CN116199795A - 融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种融合蛋白及其用途。所述融合蛋白包括：中性抗体，所述中性抗体包括抗体FC区段或第一抗体，一个或多个PLA2R抗原表位肽，所述PLA2R抗原表位肽与所述中性抗体相连；其中，所述抗体包括选自下列至少之一的CDR序列：轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3、SEQ ID NO:7～9和SEQ ID NO:83～85，重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4～6、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:86～88和SEQ ID NO:89～91。本发明的融合蛋白可特异性地结合PLA2R抗体。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及药物领域，具体地，本发明涉及一种融合蛋白及其用途，更具体地，本发明涉及一种融合蛋白及其核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物和用途。
背景技术
膜性肾病(membranous nephropathy,MN)即膜性肾小球肾炎，具体是指免疫复合物在肾小球毛细血管中过度沉积导致的肾病综合征，是成人肾病综合征中最常见的病理类型之一，全球发病率约为12/100万(Mc Grogan A,Franssen CF,de Vries CS.NephrolDial Transplant.2011；26(2):414-430)。近年来MN的发病率以每年13％的速度增长(Lwezaula BF,Ameh OI,Ekrikpo UE,et al.BMC Nephrol.2021；22(1):15)，已成为导致慢性肾小球肾炎的第二大原因。临床上MN主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿及高脂血症，诊断依赖于肾脏活检组织病理学检查，其病理诊断特征包括肾小球毛细血管壁增厚，免疫荧光条件下可见IgG、补体C3沿着毛细血管壁沉积，电镜下显示肾小球上皮细胞下电子致密物形成。
根据病因的不同，MN可分为特发性膜性肾病(idiopathic membranousnephropathy,IMN)与继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy,SMN)。其中，IMN是MN的主要类型，占比约70％～80％，其病因尚不明确，又名原发性膜性肾病(primarymembranous nephropathy,PMN)。目前，PMN的发病机制尚不十分明确，但大多数学者认为PMN是一种抗体介导的自身免疫性肾小球疾病，位于足细胞的靶抗原被自身抗体识别，并与之结合形成免疫复合物沉积于基底膜足细胞下，激活补体系统引起足细胞损伤脱落，导致基底膜通透性增加，进而出现大量蛋白尿。
2009年Beck等首次报道磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor,PLA2R)是导致PMN发生的主要抗原之一，在70％的PMN患者血液和肾组织洗脱液中可检测出抗磷脂酶A2受体抗体(phospholipase-A2receptor antibody,PLA2R-Ab)(Beck LH Jr,Bonegio RG,Lambeau G,et al.N Engl J Med.2009；361(1):11-21)，这引起了医学界对PLA2R的广泛关注。PLA2R-Ab能够特异性地与肾脏组织中足细胞上的靶抗原(即PLA2R)结合，可在70％～80％的PMN患者血清中表达(Bobart SA,De Vriese AS,Pawar AS,et al.KidneyInt.2019；95(2):429-438)，而在健康人群、SMN及其他肾小球疾病患者的血清中PLA2R-Ab抗体阳性表达率极低，故PLA2R-Ab诊断MN的特异性较高。最新的一项Meta分析显示(练明建,卢榕,张加勤,等.临床检验杂志,2017,35(7)：545-549)，血清PLA2R-Ab检测对诊断PMN的总敏感度为69％，总特异度为97％，进一步说明血清PLA2R-Ab对PMN有较好的敏感性和很高的特异性，可以作为诊断PMN的特异性生物标志物。
此外，大量研究表明，MN患者血清PLA2R-Ab滴度水平与患者肾小球滤过率、血清总蛋白和白蛋白等指标均呈负相关，也与PMN患者的自发缓解率呈显著负相关，对于无PLA2R-Ab或PLA2R-Ab水平低的轻症患者可自然缓解。在使用免疫抑制剂治疗期间，血清PLA2R-Ab阴性者在较短的时间内即能够出现免疫抑制治疗反应，而血清PLA2R-Ab阳性者对于免疫抑制剂的灵敏度则较低。在接受免疫抑制治疗后，其血清PLA2R-Ab水平也在不断地降低，提示PLA2R-Ab对疗效评估具有重要作用。在进入缓解期后，若血清PLA2R-Ab未转阴或滴度增加，提示疾病有复发的可能(Xu X,Nie S,Ding H,et al.Nat Rev Nephrol.2018；14(5):313-324)。对于接受肾移植的MN患者，产生循环PLA2R-Ab的患者易较早出现疾病复发(Passerini P,Malvica S,Tripodi F,et al.Front Immunol.2019；10:1326)，提示术后复发可能也与PLA2R-Ab有关。另外，研究结果还显示，PLA2R-Ab转阴率与总缓解率呈显著正相关，PLA2R-Ab预测MN患者12个月的临床缓解事件的敏感度、特异度及准确率分别为69.51％、76.35％和80.26％(郑娜,汪梅花,安智.临床军医杂志.2021；49(08):942-944)。
