CN106432508A

CN106432508A - 一种pla2r‑thsd7a融合蛋白及其应用和试剂盒

Info

Publication number: CN106432508A
Application number: CN201610770500.2A
Authority: CN
Inventors: 熊祖应; 王洪涛; 林俊; 刘尧; 张永顶; 张大准; 张巧; 马伟民
Original assignee: SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106432508B

Abstract

本发明涉及医学领域，特别涉及一种PLA2R‑THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒。该融合蛋白包括与磷脂酶A2受体(PLA2R)至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)至少85％序列同源的第二区。本发明制备的融合蛋白综合了PLA2R和THSD7A两个抗原的抗原表位，同时具备了这两种抗原的免疫反应性，且该融合蛋白提高了对自发性MN相关自身抗体的检出率，检出率可达78.1％。

Description

一种PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒

技术领域

本发明涉及医学领域，特别涉及一种PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒。

背景技术

原发性膜性肾小球肾炎(pMGN)，又称为特发性膜性肾病(IMN)，是一种肾小球慢性炎症性疾病，是肾病综合征中常见的肾病类型之一。该病典型的特征是蛋白尿，随着尿蛋白含量的增加，有肾衰竭发展趋势。大多数的pMGN病人表现有肾病综合征，有的伴有水肿，体重增加，小便减少。pMGN与继发性膜性肾小球肾炎(sMGN)不同，sMGN是继发性疾病或并发性疾病。药物治疗、滥用毒品、感染性疾病、其他的自身免疫疾病和肿瘤都可能导致sMGN的发生。同时，sMGN可以随着根本疾病的治疗而好转。MGN的“金标准”为肾脏穿刺，肾组织的病理学和电镜检查。诊断的标志是免疫复合物在肾小球基底膜外侧的沉积。

越来越多的证据显示IMN是一种自身免疫疾病，已经发现的自身免疫抗原磷脂酶A2受体(PLA2R)和1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)对IMN的诊断都有一定的诊断价值。据报道，IMN病人血清中抗PLA2R IgG自身抗体阳性率为70％-75％，而在健康人、系统性红斑狼疮病人或其他肾病患者未检出，另外，IMN病人血清中THSD7A抗体的阳性率为5％-10％。多篇专利文献中也显示了这两种抗原在自发性膜性肾病诊断中的应用，如：

CN 102159951 B专利中公开了利用PLA2R抗原进行自发性膜性肾病(MN)的免疫分析、制备试剂、治疗剂以及诊断和预后评估方法。通过酶联免疫吸附分析、浊度测量免疫分析等免疫分析针对PLA2R为反应性的血清自身抗体，达到对膜性肾病的诊断及预后评估。

WO 2016/012542 A1专利中公开了利用THSD7A抗原进行自发性膜性肾病(MN)的免疫分析、制备试剂、治疗剂以及诊断和预后评估方法。通过酶联免疫吸附分析、浊度测量免疫分析等免疫分析针对PLA2R为反应性的血清自身抗体，达到对膜性肾病的诊断及预后评估。

WO2015185949 A1中公开了对PLA2R的主要抗原表位的多肽序列的研究及其在预防、治疗肾病中的用途。

PLA2R和THSD7A是自发性膜性肾病的两个自身抗原，对自发性MN的检出率分别为70％-75％和5％-10％，单独使用时都有一定的漏检率。因此，急需提供一种能够提高IMN的检出率，增加检测敏感性的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒。该融合蛋白可显著提高IMN的检出率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种融合蛋白，融合蛋白包括与磷脂酶A2受体(PLA2R)至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)至少85％序列同源的第二区。

本研究发现，PLA2R和THSD7A两种抗体在IMN患者中仅有1％同时出现的概率，其余情况是相互排斥的出现的。了解了这一特点之后，本发明利用基因工程的方法构建一个包含PLA2R和THSD7A抗原多肽的融合蛋白，通过这种新蛋白检测MN患者样品中相关自身抗体的水平。该融合蛋白能与来自受试者样品中的相关抗体结合形成抗体-蛋白质复合物，并且该复合物可被测量。

与已有的PLA2R和/或者THSD7A单独检测的方法相比，这种新的融合蛋白抗体的检测能提高自发性MN的检出率，增加检测的敏感性，同时，创造性的提供了一种新颖的针对自发性MN的快速、精确、成本低、安全以及简便的方法。

