CN104215761A - 检测血清中抗gp73抗体的试剂盒 - Google Patents
检测血清中抗gp73抗体的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,属于医药生物技术领域。所述试剂盒包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液,其中,所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本发明可以准确计算出患者血清内的抗GP73抗体的浓度,真实反应出血清中抗GP73抗体的存在水平,可以应用于临床对原发性肝癌进行诊断,通过对抗GP73抗体水平进行检测,还能反映肿瘤自身分子变化的过程,从而判断患病机体的自身免疫反应能力。本发明的试剂盒还具有特异性良好,灵敏度、准确性和精密度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域,具体地说,是涉及一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,以及使用该试剂盒检测肝癌患者血清标记物抗GP73抗体的检测方法。
背景技术
肝癌发病率在全世界是位列第四位、中国位列第二的恶性肿瘤,且在世界范围内呈逐年上升趋势,现总发病率已超过56万。肝癌发病之初较为隐匿,临床难以检出,临床诊断检出一般多为晚期,治疗效果差,如若早期发现肝癌并且及时治疗可以提高患者的5年存活率,因此肝癌的早期发现具有重要的临床意义。
目前肝癌的检测手段包括肝超声影像分析和血清学标志物检测,其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白(AFP),但是AFP在早期肝癌诊断中灵敏度不高,只有50%~60%的肝癌患者AFP呈阳性,并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此临床上需要获得比甲胎蛋白(AFP)特异性和灵敏度更高的新血清学指标,或者能与AFP进行互补的指标。
近年来,蛋白组学技术的发展使得高通量筛选新的肿瘤标志物成为可能,各种有前景的新肿瘤标志物被相继发现,其中高尔基体蛋白GP73最有可能成为更好的肝癌诊断,尤其是早期肝癌诊断的血清标志物。
目前已经有多个研究组验证了GP73是一种新的肝癌标志物,并有用ELISA方法检测血清中肿瘤相关标记物GP73蛋白含量的报道。专利申请号为200910041621的中国专利还公开了一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法及其检测试剂盒,提高了检测GP73的灵敏度和特异性。
虽然针对肝癌病人血清中GP73自身蛋白的检测已有相关报道,但当肝癌组织释放肿瘤相关标记物GP73蛋白到血液后,机体对该蛋白产生免疫反应产生抗体的情况如何,机体针对该蛋白产生抗体对肝癌的诊断有何作用还未见报道。检测抗体不仅反映的是肿瘤自身分子变化的过程,更重要的是反映患病机体的自身免疫反应能力,对后期的诊断和治疗都具有重要意义。
发明内容
本发明的发明目的在于:利用ELISA技术建立一种检测患者血清中抗GP73抗体的试剂盒,通过检测抗体的水平可以了解患者自身的免疫能力,对肝癌的诊断和治疗具有重要意义,以弥补现有技术的研究空白。
本发明实现上述目的采用的技术方案如下:
提供一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液,其中,所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
其中,上述GP73蛋白抗原的制作方法为:通过构建GP73基因工程重组载体,利用基因工程技术表达、纯化his-GP73蛋白抗原片段而制得GP73蛋白抗原,其具体步骤如下:
(1)根据GP73蛋白抗原基因设计引物,包括上游引物
5'-GGAACGGTACCCACC
ATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3',下游引
5'-GGAACGTCGAC
TCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCAAGTAAATT-3',RT-PCR扩增GP73基因,步骤是:取无菌PCR管,依次加入2×TaqMasterMix25μl,上游引物和下游引物各2μl,HepG2细胞总RNA的逆转录产物1μl,ddH2O补足至50μl;将加好的各PCR管轻微离心混匀,放至PCR仪进行反应,目的片段大小为330bp;
反应条件:95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环,72℃终延伸5min,反应完毕,取3μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定;
(2)将扩增的GP73基因和表达质粒pColdIII经过限制性内切酶后,用T4DNA连接酶构建重组质粒;
(3)重组子筛选与鉴定:重组子经蓝白斑筛选、菌落PCR、双酶切鉴定、测序后,测序后与GenBank中序列比对确认基因序列是否正确;
(4)GP73目的蛋白表达及鉴定:将pColdIII-GP73重组质粒转化E.coli.BL21,诱导表达条件为37℃过夜培养菌液,OD600达到0.4-0.5时,冷却到15℃并放置45min,加入终浓度0.5mM的IPTG,15℃诱导24h;SDS-PAGE鉴定GP73蛋白是否成功表达;
(5)GP73目的蛋白纯化:将IPTG诱导表达的基因工程菌超声破菌,离心,收集上清过Ni-NTA亲和层析柱,电泳鉴定目的蛋白纯度,Bradford法测定蛋白浓度。
进一步地,上述酶标的GP73蛋白抗原的制作方法具体过程如下:
(1)HRP标记试剂盒(商品化试剂盒,武汉三鹰公司产品,-20℃贮存),室温条件下平衡30分钟,使反应启动液和反应终止液充分解冻后混匀;
(2)向每10μl待标记抗原溶液中加入1μl反应启动液,用移液枪反复吹打若干次以充分混匀,避免产生气泡;
(3)打开辣根过氧化酶管盖,将上述已启动抗原溶液直接加到该管中,用移液枪反复吹打若干次以充分混匀,避免产生气泡,室温放置3小时;
(4)向辣根过氧化酶反应管中加入反应终止液,比例为每10μl抗原溶液加入1ml反应终止液,充分混匀,室温放置1小时;
(5)终止完成后,加入与反应管内反应液等体积的甘油,充分混匀,置于-20℃保存。
优选地,所述包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
优选地,所述显色液包括A液和B液,A液是称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺17.2mg,加二甲基亚砜1ml溶解,然后加0.1mol/L,pH5.5的醋酸钠缓冲液66ml制得;B液是取双蒸水100ml,加30%H2O217微升制得,显色液使用时将A液和B液等体积混匀即可。
所述洗涤液包含0.02mol/LpH7.4的PBS,0.05%Tween-20。
所述稀释液为0.01mol/lPBS,终止液为2MH2SO4溶液。
本发明还提供了使用上述试剂盒检测血清中抗GP73抗体含量的检测方法,所述方法包括以下步骤:
(1)将兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)用0.01mol/lPBS稀释液稀分别释成160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL五个浓度,或将待测病人血清稀释5倍;
(2)制作吸光度与抗体浓度关系标准曲线:
①包被:用包被缓冲液0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将GP73蛋白抗原稀释到4ng/ml,4℃包被过夜。
②封闭:洗涤液洗板,拍干,用封闭液0.5%牛血清白蛋白BSA封闭1h。
③加入标准品蛋白或样品:洗涤液洗板,拍干,向包被板的微孔中加入上述不同稀释浓度的兔抗人GP73多克隆抗体标准品50μl或稀释的病人血清50μl,重复2孔,用封板膜封板后置37℃温育30min。
④加入酶标GP73抗原:洗涤液洗板,拍干,每孔加入酶标GP73蛋白抗原50μl,空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min。
⑤显色:洗涤液洗板,拍干,每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
⑥终止:每孔加终止液50μl,终止反应。
⑦测定OD值:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