综上所述，PLA2R-Ab对PMN患者的临床诊断和病情判断以及预后评估均具有重要的参考价值。PLA2R-Ab参与了PMN的疾病进展，PLA2R-Ab低滴度的患者病情较轻，免疫抑制剂治疗后效果更显著，甚至有可能自发缓解，提示通过监测PLA2R-Ab水平有助于指导临床医师对患者的免疫抑制剂的用量和使用时间，避免过度免疫抑制治疗，同时也有助于减轻患者的医疗负担。而血清PLA2R-Ab水平越高，反映机体免疫活动性越强，病情越严重，对免疫抑制治疗效果越差，临床预后也较差，也进一步说明监测血清PLA2R-Ab有助于指导临床治疗，对于入院PLA2R-Ab水平高的患者应早期进行有效的干预治疗。
目前，临床上MN的治疗方法主要以低脂低盐低蛋白饮食、控制蛋白尿和高脂血脂的对症支持治疗为主，辅以免疫抑制治疗和一些非免疫抑制治疗，但尚无确切的治疗方法。此外，膜性肾病患者的治疗效果较差，仅有40％的患者可自发缓解，30％的患者疗效不佳，最终进展为终末期肾病，只能通过透析或移植维持生命，严重增加患者经济负担和影响患者生活质量。对于肾移植的患者，约40％的肾移植患者治疗效果欠佳，其中一部分会失去移植肾。基于PMN的发病机制，以及血清PLA2R-Ab水平在评估PMN的治疗效果和临床预后中的重要价值，亟需一种有效治疗PLA2R-Ab阳性的MN患者的药物或技术。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种与原发性膜性肾病的自身免疫抗原结合的融合蛋白，本发明的融合蛋白可特异性地结合PLA2R抗体。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
针对PLA2R抗体阳性膜性肾病，一种可能的治疗方法是特异性中和血清中的PLA2R-Ab。发明人惊喜地发现，本申请所开发的PLA2R和抗体的融合蛋白(在本申请中，抗原与抗体的融合蛋白，称为抗体融合蛋白)可实现特异性中和血清中的PLA2R-Ab的技术效果。
PLA2R是一种高表达于肾小球足细胞表面的膜蛋白，包含如图1所示的结构域；同时，血液中有少量分泌型的PLA2R。并且，根据Liyo Kao等人的研究(Liyo Kao,Vinson Lam,et.al.,J Am Soc Nephrol.2015Feb；26(2):291-301)，病人血浆中的抗体主要识别PLA2R当中CysR、FNII和CTLD1三个结构域。
基于此，发明人发现，采用PLA2R的抗原区与抗体融合得到的融合蛋白，可保持PLA2R与PLA2R-Ab的结合能力。并且，在研发过程中，发明人发现，通过突变原抗体的CDR区，得到的抗体的抗原结合活性极低，可避免后续非特异性结合造成副作用，且具有更高的表达量。因此，采用突变后的抗体与PLA2R的抗原区融合得到的融合蛋白，特异性地中和PLA2R-Ab，且不与其他抗体结合，避免了非特异性免疫的副作用。此外，该融合蛋白还具有长半衰期的优势，可降低给药频率。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：中性抗体，所述中性抗体包括抗体FC区段或第一抗体；一个或多个PLA2R抗原表位肽，所述PLA2R抗原表位肽与所述中性抗体相连；其中，所述第一抗体包括：轻链可变区CDR和重链可变区CDR；其中，重链可变区CDR1序列如GX1X2X3X4X5X6X7X8X9所示，重链可变区CDR2序列如X10X11X12X13X14X15GX16X17X18X19X20X21X22X23所示，重链可变区CDR3序列如X24GGX25X26X27X28X29X30X31Y所示，X1为G或F，X2为G或N，X3为G或I，X4为G、K或S，X5为G或D，X6为G或T，X7为G或Y，X8为G或I，X9为H或S，X10为R或G，X11为G或I，X12为G或Y，X13为G或P，X14为T或S，X15为G或N，X16为G或Y，X17为G或T，X18为G、S或R，X19为G或Y，X20为G或A，X21为G或D，X22为G或S，X23为S或V，X24为G或W，X25为G或D，X26为G或S，X27为G或F，X28为G或Y，X29为G或A，X30为G或M，X31为S、G或D；条件是X1为F、X2为N、X3为I、X4为K、X5为D、X6为T、X7为Y、X8为I、X9为H、X10为R、X11为I、X12为Y、X13为P、X14为T、X15为N、X16为Y、X17为T、X18为R、X19为Y、X20为A、X21为D、X22为S、X23为V、X24为W、X25为D、X26为G、X27为F、X28为Y、X29为A、X30为M、X31为D不同时成立；轻链可变区CDR1序列如X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41A所示，轻链可变区CDR2序列如X42X43X44X45X46X47S所示，轻链可变区CDR3序列如X48X49X50X51X52X53X54X55X56所示，X32为G或R，X33为G或A，X34为G或S，X35为G或Q，X36为G、D或S，X37为G或V，X38为G或N，X39为G或T，X40为G或A，X41为S或V，X42为G或S，X43为G或A，X44为G或S，X45为G或F，X46为L或S，X47为G或Y，X48为G或Q，X49为G或Q，X50为G或H，X51为G或Y，X52为S或T，X53为G或T，X54为G或P，X55为G或P，X56为G或T；条件是X32为R、X33为A、X34为S、X35为Q、X36为D、X37为V、X38为N、X39为T、X40为A、X41为V、X42为S、X43为A、X44为S、X45为F、X46为L、X47为Y、X48为Q、X49为Q、X50为H、X51为Y、X52为T、X53为T、X54为P、X55为P、X56为T不同时成立。发明人经过实验发现，通过将PLA2R抗原表位肽与上述中性抗体融合，得到的融合蛋白可特异性地与PLA2R抗体结合，并且不与其他抗体结合，避免了非特异性结合的副作用，具有表达性好和产量高等优点。