在本发明提供的一些实施例中，与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于融合蛋白的N端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的C端。

在本发明提供的另一些实施例中，与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于融合蛋白的C端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的N端。

作为优选，融合蛋白包括与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域氨基酸序列相同的第二区。

在本发明提供的一些实施例中，与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区位于融合蛋白的N端，与1型血小板反应蛋白7A域氨基酸序列相同的第二区位于融合蛋白的C端。

在本发明提供的另一些实施例中，与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区位于融合蛋白的C端，与1型血小板反应蛋白7A域氨基酸序列相同的第二区位于融合蛋白的N端。

本发明还提供了编码该融合蛋白的基因。

本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，包括：

1、提取获得人组织的总RNA；

2、利用通用引物制备cDNA；

3、设计PCR引物扩增PLA2R和THSD7A的全长片段；

4、连接PLA2R和THSD7A的全长片段，获得重组基因；所述的重组基因为PLA2R-THSD7A序列或THSD7A-PLA2R序列；

5、将重组基因转入表达载体，表达获得PLA2R-THSD7A融合蛋白或THSD7A-PLA2R融合蛋白。

本发明还提供了该融合蛋白在制备自发性膜性肾病诊断试剂中的应用。

本发明还提供了一种自发性膜性肾病诊断试剂盒，包括本发明制备的融合蛋白。在本发明中，使用该融合蛋白作为抗原，通过基于抗原抗体反应的免疫学方法检测受试者样品中的自发性MN的相关自身抗体水平。

作为优选，自发性膜性肾病诊断试剂盒还包括固相支持物和经过标记的第二抗体。

在本发明提供的实施例中，固相支持物可以为生物载片、多孔平板、测试条、乳胶珠子或微球体。

在本发明提供的实施例中，经过标记的第二抗体的标记物为生物酶、具有荧光化合物或金属的标记物或者具有化学发光化合物的标记物。

本发明还提供了非诊断目的的检测PLA2R抗体和/或THSD7A抗体的方法，包括：

本发明制备的融合蛋白包被固定于固相支持物上；

在适于抗原抗体结合的条件下，使待测样品与固相支持物上的融合蛋白一同温育；

洗涤去除样品中未结合的抗体；

在适于抗原抗体结合的条件下，加入经标记物标记的第二抗体进行温育；

洗涤去除未结合的标记的第二抗体；

将标记物转化为可检测的信号，就检测信号的强弱表示待测样品中PLA2R抗体和/或THSD7A抗体的水平。

在本发明提供的实施例中，待测样品为血液样品，如血清或血浆。

作为优选，待测样品为人的血液样品。

作为优选，第二抗体为特异于人类的检测抗体。

在本发明中，对于标记物的信号转化是利用对特定标记物的显色底物，或者是特定激发光的仪器读取信号。例如：所述检测抗体用辣根过氧化物酶标记，信号转化利用显色底物TMB；所述标记物是荧光化合物，信号转化就通过荧光信号检测仪读取；所述抗体用胶体金标记，信号转化就利用标记物在特定位置大量聚集所产生的肉眼可见的颜色斑点表示。

另外，也可以通过测量免疫反应形成的抗原-抗体复合物所产生的光散射强度，通过比浊法来分析测定样品中相关自身抗体的水平。

本发明的试剂盒可以是ELISA试剂盒，也可以是其他的免疫检测试剂盒。在ELISA试剂盒中包括：在固相支持物上包被过量的本发明所述的融合蛋白；将待测样品添加到固定的融合蛋白上，所述蛋白与相应的待测抗体结合而形成相应的复合物；再与特异于自身抗体的标记二抗结合，最终检测到的标记物的量即可作为样品中所存在的相关自身抗体的度量。

作为优选，试剂盒包含反应区和数据读取区，反应区是指加入样品的反应区域与反应程序，数据读取区是在反应完成或终止之后，利用特定的仪器(酶标仪等)对反应结果的记录。

作为优选，试剂盒进一步包括抗融合蛋白抗体水平的参考值。这个参考值是来自非MN的健康人群的样品中抗融合蛋白抗体的平均水平。相较于这个参考值，样品中检测到的抗体水平越高，提示自发性MN的存在，且程度越深。