⑧绘制浓度和吸光度标准曲线:以吸光度为横坐标,GP73多抗浓度为纵坐标,绘制吸光度随GP73多抗浓度变化的标准曲线,将待测样品吸光度值代入标准曲线即可求出病人血清标本中的抗GP73抗体浓度值。
本发明人在研究过程中,为了确定血清中抗GP73抗体的水平与肝癌发病的关系,用该试剂盒检测了100例正常对照组、100例肝炎、肝硬化组(即良性肝病组)、127例原发性肝癌组血清的GP73抗体,结果这三组抗体浓度分别为46.36±13.18ng/ml,140.34±18.38ng/ml,259.23±86.72ng/ml。原发性肝癌患者血清中GP73抗体浓度显著高于正常组和肝炎、肝硬化组(P<0.05),因此GP73抗体可以作为原发性肝癌诊断和筛查的指标,测试GP73抗体水平为肝癌的诊断和筛查提供了一种新的可靠和有效的方法。
由于采用上述技术方案,本发明的有益效果为:
(1)利用基因工程技术成功表达GP73蛋白抗原,并成功对GP73抗原进行HRP标记,所得GP73蛋白抗原与抗His鼠源单克隆抗体和抗GP73抗体都能特异性结合,将其运用于抗GP73抗体的检测,具有很高的医学价值。
(2)提供了一种检测患者血清中抗GP73抗体的试剂盒,弥补了现有技术的空白。使用本发明的抗GP73抗体检测试剂盒可以准确计算出患者血清内的抗GP73抗体的浓度,能真实地反应出血清中抗GP73抗体的存在水平,可以应用于临床对原发性肝癌进行诊断,通过对抗GP73抗体水平进行检测,还能反映肿瘤自身分子变化的过程,从而判断患病机体的自身免疫反应能力。本发明的试剂盒特异性良好,灵敏度达77.4%、准确性达84.58%,相比于AFP的敏感性50-60%,本发明的试剂盒有显著提高。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明,其中:
图1为纯化的GP73蛋白的SDS-PAGE电泳图,其中,M为标准蛋白;1:没有经柱层析纯化的样品溶液;2:样品上层析柱后,未结合在层析柱上的杂蛋白流出液;3:用不含咪唑的洗脱液洗脱出来的蛋白;4-9:分别用含有20mM,40mM,60mM,80mM,100mM,150mM咪唑的洗脱液洗脱出来的蛋白。
图2为基因工程表达的GP73蛋白与抗GP73抗体结合的WesternBlot分析结果,其中,M:蛋白标记物;
1:pColdIII-GP73基因重组质粒转染Transetta(DE3)工程菌,未经IPTG诱导的蛋白分析;
2:pColdIII-GP73基因重组质粒转染Transetta(DE3)工程菌,经IPTG诱导后的蛋白分析;
3:pColdIII-GP73基因重组质粒转染BL21工程菌,未经IPTG诱导目的蛋白分析;
4:pColdIII-GP73基因重组质粒转染BL21工程菌,经IPTG诱导后目的蛋白分析;
5:空质粒pColdIII转染Transetta(DE3)工程菌,未经IPTG诱导的蛋白分析;
6:空质粒pColdIII转染Transetta(DE3)工程菌,经IPTG诱导后的蛋白分析;
7:空质粒pColdIII转染BL21工程菌,未经IPTG诱导的蛋白分析;
8:空质粒pColdIII转染BL21工程菌,经IPTG诱导后的蛋白分析。
图3为吸光度随兔抗人GP73多克隆抗体标准品浓度变化的标准曲线。
图4为GP73自身抗体在正常组、良性肝病组、原发性肝癌组的表达值(ng/ml)。
具体实施方式
本发明提供了一种检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液。本发明试剂盒自主创新的两个试剂是GP73蛋白抗原和酶标抗原。抗原是发明人通过基因工程技术表达纯化出来,酶标抗原是自主标记。其余试剂为商品化试剂。
本发明的一些实施方案中,会提供GP73蛋白抗原的制备方法。
酶标的GP73蛋白抗原是用辣根过氧化酶标记GP73而获得的,在本发明的一些实施方案中,还提供酶标的GP73蛋白抗原的具体制备过程。
本发明的一些实施方案中,还提供了利用该抗GP73抗体的试剂盒的来检测肝癌患者血清中抗GP73抗体浓度的检测方法。
以下通过具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1检测血清中抗GP73抗体的试剂盒的制备方法
1、制作GP73蛋白抗原
本发明的试剂盒中的GP73蛋白抗原是由人工合成,构成GP73蛋白的氨基酸序列表如SEQIDNO:1所示。本发明中GP73蛋白抗原的制备过程如下:
(1)根据GP73蛋白抗原的基因设计引物,包括上游引物SEQIDNO:3:5'-GGAACGGTACCCACCATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3',下游引物SEQIDNO:4:5'-GGAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCA
AGTAAATT-3',用RT-PCR扩增GP73基因,具体步骤是:取无菌PCR管,依次加入2×TaqMasterMix25μl,上游引物和下游引物各2μl,HepG2细胞总RNA的逆转录产物1μl,ddH2O补足至50μl;将加好的各PCR管轻微离心混匀,放至PCR仪进行反应,目的片段大小为330bp;反应条件:95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环,72℃终延伸5min,反应完毕,取3μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定;
(2)将扩增的GP73基因和表达质粒pColdIII经过限制性内切酶后,用T4DNA连接酶构建重组质粒;
(3)重组子筛选与鉴定:重组子经蓝白斑筛选、菌落PCR、双酶切鉴定、测序。测序结果表明基因提取完全正确,证实成功构建pColdIII-GP73重组质粒;
(4)GP73目的蛋白表达及鉴定:将pColdIII-GP73重组质粒转化E.coli.BL21,最佳诱导表达条件为37℃过夜培养菌液,OD600达到0.4-0.5时,冷却到15℃并放置45min,加入终浓度0.5mM的IPTG,15℃诱导24h,SDS-PAGE鉴定发现目的蛋白主要出现在上清中,说明GP73蛋白主要以可溶性形式表达电泳结果见图1所示,显示用60mM和80mM咪唑进行洗脱时目的蛋白纯度最高。
(5)GP73目的蛋白纯化:将IPTG诱导表达的基因工程菌超声破菌,离心,收集上清过Ni-NTA亲和层析柱,电泳鉴定目的蛋白纯度可达85%;质谱鉴定证实所获得蛋白为His-GP73融合蛋白;用Bradford法进行浓度测定测得蛋白浓度为57ng/μl;
westernblot结果显示目的条带与抗His鼠源单克隆抗体和抗GP73抗体都能特异性结合(如图2所示),表明表达纯化的GP73蛋白具有抗原性,图中还可以看出,pColdIII-GP73基因重组质粒经IPTG诱导后,有较多目的蛋白与抗GP73抗体结合。
2、制备酶标的GP73抗原
本发明优选采用辣根过氧化酶标记GP73抗原,其制作的具体过程如下:
(1)HRP标记试剂盒(商品化试剂盒,武汉三鹰公司产品,-20℃贮存),室温条件下平衡30分钟,使反应启动液和反应终止液充分解冻后混匀;
(2)向每10μl待标记抗原溶液中加入1μl反应启动液,用移液枪反复吹打若干次以充分混匀,避免产生气泡;
(3)打开辣根过氧化酶管盖,将上述已启动抗原溶液直接加到该管中,用移液枪反复吹打若干次以充分混匀,避免产生气泡,室温放置3小时;
(4)向辣根过氧化酶反应管中加入反应终止液,比例为每10μl抗原溶液加入1ml反应终止液,充分混匀,室温放置1小时;
(5)终止完成后,加入等体积的甘油,充分混匀,置于-20℃保存。
3、试剂盒其他溶剂的配制:
兔抗人GP73多克隆抗体标准品:浓度为320ng/ml,购于武汉三鹰生物技术公司;
封闭液:0.5%牛血清白蛋白(BSA);
包被缓冲液:0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6);
显色液:包括A液和B液。A液的制备:称取TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)17.2mg,加DMSO(二甲基亚砜)1ml溶解,然后加醋酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH5.5)66ml。B液的制备:取双蒸水100ml,加30%H2O2(双氧水)17微升。使用时A:B液等体积混匀即可。
洗涤液:0.02mol/LPBS(pH7.4),0.05%Tween-20;
终止液:2mol/L硫酸溶液;
稀释液:0.01mol/lPBS。
实施例2检测血清中抗GP73抗体的试剂盒的使用方法