在本文中，“第一抗体”是指与抗原Her2的结合极弱、且不结合任何其它抗原的抗体。该第一抗体的抗原结合活性极低，可作为中性抗体与生物活性分子融合得到融合蛋白，该融合蛋白可结合该生物活性分子的特异性结合物，例如，该中性抗体与PLA2R结合得到的融合蛋白可特异性结合PLA2R抗体，且不与其他抗体结合。其作为药物时，可避免非特异性结合的副作用；将中性抗体与抗原融合得到的融合蛋白作为药物，其可结合该抗原的特异性抗体，不结合其他抗体，可专一性的清除抗原的特异性抗体的生成细胞。
根据本发明的实施例，所述重链可变区CDR和轻链可变区CDR满足如下至少之一的条件：X4为G或S，X5为G，X21为G，X31为S或G，X36为G或S。
根据本发明的实施例，所述重链可变区CDR中，X1为G或F，X2为G或N，X3为G或I，X4为G或S，X5为G，X6为G或T，X7为G或Y，X8为G或I，X9为H或S，X10为G，X11为G或I，X12为G或Y，X13为G或P，X14为T或S，X15为G或N，X16为G，X17为G或T，X18为G或S，X19为G或Y，X20为G或A，X21为G，X22为G或S，X23为S或V，X24为G，X25为G或D，X26为G或S，X27为G或F，X28为G，X29为G或A，X30为G或M，X31为S或G；所述轻链可变区CDR中，X32为G或R，X33为G或A，X34为G或S，X35为G或Q，X36为G或S，X37为G或V，X38为G，X39为G或T，X40为G或A，X41为S或V，X42为G或S，X43为G或A，X44为G或S，X45为G，X46为L或S，X47为G或Y，X48为G或Q，X49为G或Q，X50为G或H，X51为G，X52为S或T，X53为G或T，X54为G或P，X55为G或P，X56为G或T。
根据本发明的实施例，所述第一抗体包括选自下列至少之一的CDR序列：轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85；重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91。
根据本发明的实施例，所述轻链可变区CDR序列包括与SEQ ID NO:1～3、SEQ IDNO:7～9和SEQ ID NO:83～85具有至少85％相似性的氨基酸序列中的至少之一；所述重链可变区CDR序列包括与SEQ ID NO:4～6、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:86～88和SEQ IDNO:89～91具有至少85％相似性的氨基酸序列中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述第一抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQID NO:1、2和3具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述第一抗体包括：分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQID NO:4、5和6具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:86、87和88或者与SEQ ID NO:86、87和88具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:89、90和91或者与SEQ ID NO:89、90和91具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述第一抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQID NO:1、2和3具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ IDNO:7、8和9具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQ ID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:86、87和88或者与SEQ ID NO:86、87和88具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQ ID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:89、90和91或者与SEQ ID NO:89、90和91具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述第一抗体含有：重链骨架区序列和轻链骨架区序列中的至少之一；其中，所述重链骨架区序列和轻链骨架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体中的至少之一，优选为人源抗体。
根据本发明的实施例，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区；和/或者，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区；或者所述第一抗体具有如SEQ IDNO:95所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的重链可变区；或者所述第一抗体具有如SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述第一抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一，优选为人源抗体。