本发明的融合蛋白也可用于免疫层析试剂的开发。经典的免疫层析包括：在硝酸纤维素膜上包被固定抗原PT蛋白(本发明融合蛋白)；样品通过样本垫、标记物结合垫和硝酸纤维素膜，最后流过抗原固定的位置时，样品中的对PT有反应的抗体结合了标记二抗大量聚集在相对应的位置，从而显示出肉眼可见的颜色或者可被特定的发光仪器所检测的信号。

其中，包被膜包括但不限于硝酸纤维素膜，样本垫、结合垫为玻璃纤维膜或聚酯膜等。二抗标记物包括但不限于胶体金，还可以是有色的乳胶珠子、荧光微球等。

检测信号的读取方法，对于不同的标记物有不同的信号检测方法，如果二抗是以胶体金标记，则可通过肉眼进行定性的判断；如果标记物是荧光微球，则可通过发光仪器读取数据进行定量的判断。

另外，本发明融合蛋白也可以用于免疫比浊试剂的制备。其包括：来自受试者的样品与所述融合蛋白接触；其中的自发性MN相关的自身抗体与PT蛋白结合形成抗体-蛋白质复合物；测量该复合物形成产生的光散射强度，如果高于对照组中的光散射强度提示有IMN的可能性。所述对照组是确认为非MN患者的健康人群的样品测得的该复合物光散射强度的平均值。

对于其他的实施方式的试剂盒，也可以使用其他检测系统，例如，包含有生物素和亲和素的捕获法检测系统。包括使用固相支持物包被抗人IgG或IgG4；来自受试者样品中的IgG或IgG4被捕获并固定于固相载体；然后与生物素化的所述PT蛋白接触形成二抗--抗体—蛋白.生物素的复合物，最后通过加入亲和素标记的酶和相应的产色底物进行测定定量。

本发明提供了对自发性MN预后评估的方法，该方法包括：先对受试者进行第一次自身抗体水平的检测；随着时间的推移或者治疗进行一定的时间之后，再次对受试者以同等方式取样并检测抗体水平，若检测到的抗体水平较之前低则表示患者正处于IMN症状的缓解中，或者说所进行的治疗是有一定效果的；如果抗体水平未有明显变化，就表示患者症状并未缓解或者说所述治疗没有什么效果，若抗体水平有升高，就提示患者症状可能在恶化，若样品中没有可检测的自身抗体，表示患者有可能痊愈。

其中的治疗是免疫抑制治疗。方法是免疫分析的方法，该方法对在一段时间内获得的、来自受试者的多个样品进行。这些样品在至少两年的时间内每隔两、三个月获得。例如，每三个月从诊断为患有MN的患者采集血液样品，来监视状况的发展或免疫抑制治疗的有效性。每个血液样品的免疫分析的结果被记录，标注样品的日期。每个血液样品的免疫分析的结果与从在三个月之前采集的早先的血液样品获得的结果相比较。它还可以与在开始免疫抑制治疗之前在起初的诊断期间获得的结果相比较。

本发明提供了一种PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒。该融合蛋白包括与磷脂酶A2受体(PLA2R)至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)至少85％序列同源的第二区。本发明具有如下有益效果：

1、本发明制备的融合蛋白综合了PLA2R和THSD7A两个抗原的抗原表位，同时具备了这两种抗原的免疫反应性，且该融合蛋白提高了对自发性MN相关自身抗体的检出率，检出率可达78.1％。

2、该融合蛋白对自发性MN检测的敏感性有显著提高，特异性也很好。

3、相对于传统的带有侵入性的肾组织活检，本发明利用本发明制备的融合蛋白作为抗原制成的试剂或者试剂盒做检测的方法更有利，对受试者的伤害性更小。

附图说明

图1示0.5％的TAE琼脂糖凝胶检测PCR扩增PLA2R和THSD7A全长的电泳结果图；左起第一泳道是PLA2R；第二泳道是10kb的标准分子Marker；第三泳道是THSD7A；由图可见产物大小在4kb-5kb之间，符合预期结果；

图2示胶回收PLA2R和THSD7A序列的电泳结果图；左起第一泳道是PLA2R；第二泳道是10kb的标准分子Marker；第三泳道是THSD7A；

图3示融合PLA2R和THSD7A两个基因表达片段的电泳结果图；左起第一泳道是PLA2R-THSD7A；第二泳道是10kb的标准分子Marker；第三泳道是THSD7A-PLA2R；可见两种融合编码序列大小都接近10kb，符合预期的结果；

