肽段；②将
筛选出的P94肽段组进行优化(通过偶联KLH大蛋白提高P94肽段的免疫原性)；
③将优化后的P94肽段组合起来作为ELISA包被抗原；④检测患者血清中的P94
抗体。
实施例2：可覆盖大部分患者群的相对保守的肽段的筛选
具体实施步骤如下：
步骤一：提取慢性乙肝患者血清中的病毒DNA
获取慢性乙肝患者血样213例，血样提供者年龄跨度较大(7岁-73岁)，男性占61％(130/213)。
使用TAKARA公司的DNA提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0，Catalog No.9766)，对213例样本进行病毒基因提取，将提取的乙肝病毒DNA作为模板链进行PCR扩增。
步骤二：PCR扩增病毒前S1区域并进行测序
通过PCR分别对213例DNA样本进行DNA模板链的扩增，同时设置进行对照品(未添加DNA模板的空白组)，反应体系均为50μL，各试剂加入量详见表2。
为提高产物纯度，采用巢式PCR进行扩增，使用的引物序列见表3。
第一轮PCR反应程序设置为95℃预变性3min，95℃变性40sec，55℃退火30sec，72℃链延长40sec，72℃稳定3min，共进行36个循环。第二轮PCR反应程序设置为95℃预变性3min，95℃变性40sec，50℃退火30sec，72℃链延长40sec，72℃稳定3min，共进行36个循环。扩增产物使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
213例DNA提取样品中，一次扩增不成功的样品将进行第二次扩增，以排除PCR实验误差。若两次扩增均未成功(相应位置没有呈现条带)，则认为该样品的DNA提取步骤未成功。
PCR扩增结果为：202例DNA提取样品扩增成功；11例样品扩增失败。
表2PCR反应体系试剂加入量
表3PCR扩增使用的引物
步骤三：比对前S1区域中P94肽段序列，确定患者感染的P94基因型
委托生工生物工程(上海)股份有限公司，对202例PCR扩增产物进行DNA测序，测序引物序列为GGTTGGTCTTCCAAACCTCG(序列如SEQ ID NO.21所示)，单向测通，测序片段长度约600bp。
将各样本的测序结果翻译为氨基酸序列后，分别与39个已报道的乙肝病毒P94肽段序列进行比对分析，确定患者感染的P94基因型。202例样本中发现A基因型1例、B基因型29例、C基因型166例、G基因型1例，不确定基因型5例(不确定样本与主要的A-H基因型的P94肽段不一致，可能属于一些次要亚型，或是突变株)，其中检测到的B基因型肽段序列均为PASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHP(序列如SEQ ID NO.1所示)、检测到的C基因型肽段序列均为PASSNRQSGKQPTPISPPLRDSHP(序列如SEQ ID NO.2所示)。
各基因型分布见图1，可见，B基因型和C基因型可以覆盖绝大部分患者(96％)感染的P94基因型。
实施例3：相对保守的肽段偶联大蛋白
将B基因型和C基因型P94肽段偶联KLH大蛋白，以提高其免疫原性
分别订购B基因型肽段(序列如SEQ ID NO.1所示)和C基因型P94肽段(序列如SEQ ID NO.2所示)，并将其偶联KLH大蛋白(由安比奇生物科技有限公司完成)。
实施例4：肽段组合抗原检测特异性抗体
分别采用单一B基因型P94肽段、单一C基因型P94肽段、组合B基因型和C基因型P94肽段，作为抗原，检测患者血样。
(1)包被B基因型P94肽段，使用ELISA法检测阴性对照样品7个、感染B基因型的患者血样15个、感染C基因型的患者血样24个：
将实施例3得到的偶联有B基因型P94肽段的KLH大蛋白在0.05mol/L,PH9.6的碳酸盐缓冲液中以浓度100μg/ml稀释后，在96孔板(Fisher)上包被过夜。用含1％BSA的PBS溶液将待测血清样本稀释125倍，37度孵育1h。酶标二抗(从山羊体内分离出的人IGg抗体，目录号A-3187,SigmaAldrich)稀释10000倍后，37度孵育1h。使用碱性磷酸酶(PNPP)作为显色底物，室温孵育20分钟后，3M NaOH终止反应。终止反应后10分钟内在酶标仪上测定OD405的值。
每个样品做2个复孔，共进行3次重复性实验。结果如表4-1所示。
(2)包被C基因型P94肽段，使用ELISA法检测阴性对照样品7个、感染B基因型的患者血样15个、感染C基因型的患者血样24个：
将偶联有C基因型P94肽段的KLH大蛋白，在0.05mol/L,PH9.6的碳酸盐缓冲液中以浓度100μg/ml稀释后，在96孔板(Fisher)上包被过夜。用含1％BSA的PBS溶液将待测血清样本稀释125倍，37度孵育1h。酶标二抗(从山羊体内分离出的人IGg抗体，目录号A-3187,SigmaAldrich)稀释10000倍后，37度孵育1h。使用碱性磷酸酶(PNPP)作为显色底物，室温孵育20分钟后，3M NaOH终止反应。终止反应后10分钟内在酶标仪上测定OD405的值。
每个样品做2个复孔，共进行3次重复性实验。结果如表4-2所示。
(3)组合包被B基因型和C基因型P94肽段，使用ELISA法检测阴性对照样品7个、感染B基因型的患者血样15个、感染C基因型的患者血样24个，进行3次重复性实验