根据本发明的实施例，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:33或SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQID NO:34所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链；或者所述第一抗体具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链；或者所述第一抗体具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述中性抗体的N端相连。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗原表位肽包括CysR、FnII、以及PLA2R结合区1和/或PLA2R结合区2。
根据本发明的实施例，所述CysR的C端与所述FnII的N端相连，所述FnII的C端与所述PLA2R结合区1的N端相连。
根据本发明的实施例，所述CysR的C端与所述FnII的N端相连，所述FnII的C端与所述PLA2R结合区1的N端相连，所述PLA2R结合区1的C端与PLA2R结合区2的N端相连。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗原表位肽具有如SEQ ID NO:21或22所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:21或22具有至少95％相似性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述中性抗体为抗体FC区段，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述抗体FC区段的至少一条的N端相连。
根据本发明的实施例，所述中性抗体为双链抗体，所述抗体FC区段的每条链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。
根据本发明的实施例，所述抗体FC区段具有如SEQ ID NO:24或者与SEQ ID NO:24具有至少90％相似性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述中性抗体为所述第一抗体，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述抗体的至少一条轻链或重链的N端相连。
根据本发明的实施例，所述第一抗体的每条轻链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。
根据本发明的实施例，所述第一抗体的每条重链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。
根据本发明的实施例，所述第一抗体的每条重链、每条轻链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述连接肽设置于所述PLA2R抗原表位肽与所述中性抗体之间。
根据本发明的实施例，所述连接肽的N端与所述PLA2R抗原表位肽的C端相连，所述连接肽的C端与所述中性抗体的N段相连。
根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
根据本发明的实施例，所述连接肽包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的融合蛋白。利用该核酸分子可以有效地用于表达上述融合蛋白。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述的第二核酸分子。利用该表达载体可以有效地用于表达上述融合蛋白。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子；或，表达前述的融合蛋白。根据本发明实施例的重组细胞可用于上述的融合蛋白体外表达和大量获得。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的融合蛋白。发明人经过大量实验发现，上述药物组合物可有效预防和治疗PLA2R抗体引起的相关疾病，例如PLA2R抗体阳性膜性肾病。
在本发明的第又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前述的融合蛋白。发明人经过大量实验发现，上述试剂盒可有效检测PLA2R抗体含量，并且还可以用于诊断或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病，例如PLA2R抗体阳性膜性肾病。
在本发明的第又一方面，本发明提出了一种前述的融合蛋白、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病。
在本发明的第又一方面，本发明提出了一种前述的融合蛋白、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或前述的药物组合物在制备免疫吸附剂中的用途，所述免疫吸附剂用于吸附PLA2R抗体。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的融合蛋白、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或前述的药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PLA2R抗体。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中表达框架的结构示意图；