图4示SDS-PAGE电泳检测融合重组蛋白的原核表达结果；左起第一泳道为空白对照(未转化的感受态)；第2泳道为PLA2R-THSD7A未诱导的表达；第3泳道是PLA2R-THSD7A诱导表达的电泳结果；第4泳道为THSD7A-PLA2R未诱导的表达；第5泳道是THSD7A-PLA2R诱导表达的电泳结果；第6泳道是300kD的蛋白质标准marker，大小从上到下分别是300kD、250kD、180kD、130kD、100kD、70kD、50kD、40kD；

图5示重组蛋白原核表达结果的Western-Blot检测；左起第一道为PLA2R-THSD7A未诱导的表达；第2泳道是PLA2R-THSD7A诱导表达；第3泳道为THSD7A-PLA2R未诱导的表达；第4泳道是THSD7A-PLA2R诱导表达；第5泳道是300kD的蛋白质标准marker；

图6示SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的原核表达纯化的结果；左起第一泳道是300kD的蛋白质标准marker，大小从上到下分别是300kD、250kD、180kD、130kD、100kD、70kD、50kD、40kD；第2泳道为PLA2R-THSD7A表达蛋白纯化后的结果；第3泳道为THSD7A-PLA2R表达蛋白纯化后的结果；

图7示构建的PLA2R-THSD7A的真核表达载体的示意图；

图8示构建的THSD7A-PLA2R的真核表达载体的示意图；

图9示SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的真核表达结果；左起第一泳道为阴性对照(未转染)；第2泳道为PLA2R-THSD7A转染表达；第3泳道是THSD7A-PLA2R的转染表达；第4泳道是300kD的蛋白质标准marker，大小从上到下分别是300kD、250kD、180kD、130kD、100kD、70kD、50kD、40kD；

图10示本发明融合蛋白真核表达结果的Western-Blot检测；左起第1道阴性对照；第2道是PLA2R-THSD7A的表达检测；第3道为THSD7A-PLA2R的表达检测；第4道是300kD的蛋白质标准marker；

图11示SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的真核表达结果；左起第1泳道为PLA2R-THSD7A的表达纯化结果；第2泳道是THSD7A-PLA2R的表达纯化结果；第3泳道是300kD的蛋白质标准marker，大小从上到下分别是300kD、250kD、180kD、130kD、100kD、70kD、50kD、40kD；

图12示本发明融合蛋白对于IMN的检测率。

具体实施方式

本发明公开了一种PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的PLA2R-THSD7A融合蛋白及其应用和试剂盒中所用生物材料、试剂或仪器均可由市场购得；所用引物均可由生物公司合成。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1融合蛋白的制备

该融合蛋白的制备包括如下步骤：

a、Trizol法提取人组织总RNA；

b、利用通用引物制备cDNA；

c、参考文献，利用计算机及引物设计软件，设计PCR引物并分别扩增PLA2R和THSD7A的全长片段；

d、通过引物附加的酶切位点，将两个全长序列分别连接成PLA2R-THSD7A以及THSD7A-PLA2R两种重组基因编码序列；

e、将以上重组基因序列转入pET SUMO和pcDNA3.1表达载体，分别进行原核和真核表达；

f、SDS-PAGE电泳以及抗标签蛋白抗体WESTERN-BLOT检测表达产物；

g、然后利用阳性抗血清初步测试鉴定；

h、从筛选出与阳性抗血清特异性反应最好的重组蛋白进行扩增表达和纯化，获得所需要的PT融合蛋白。

上述步骤的详细操作为：

一、提RNA

1.1材料准备

无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、1.5mL Eppendorf管(RNase-free)、Tips(RNase-free)

注意：使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品；璃玻和金属物品250℃烘烤3小时以上。

1.2从组织中提取总RNA

1)液氮研磨，取适量肾组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mL Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

2)匀浆：组织样品按50-100mg/mLTrizol加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10％，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。

3)加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。

4)12,000rpm离心5min，弃沉淀。

5)按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器。

6)4℃，12,000g离心15min。

7)吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面。

8)按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

9)4℃，12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

10)按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

11)4℃，8,000g离心5min，尽量弃上清。

12)室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

13)用50μL H₂O或TE buffer溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H₂O或TE buffer均须用DEPC处理并高压。