本发明还提供使用上述试剂盒检测血清中抗GP73抗体含量的检测方法,所述方法包括以下步骤:
(1)将兔抗人GP73多克隆抗体标准品(320ng/ml)用0.01mol/lPBS稀释液稀分别释成160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL五个浓度。
(2)制作吸光度与抗体浓度关系标准曲线:
①包被:用包被缓冲液0.5%牛血清白蛋白(BSA)将GP73蛋白抗原稀释到4ng/ml,4℃包被过夜。
②封闭:洗涤液洗板,拍干,用0.5%BSA封闭1h。
③加入标准品蛋白:洗涤液洗板,拍干,向包被板的微孔中加入上述不同稀释浓度的兔抗人GP73多克隆抗体标准品50μl,重复2孔,用封板膜封板后置37℃温育30min。
④加入酶标GP73蛋白抗原:洗涤液洗板,拍干,每孔加入酶标GP73蛋白抗原50μl,空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min。
⑤显色:洗涤液洗板,拍干,每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
⑥终止:每孔加终止液50μl,终止反应。
⑦测定OD值:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
⑧绘制浓度和吸光度标准曲线:以吸光度为横坐标,GP73多抗浓度为纵坐标,绘制吸光度随GP73多抗浓度变化的标准曲线,如图2所示。
在使用试剂盒检测待测病人血清中抗GP73抗体时,将待测病人血清用稀释液稀释5倍,将上述步骤③中加入标准品蛋白换成加入待测病人血清稀释液50μl进行测试,测得吸光度值。将待测样品吸光度值代入标准曲线即可求出病人血清中抗GP73抗体浓度。
实施例3试剂盒对正常人标本,肝炎、肝硬化标本,以及肝癌标本的检测结果
发明人用该试剂盒检测了100例正常对照组,100例肝炎、肝硬化组(即良性肝病组),127例原发性肝癌组血清的GP73抗体,结果这三组抗体浓度分别为46.36±13.18ng/ml,140.34±18.38ng/ml,259.23±86.72ng/ml,如图3所示。原发性肝癌患者血清GP73抗体浓度显著高于正常组和肝炎、肝硬化组(P<0.05),肝炎、肝硬化患者血清GP73抗体浓度与正常组之间也有显著的统计学差异(P<0.05)。
以正常组作为肝癌对照组,按照正常人平均检测值加上正负3个标准差(x±3sd)界定异常血清临界值(cutoff值),则cutoff值为85.90ng/ml;根据这一界定标准,划分出阳性血清标本,100例良性肝病组和127例原发性肝癌血清中全为阳性,100例正常人血清有0例阳性,其敏感性、特异性和准确度均为100%。
以肝炎肝硬化即肝病组作为对照组,按照肝病病人x±3sd界定肝癌血清阳性值(cutoff值),则cutoff值为为195.48ng/ml,根据这一界定标准,127例肝癌有35例小于195.48ng/ml,92例大于195.48ng/ml。即127例肝癌患者检出率为92例,其敏感性、特异性和准确度分别为77.4%、100%、84.58%。
本试剂盒的精密度测试:
取标准品抗体160ng/ml,进行同一批次8次重复实验,计算结果分别是:161.706ng/ml、162.837ng/ml、162.278ng/ml、162.538ng/ml、163.179ng/ml、161.432ng/ml、161.789ng/ml、162.835ng/ml。
标准差SD=0.628722
平均值X=162.32425
变异系数=0.628722/162.32425X100%=0.38%
取标准品抗体160ng/ml,进行4批次实验,每批次计算平均值分别是:162.271ng/ml,162.408ng/ml,162.908ng/ml,162.312ng/ml,计算其变异系数为0.18%。
综上所述,本发明的试剂盒可以用于检测患者血清内的抗GP73抗体的浓度,能真实地反应出血清中抗GP73抗体的存在水平,可以应用于临床对原发性肝癌进行诊断,从而判断患病机体的自身免疫反应能力,对肝癌的治疗也有参考价值。本发明的试剂盒在测试血清中抗GP73抗体是,具有特异性良好,敏感性、准确性和精密度高的优点。
Claims (7)