图2为本发明实施例1中pcDNA3.4、trsH、trsL、RtxH和RtxL的电泳结果图；
图3为本发明实施例1中dTrs1H、dTrs2H和dTrs1L(dTrs2L)的电泳结果图；
图4为本发明实施例1中dTrs3H和dTrs3L的电泳结果图；
图5为本发明实施例1中dTrs4H和dTrs4L的电泳结果图；
图6为本发明实施例1中SDS-PAGE检测Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白的纯化效果；
图7为本发明实施例1中Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白与Her2结合的检测结果；
图8为本发明实施例2中RC1-RC8蛋白的结构示意图；
图9为本发明实施例2中PLA2R的结构示意图；
图10为本发明实施例2中pcDNA3.4的电泳结果图；
图11为本发明实施例2中pcDNA3.4、RC1H、RC2L、RC4H和RC5L的电泳结果图；
图12为本发明实施例2中RC3和RC6的电泳结果图；
图13为本发明实施例2中SDS-PAGE检测RC1-8蛋白的纯化效果；
图14为本发明实施例2中RC1-RC8对膜性肾病阳性病人pMN-2血浆中PLA2R-Ab的中和效果；
图15为本发明实施例2中RC1-RC8对膜性肾病阳性病人pMN-4血浆中PLA2R-Ab的中和效果；
图16为本发明实施例2中RC1-RC8对膜性肾病阳性病人pMN-7血浆中PLA2R-Ab的中和效果；
图17为本发明实施例2中RC3和RC6对PMN-4病人血浆样品中PLA2R-Ab吸附的清除率；
图18为本发明实施例2中RC3和RC6对PMN-7病人血浆样品中PLA2R-Ab吸附的清除率；
图19为本发明实施例2中小鼠皮下注射RC1、RC2、RC4、RC5、RC7、RC8蛋白的体重趋势图；
图20为本发明实施例2中小鼠皮下注射RC3、RC6蛋白的体重趋势图；
图21为本发明实施例1中Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白与IgA结合的检测结果；
图22为本发明实施例1中Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白与IgM结合的检测结果；
图23为本发明实施例1中Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白与HSA结合的检测结果；
图24为本发明实施例2中RC1-RC8的稳定性考察的电泳结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“抗体”通常是指免疫球蛋白分子，包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region,HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为互补决定区(complementarity-determining region,CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR。
在本文中，术语“骨架区”或“框架区”简称FR，其均是指抗体的重链或轻链的可变区中非CDR部分。其中，抗体的H链和L链的近N端约有110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区(V区)和恒定区(C区)，可变区内包含超变区HVR(hypervariable region)或称互补决定区CDR(Complementarity-determining region)与骨架区，FR的可变性要低于CDR。FR分子共四个，分别为FRl、FR2、FR3和FR4。在识别抗体时，四个FR分子卷曲使CDR分子相互靠近。
在本文中，术语“中性抗体”是指抗原结合活性低的蛋白结构，如Fc区段，或者本发明第一方面所提出的抗体。
在本文中，术语“双链抗体”是指具有对称结构的抗体，如有且仅有两条Fc片段组成的抗体，或者两条重链和两条轻链组成的完整抗体，如本发明第一方面所提出的抗体。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“核苷酸”通常是指可为核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式，及其组合。
在本文中，术语“至少85％相似性”指与各参考序列至少为85％，可为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的相似性。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞(人羊水来源的细胞)、昆虫细胞、PER.C6细胞和CoS细胞。
在本文中，术语“融合蛋白”是指至少两个蛋白质或者多肽融合而成的新型蛋白，通常可以通过基因工程等技术实现上述融合操作，例如，通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。在本文中是指，PLA2R与双链结构体的中性抗体呈融合状态，需要说明的是，PLA2R融合蛋白并不意味着蛋白质的所有部分都是通过融合的方式形成的，例如，双链结构体中的两个Fc段部分是可以通过二硫键等化学键连接在一起的。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性融合蛋白与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”或者“药学上可接受的载体”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的融合蛋白不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