二、设计PCR引物，并扩增PLA2R和THSD7A的全长基因片段

本申请将构建两种全长的PLA2R和THSD7A融合蛋白，包括以下两种形式：PLA2R-THSD7A和THSD7A-PLA2R。

为了构建上述两种蛋白，首先构建用于克隆上述蛋白编码序列的PCR引物，为了将上述两段编码序列进行2种顺序的整合，本申请设计了带有限制性酶切位点AscI(GGCGCGCC)的引物，通过限制性酶切位点将上述两段蛋白编码序列依据不同的顺序进行连接，从而构建上述两种不同的融合蛋白。

2.1引物设计详情如下：

用于构建PLA2R-THSD7A蛋白的引物见表1：

表1用于构建PLA2R-THSD7A蛋白的引物

用于构建THSD7A-PLA2R蛋白的引物见表2：

表2用于构建THSD7A-PLA2R蛋白的引物

2.2cDNA的制备：本申请使用Taka逆转录试剂盒，操作如下：

1)在无菌的PCR管中依次加入以下试剂：

2)65℃加热5min后，立即冰浴冷却。

3)逆转录反应，向上述PCR管中加入下列试剂：

4)缓慢混匀。

5)按下列反应条件进行逆转录反应：42℃，60min。

6)70℃保温15min，终止反应，﹣20℃保存。

2.3PCR扩增PLA2R以及THSD7A基因全长。

1)作为融合PLA2R-THSD7A的PLA2R和THSD7A的PCR扩增：

反应条件：

2)作为融合THSD7A-PLA2R的PLA2R和THSD7A的PCR扩增：

反应条件：

2.4使用0.5％琼脂糖凝胶检测PCR产物，对照DNA分子量标准，确定获得正确大小的PCR产物；

2.5胶纯化PCR产物，使用S.N.A.P.^TMGel Purification试剂盒从电泳凝胶内纯化PCR片段，步骤如下：

1、在0.5％的TAE琼脂糖凝胶内电泳PCR反应物；

2、电泳完毕，检测并切下特异性的PCR条带，同2倍体积的6M碘化钠混合，65℃加热溶解；

3、加入1.5倍体积的binding buffer；

4、将上述混合液加入S.N.A.P.^TM滤柱，3000g离心1分钟，弃去上清；

5、加入900μL wash buffer，高速离心1分钟，弃去上清；重复本步骤；

用40μL TE或者H₂O洗脱并收集上述纯化产物。

2.6结果图片见图1和图2。由图1-2可知PLA2R和THSD7A基因扩增成功。

三、连接两个基因的全长序列

3.1以扩增出来的PLA2R和THSD7A的基因片段作为模板，分别用不同的引物扩增带有不同酶切位点的4种PCR产物，然后利用酶切+连接反应将上述PCR产物进行配对和组装，从而形成融合蛋白编码序列。反应的体系和条件如下：

1)融合PLA2R-THSD7A的反应体系：

反应条件：

2)融合THSD7A-PLA2R的反应体系：

反应条件：

3.2融合PCR的实验结果见图3。由图3可知，成功融合获得PLA2R-THSD7A和THSD7A-PLA2R融合蛋白基因。

四、重组基因片段的表达

4.1原核表达

4.1.1将上述PCR产物克隆入pET SUMO载体：

1.PCR产物和质粒的连接反应

确定所用PCR产物的量，设置下列反应体系：

2.15℃孵育过夜(至少4小时)，上述连接反应所得产物用于后续感受态细胞的转化。

4.1.2重组蛋白的表达

4.1.2.1BL21(DE3)表达宿主细胞的准备及重组质粒的转化

1、取出感受态细胞BL21(DE3)One在冰上融化；

2、加入5μL约10ng连接产物到上述感受态细胞，轻柔混匀；

3、42℃水浴热激细胞30秒，迅速转移转化细胞到冰浴；

4、加入250μL室温的SOC培养基，盖好管盖，37℃水平摇菌1小时(200rpm)；

5、加入上述全部的转化培养物到含有50μg/mL kanamycin的LB培养基中，37℃水平摇菌过夜培养(200rpm)；

6、分析阳性克隆

挑选10个菌落接种入含有合适抗生素(50μg/mL kanamycin)的LB液体培养基，过夜培养，收集培养物利用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒；