1.检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,其特征在于:包括GP73蛋白抗原、封闭液、酶标的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗体标准品、包被缓冲液、显色液、洗涤液、终止液、稀释液,其中,所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,其特征在于所述GP73蛋白抗原的制备步骤如下:
(1)根据GP73蛋白抗原基因设计引物,包括上游引物5'-GGAACGGTACCCACCATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3',下游引物5'-GGAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCAAGTAAATT-3',RT-PCR扩增GP73基因,步骤是:取无菌PCR管,依次加入2×TaqMasterMix25μl,上游引物和下游引物各2μl,HepG2细胞总RNA的逆转录产物1μl,ddH2O补足至50μl;将加好的各PCR管轻微离心混匀,放至PCR仪进行反应,目的片段大小为330bp;反应条件:95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环,72℃终延伸5min,反应完毕,取3μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定;
(2)将扩增的GP73基因和表达质粒pColdIII经过限制性内切酶后,用T4DNA连接酶构建重组质粒;
(3)重组质粒筛选与鉴定:重组质粒用蓝白斑筛选、菌落PCR、双酶切鉴定、测序后与GenBank中序列比对确认基因序列是否正确;
(4)GP73目的蛋白表达及鉴定:将pColdIII-GP73重组质粒转化E.coli.BL21,诱导表达条件为37℃过夜培养菌液,OD600达到0.4-0.5时,冷却到15℃并放置45min,加入终浓度0.5mM的IPTG,15℃诱导24h;SDS-PAGE鉴定GP73蛋白是否成功表达;
(5)GP73目的蛋白纯化:将IPTG诱导表达的基因工程菌超声破菌,离心,收集上清过Ni-NTA亲和层析柱,电泳鉴定目的蛋白纯度,Bradford法测定蛋白浓度。
3.根据权利要求1所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,其特征在于:所述酶标GP73蛋白抗原的制作过程如下:
(1)将辣根过氧化酶(HRP)标记试剂盒在室温条件下平衡30分钟,使反应启动液和反应终止液充分解冻后摇匀;
(2)向每10μl待标记GP73蛋白抗原溶液中加入1μl反应启动液,用移液枪反复吹打若干次以充分混匀,避免产生气泡;
(3)打开辣根过氧化酶反应管盖,将上述已启动GP73蛋白抗原溶液直接加到该管中,用移液枪反复吹打若干次以充分混匀,避免产生气泡,室温放置3小时;
(4)向辣根过氧化酶反应管中加入反应终止液,比例为每10μl抗原溶液加入1ml反应终止液,充分混匀,室温放置1小时;
(5)终止完成后,加入与反应管内反应液等体积的甘油,充分混匀,置于-20℃保存。
4.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,其特征在于:所述包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
5.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,其特征在于:所述显色液包括A液和B液,A液是称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺17.2mg,加二甲基亚砜1ml溶解,然后加0.1mol/L,pH5.5的醋酸钠缓冲液66ml制得,B液是取双蒸水100ml,加30%H2O217微升制得。
6.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,其特征在于:所述洗涤液包含0.02mol/LpH7.4的PBS,0.05%Tween-20。
7.根据权利要求2所述的检测血清中抗GP73抗体的试剂盒,其特征在于:所述稀释液为0.01mol/lPBS。
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