对本文所提及的其他药学上可接受的辅料或其他药学上可接受的载体以及其工艺可参考关于此主题的大量文献，具体而言参见Handbook of PharmaceuticalExcipients，第3版，Arthur H.Kibbe编辑，American Pharmaceutical Association,Washington,USA和Pharmaceutical Press,London；以及Lexikon der Hilfsstoffe fürPharmazie、Kosmetik和angrenzende Gebiete，H.P.Fiedler编辑，第4版，编辑Cantor、Aulendorf和早期版本。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的融合蛋白或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用静脉注射或皮下注射方式被给药。
在本文中，术语“PLA2R抗体引起的相关疾病”通常是指由于PLA2R抗体异常引起的疾病，例如PLA2R抗体增多引起的相关疾病，包括但不限于PLA2R抗体阳性膜性肾病。其中，PLA2R是表达于肾小球足细胞的膜蛋白，由于未知的原因成为抗原，导致机体产生了相应的自身免疫抗体(PLA2R抗体)。PLA2R抗体与PLA2R结合并沉积到肾小球基底膜下，引发下游效应如C3沉积，导致PLA2R抗体阳性膜性肾病。
在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或融合蛋白给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述融合蛋白的药物给予有需要的个体。
本发明提出了一种抗体、融合蛋白及其用途，下面将分别对其进行详细描述。
抗体(即为第一抗体)及其用途
本发明对Trastuzumab(Trs)抗体的CDR区不同位点进行突变，经过大量实验得到本发明的抗体，该抗体与其抗原Her2的结合极弱，且不结合任何其它抗原，该抗体的抗原结合活性极低，可作为中性抗体与生物活性分子融合得到融合蛋白，该融合蛋白可结合该生物活性分子的特异性结合物，例如，该中性抗体与PLA2R结合得到的融合蛋白可特异性结合PLA2R抗体，且不与其他抗体结合，当作为药物时，避免了非特异性结合的副作用；将中性抗体与抗原融合得到的融合蛋白作为药物，其可结合该抗原的特异性抗体，不结合其他抗体，可专一性的清除抗原的特异性抗体的生成细胞。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体(即为权利要求和说明书发明内容中的第一抗体)。根据本发明的实施例，所述抗体包括：轻链可变区CDR和重链可变区CDR；其中，重链可变区CDR1序列如GX1X2X3X4X5X6X7X8X9所示，重链可变区CDR2序列如X10X11X1 2X13X14X15GX16X17X18X19X20X21X22X23所示，重链可变区CDR3序列如X24GGX25X26X27X28X29X30X31Y所示，X1为G或F，X2为G或N，X3为G或I，X4为G、K或S，X5为G或D，X6为G或T，X7为G或Y，X8为G或I，X9为H或S，X10为R或G，X11为G或I，X12为G或Y，X13为G或P，X14为T或S，X15为G或N，X16为G或Y，X17为G或T，X18为G、S或R，X19为G或Y，X20为G或A，X21为G或D，X22为G或S，X23为S或V，X24为G或W，X25为G或D，X26为G或S，X27为G或F，X28为G或Y，X29为G或A，X30为G或M，X31为S、G或D；条件是X1为F、X2为N、X3为I、X4为K、X5为D、X6为T、X7为Y、X8为I、X9为H、X10为R、X11为I、X12为Y、X13为P、X14为T、X15为N、X16为Y、X17为T、X18为R、X19为Y、X20为A、X21为D、X22为S、X23为V、X24为W、X25为D、X26为G、X27为F、X28为Y、X29为A、X30为M、X31为D不同时成立；轻链可变区CDR1序列如X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41A所示，轻链可变区CDR2序列如X42X43X44X45X46X47S所示，轻链可变区CDR3序列如X48X49X50X51X52X53X54X55X56所示，X32为G或R，X33为G或A，X34为G或S，X35为G或Q，X36为G、D或S，X37为G或V，X38为G或N，X39为G或T，X40为G或A，X41为S或V，X42为G或S，X43为G或A，X44为G或S，X45为G或F，X46为L或S，X47为G或Y，X48为G或Q，X49为G或Q，X50为G或H，X51为G或Y，X52为S或T，X53为G或T，X54为G或P，X55为G或P，X56为G或T；条件是X32为R、X33为A、X34为S、X35为Q、X36为D、X37为V、X38为N、X39为T、X40为A、X41为V、X42为S、X43为A、X44为S、X45为F、X46为L、X47为Y、X48为Q、X49为Q、X50为H、X51为Y、X52为T、X53为T、X54为P、X55为P、X56为T不同时成立。发明人经过大量实验发现，上述抗体的抗原结合活性极低，具有表达量高的优点。