7、通过限制性内切酶酶切分析所抽提质粒，选取酶切符合预期的质粒，进行测序确认插入序列。

4.1.2.2Pilot表达

1、取上述培养物500μL加入含有50μg/mL kanamycin的10mL LB培养液中；

2、37℃摇菌培养2小时，当OD600值达到0.4-0.6，取上述培养物分平均分为2管，每管各5mL；

3、加入诱导剂IPTG到终浓度1mM至其中一个培养管内。从上述2管培养液中分别取500μL，高速离心取沉淀，冻存上述沉淀作为诱导表达0小时的样本；继续培养上述培养物，每2小时取500μL样本，离心取沉淀；

4、表达产物的检测：取上述样本40μL重悬于10μL 5X SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸，取5-10μL进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测蛋白条带。同时利用Anti-His IgG抗体对上述标本进行western-blot确认重组表达蛋白。

4.1.2.3重组蛋白的纯化

1)扩大表达

1、将转化重组质粒的BL21(DE3)接种到50μg/mL canamycin的10mL LB培养基中；

2、37℃摇菌(225-250rpm)过夜培养直到OD600＝1-2；

3、次日，取上述培养液1mL接种至50mL含50μg/mL kanamycin的LB培养液中，如果实验需要，也可以按照上述比例调整培养液体积，上述培养液最多可以接种到500mL LB培养液里，但后续的纯化凝胶体积也需要相应调整。

4、37℃摇菌(225-250rpm)直到OD₆₀₀＝～0.5(2-3小时)；

5、在上述培养液里加入IPTG至终浓度1mM；

6、37℃摇菌直到PILOT表达优化的表达时间(4小时)，停止培养，低温4℃离心收集菌液；

7、SDS-PAGE及western-blot检测目的条带，验证重组蛋白的表达。

2)western-blot检测验证目的条带

1.将SDS-PAGE电泳的样本转印至硝酸纤维素膜上。转印条件：120mA，2h；

2.丽春红染色确认转膜成功；

3.NC膜的封闭：用5％的脱脂奶粉封闭膜1h，然后用PBST洗5次；

4.加一抗：Anti-His IgG抗体先用PBST以1:2000稀释，然后加到膜上，孵育1h；

5.用PBST洗涤NC膜5次；

6.加入发光底物ECL：500μL A液和500μL B液混合之后加入，反应3min；

7.移入荧光成像系统检测。

3)纯化重组蛋白

由于重组蛋白的N基端连接有6×His，因此本申请可以通过金属螯合凝胶如ProBond^TM或者Ni-NTA在非变性条件下纯化重组蛋白。具体操作过程如下：

1.试剂准备：

胶柱平衡缓冲液：Ni-Native-0：50mM NaH2PO4，300mM NaCl；

洗脱液：Ni-Native-250：平衡缓冲液中含250mM咪唑，

2.样品准备：取出表达产物(菌液)，12000rpm，4℃离心10min，取上清液；

3.准备凝胶柱：流出凝胶柱内的保存液，加入15mL Ni-Native-0缓冲液平衡凝胶柱，控制流速1mL/min；

4.上样：按1:1混匀样品和Ni-Native-0，之后加入凝胶柱，收集滤出物；

5.洗脱：先用5mL Ni-Native-0缓冲液洗涤层析柱，然后分别加入2倍体积的Ni-Native-250洗脱液洗脱层析柱，收集洗脱液；

6.用完的层析柱用10mL Ni-Native-0洗涤平衡；

7.收集到的重组纯化蛋白用10KD的超滤离心管进行浓缩。

8.SDS-PAGE电泳检测纯化结果。

4.1.2.4SUMO蛋白酶消化去除小泛素样修饰蛋白(SUMO)

1.酶切反应体系

1、混匀上述反应体系30℃孵育；

2、1、2、4和6小时的时候取20μL反应物；

3、加入20μL2×SDS上样缓冲液，取30μL使用SDS-PAGE电泳检测样本。

4、过柱收集：消化好的重组蛋白可以使用ProBond^TMor Ni-NTA分离去除SUMO，操作步骤同纯化的步骤。

4.1.3原核表达实验结果检测见图4-6。由图4-6可知，成功获得PLA2R-THSD7A和THSD7A-PLA2R融合蛋白。

4.2真核表达

4.2.1将步骤三中得到的PCR产物(PLA2R-THSD7A和THSD7A-PLA2R两种融合基因片段)分别克隆入pcDNA3.1载体，构建PLA2R-THSD7A和THSD7A-PLA2R的表达载体示意图见图7、8，操作步骤如下：