分别将偶联有B基因型和C基因型P94肽段的KLH蛋白在0.05mol/L,PH9.6的碳酸盐缓冲液中混合，以浓度50μg/ml稀释后，在96孔板(Fisher)上包被过夜。用含1％BSA的PBS溶液将待测血清样本稀释125倍，37度孵育1h。酶标二抗(从山羊体内分离出的人IGg抗体，目录号A-3187,SigmaAldrich)稀释10000倍后，37度孵育1h。使用碱性磷酸酶(PNPP)作为显色底物，室温孵育20分钟后，3M NaOH终止反应。终止反应后10分钟内在酶标仪上测定OD405的值。
每个样品做2个复孔，共进行3次重复性实验。结果如表4-3所示。
(4)运用统计学方法分析保守区肽段组合检测法能否代替单一肽段检测特
异性抗体。
为验证包被组合肽段检测P94抗体与包被单一肽段检测P94抗体的结果是
否一致，本专利人为将P94抗体检测结果分为5个等级，分别用符号“-”、“-/+”、
“+”、“++”、“+++”表示。假设各批次实验中的阴性对照组均值为N，认为等级“-”
代表检测结果<2N的样品；等级“-/+”代表检测结果在2N-3N的样品；等级“+”代
表检测结果在3N-4N的样品；等级“++”代表检测结果在4N-5N的样品；等级
“+++”代表检测结果>5N的样品。“-”代表阴性，没有抗体；“-/+”代表可能是阴
性、也可能是阳性；“+”、“++”、“+++”代表阳性，含有抗体。
不同包被方式检测P94抗体数据分级结果如表4-1至表4-3所示，PXX代表
患者样本序号。
表4-1包被B基因型P94肽段的抗原检测P94抗体结果
表4-2包被C基因型P94肽段的抗原检测P94抗体结果
表4-3组合包被B基因型和C基因型P94肽段的抗原检测P94抗体结果
显而易见，检测B基因型样本时，包被组合肽段的检测结果与包被单一B
基因型肽段的检测结果基本一致；检测C基因型样本时，包被组合肽段的检测
结果与包被单一C基因型肽段的检测结果基本一致；当检测样本基因型与包被
肽段基因型不匹配时(包B-血清C；包C-血清B)，检测结果不一致，证明通过
保守区肽段组合的方式检测特异性抗体，可以代替任一单一包被肽段检测特异性
抗体的方法。
分析三组重复性实验的数据时，发现包被B基因型P94肽段检测C基因型
样本时、或包被C基因型P94肽段检测B基因型样本(即基因型不匹配)时，
批间变异系数较大(见表5、表6，图2b、2c)，检测信号波动较大。而组合包
被两种基因型的P94肽段时，变异系数小于单一包被P94肽段时的变异系数(图
2a)，且均小于15％(表7，图2d)，证明通过保守区肽段组合的方式检测特异性
抗体，具有更高的可重复性和数据稳定性。
表5单一包被B基因型P94多肽3次重复性实验数据的变异系数分析
表6单一包被C基因型P94多肽3次重复性实验数据的变异系数分析
表7组合包被B+C基因型P94多肽3次重复性实验数据的变异系数分析
综上所述，通过保守区肽段组合的方式检测特异性抗体，不仅具可以代替单一肽段检测特异性抗体，还有更高的可重复性和数据稳定性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种利用保守区肽段组合来检测特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)确定用于检测的抗原具有相对保守的氨基酸序列；(2)在相对保守的氨基酸序列中筛选出2-5条肽段，其中90％以上目标检测人群的抗原中含有这2-5条肽段中的任意一条；(3)当筛选的肽段长度小于50个氨基酸或免疫原性过低时，偶联大蛋白以提高其免疫原性；将筛选的肽段组合起来，作为检测使用的抗原；(4)用上一步得到的抗原检测样本中的特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽段组合是指将筛选的肽段分别偶联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合，作为抗原。
3.一种利用保守区肽段组合来检测抗乙型肝炎病毒前S1抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)确定抗乙型肝炎病毒前S1抗体的P94序列相对保守；(2)获取乙肝患者血样，扩增其血清中病毒DNA的前S1区域并进行测序，将各样本的测序结果翻译为氨基酸序列后，分别与已报道的乙肝病毒P94肽段序列进行比对分析，确定患者感染的P94基因型，从而筛选获得2条以上可覆盖90％以上目标检测人群的肽段；(3)将上一步筛选得到的肽段分别偶联大蛋白，然后将偶联后的复合物混合，作为抗原；(4)用上一步得到的抗原检测血清中的P94抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大蛋白是KLH、OVA或BSA。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的检测是将混合后的偶联的复合物作为ELISA包被抗原，采用ELISA法检测抗体。
6.一种用于检测抗乙型肝炎病毒抗体的组合抗原，其特征在于，所述组合抗原包含序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段。
7.根据权利要求6所述的组合抗原，其特征在于，所述组合抗原还包括SEQ ID NO.3至SEQID NO.16中的任意1-3条肽段。
8.根据权利要求6所述的组合抗原，其特征在于，所述组合抗原是将序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段分别偶联大蛋白后，将偶联后的复合物混合得到的。
9.权利要求6-8任一所述组合抗原在检测抗乙型肝炎病毒抗体方面的应用。
10.含有权利要求6-8任一所述组合抗原的试剂盒。
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