1.对PCR产物进行双酶切：

根据引物中带有NotI和XhoI两个酶切位点进行酶切：

37℃反应12h。

2.载体pcDNA3.1提取质粒后，也按照以上的体系进行双酶切，时间为8h。

3.将酶切后的目的片段和载体均取2 μL进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。

4.连接：目的片段：载体＝6：1，15μL体系。

5.转化E.coli，并于50μg/mL氨苄的LB培养基培养；

6.酶切检测并分析转化结果；

7.选择正确的转化子测序验证克隆结果；

8.转入哺乳动物细胞表达。

4.2.2真核细胞表达操作步骤

4.2.2.1材料准备

过滤除菌的重组质粒，真核细胞expi293(悬浮细胞)，预热的Expi293表达培养基，预热的限制性培养基opti-MEM，Expi293F转染试剂盒(包括：lipofectamine 293试剂，enhancer1,enhancer2)。

4.2.2.2操作流程

不同转染体系如下：

表3转染体系

*转染开始时细胞密度为2.5×10⁶cells/mL，细胞活力>95％。

*转染不需要更换培养基。

转染前一天：计算对应体系所需的细胞数，直接稀释传代令细胞密度为2.0×10⁶cells/mL，过夜培养。

转染当天：

1.检查细胞密度和细胞活力：细胞活力需>95％；细胞密度>3×10⁶cells/mL)。

2.计算所需的细胞悬液体积。

3.将培养瓶放入培养箱备用。

4.分别混合①质粒DNA&opti-MEM和②lipofectamine&opti-MEM，静置5分钟。

*使用lipofectamine前先轻轻混匀。

5.混合①和②，室温静置30分钟。

6.将混合物加入培养瓶。

7.将培养瓶放入培养箱培养。

转染后16-18小时：

8.向培养瓶加入enhancer1和enhancer2。

转染后48小时：离心(2,000rpm；5分钟)分离细胞，保留上清。

4.2.2.3表达产物的检测

取上述样本40μL重悬于10μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸，取5-10μL进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测蛋白条带。同时利用Anti-His IgG抗体对上述标本进行western-blot确认重组表达蛋白。

4.2.2.4重组蛋白的纯化

由于重组蛋白的N基端连接有6×His，因此本申请可以通过金属螯合凝胶如ProBond^TM或者Ni-NTA在非变性条件下纯化重组蛋白。操作步骤如下：

1.试剂准备：

胶柱平衡缓冲液：Ni-Native-0：50mM NaH2PO4，300mM NaCl；

洗脱液：Ni-Native-250：平衡缓冲液中含250mM咪唑；

6.用完的层析柱用10mL Ni-Native-0洗涤平衡；

7.收集到的重组纯化蛋白用10KD的超滤离心管进行浓缩。

8.SDS-PAGE电泳检测纯化结果。

4.2.3真核表达相关图片见图9-11。由图9-11可知，成功获得PLA2R-THSD7A和THSD7A-PLA2R融合蛋白。

实施例2PT蛋白在诊断自发性MN方面的应用

使用复合蛋白PT作为抗原检测受试者自发性MN相关的自身抗体的ELISA方法：

使用PT复合蛋白通过ELISA方法检测自发性MN相关自身抗体包括：包被缓冲液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液(其中Na₂CO₃ 1.59g/L，NaHCO₃2.93g/L)，封闭液(BSA 10g/L，蔗糖50g/L)，洗涤液为含Tween-20，pH7.6的TBS(NaCl 8.7g/L，Tris 2.4g/L)，样品稀释液(Tris 1.21g/L，BSA 10g/L，Tween-20 0.05％)，显色液为TMB(3,3",5,5"-四甲基联苯胺)，终止液为2M的硫酸。二抗稀释液(Tris 1.2083g/L，BSA 10g/L，Tween-20 0.05％)，阳性对照和阴性对照分别是IMN患者血清及非IMN患者的健康人血清。

96孔板为Nuc96孔板，BSA购自Sigma试剂公司。

检测步骤如下：

(1)包被：用包被缓冲液将抗原稀释至1.45μg/mL，向96孔板中每孔加入100μL，4℃包被16h。弃去孔内包被液，然后加300μL洗涤液，洗涤3次，每次1min。

(2)封闭：向每孔中加入150μL的封闭液，室温封闭1h，弃液。加300μL洗涤液，洗涤3次，每次1min。

(3)加样：将阴性和阳性对照血清、以及待测样品分别用样品稀释液稀释101倍之后，每孔100μL加入阴性、阳性对照孔以及待测孔中检测。

(4)温育：室温反应30min。加300μL洗涤液，洗涤3次，每次1min。

(5)加酶标二抗：每孔加入100μL酶标抗体(二抗稀释液稀释6000倍)。

(6)温育：室温反应30min。加300μL洗涤液，洗涤3次，每次1min。

(7)显色：每孔加入显色剂100μL，室温避光反应15min。

(8)终止：每孔加入终止液100μL，混匀。

(9)测定：30min内，以450nm波长检测每孔OD值。

(10)结果判定：待检孔的OD值/阴性孔的OD平均值大于或等于2.1可判定为阳性。且值越大阳性越强。

实验结果见表4和5。表4是阴性样本的OD值，其中阴性样本是非膜性肾病的健康者血清。表5是阳性样本的OD值，其中阳性样本是经组织活检确诊为自发性MN患者的血清。

表4阴性样本OD值结果

编号	1	2	3	4	5
						A	0.038	0.039	0.055	0.058	0.035
B	0.038	0.04	0.048	0.04	0.058
						C	0.054	0.038	0.041	0.044	0.049
D	0.058	0.034	0.042	0.043	0.056
						E	0.033	0.035	0.04	0.031	0.043
F	0.044	0.038	0.046	0.038	0.054
						G	0.034	0.045	0.045	0.042	0.042
H	0.05	0.035	0.05	0.065	0.046

表5阳性样本OD值结果

编号	1	2	3	4	5
						A	0.699	0.723	0.348	0.747	0.553
B	0.469	0.345	0.343	1.207	0.35
						C	0.684	1.513	0.497	1.496	0.271
D	0.322	0.327	0.206	0.394	0.326
						E	0.318	0.477	0.393	0.337	0.304
F	0.478	0.818	0.684	0.338	0.27
						G	0.334	0.21	0.504	0.93	0.379
H	1.045	1.487	0.421	0.281	0.764

由实验结果可见，利用本发明的PT蛋白做抗原，能够区分阴性样品和不同程度的阳性样品，可以分辨自发性MN和其他疾病的患者。

实施例3临床检测应用

采用实施例2的方法分别检测自发性MN患者、继发性MN患者、其他疾病患者及正常人血清。对于41例临床自发性MN患者，10例继发性MN患者，10例其他疾病患者，以及40例正常人血清的检测结果见表6、图12。

同时采用PLA2R和THSD7A作为对照。

表6本发明融合蛋白与PLA2R、THSD7A对受试者检测结果的比较

结果显示，采用本发明融合蛋白对于自发性MN患者的检出率为78.1％，对于继发性MN患者、其他疾病患者及正常人血清的检出率均为0％。结果表明，本发明融合蛋白对自发性MN检测的敏感性有显著提高，特异性也很好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于所述融合蛋白的N端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于所述融合蛋白的C端。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述与磷脂酶A2受体至少85％序列同源的第一区位于所述融合蛋白的C端，与1型血小板反应蛋白7A域至少85％序列同源的第二区位于所述融合蛋白的N端。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括与磷脂酶A2受体氨基酸序列相同的第一区和与1型血小板反应蛋白7A域氨基酸序列相同的第二区。

5.编码如权利要求1至4中任一项所述融合蛋白的基因。

6.如权利要求1至4中任一项所述融合蛋白在制备自发性膜性肾病诊断试剂中的应用。

7.一种自发性膜性肾病诊断试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的自发性膜性肾病诊断试剂盒，其特征在于，还包括固相支持物和经过标记物标记的第二抗体。

9.根据权利要求8所述的自发性膜性肾病诊断试剂盒，其特征在于，所述固相支持物为生物载片、多孔平板、测试条、乳胶珠子或微球体。

10.根据权利要求8所述的自发性膜性肾病诊断试剂盒，其特征在于，所述标记物为生物酶、具有荧光化合物或金属的标记物或者具有化学发光化合物的标记物。