根据本发明的实施例，所述重链可变区CDR和轻链可变区CDR满足如下至少之一的条件：X4为G或S，X5为G，X21为G，X31为S或G，X36为G或S。
根据本发明的实施例，所述重链可变区CDR中，X1为G或F，X2为G或N，X3为G或I，X4为G或S，X5为G，X6为G或T，X7为G或Y，X8为G或I，X9为H或S，X10为G，X11为G或I，X12为G或Y，X13为G或P，X14为T或S，X15为G或N，X16为G，X17为G或T，X18为G或S，X19为G或Y，X20为G或A，X21为G，X22为G或S，X23为S或V，X24为G，X25为G或D，X26为G或S，X27为G或F，X28为G，X29为G或A，X30为G或M，X31为S或G；所述轻链可变区CDR中，X32为G或R，X33为G或A，X34为G或S，X35为G或Q，X36为G或S，X37为G或V，X38为G，X39为G或T，X40为G或A，X41为S或V，X42为G或S，X43为G或A，X44为G或S，X45为G，X46为L或S，X47为G或Y，X48为G或Q，X49为G或Q，X50为G或H，X51为G，X52为S或T，X53为G或T，X54为G或P，X55为G或P，X56为G或T。
根据本发明的实施例，所述抗体包括选自下列至少之一的CDR序列：轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85；重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91。
RASQGVGTAVA(SEQ ID NO:1)。
SASGLYS(SEQ ID NO:2)。
QQHGTTPPT(SEQ ID NO:3)。
GFNIGGTGIH(SEQ ID NO:4)。
GIYPTNGGTGYAGSV(SEQ ID NO:5)。
GGGDGFGAMGY(SEQ ID NO:6)。
GGGGSGGGGSA(SEQ ID NO:7)。
GGGGSGS(SEQ ID NO:8)。
GGGGSGGGG(SEQ ID NO:9)。
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:11)。
GGGGSGGGGSY(SEQ ID NO:12)。
RASQDVGTAVA(SEQ ID NO:83)。
SASGLYS(SEQ ID NO:84)。
QQHGTTPPT(SEQ ID NO:85)。
GFNIKDTYIH(SEQ ID NO:86)。
RIYPTNGGTRYADSV(SEQ ID NO:87)。
WGGDGFGAMDY(SEQ ID NO:88)。
GFNIKDTGIH(SEQ ID NO:89)。
GIYPTNGGTGYADSV(SEQ ID NO:90)。
GGGDGFGAMDY(SEQ ID NO:91)。
在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体与上述重链和轻链相比，具有保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏抗体的抗原结合活性低的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。
根据本发明的实施例，所述轻链可变区CDR序列包括与SEQ ID NO:1～3、SEQ IDNO:7～9和SEQ ID NO:83～85具有至少85％相似性的氨基酸序列中的至少之一；所述重链可变区CDR序列包括与SEQ ID NO:4～6、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:86～88和SEQ IDNO:89～91具有至少85％相似性的氨基酸序列中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和3具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQ IDNO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ IDNO:4、5和6具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:86、87和88或者与SEQ ID NO:86、87和88具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:89、90和91或者与SEQ ID NO:89、90和91具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和3具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:86、87和88或者与SEQ ID NO:86、87和88具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQ ID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:89、90和91或者与SEQ ID NO:89、90和91具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体含有：重链骨架区序列和轻链骨架区序列中的至少之一；其中，所述重链骨架区序列和轻链骨架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体中的至少之一，优选为人源抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:95所示氨基酸序列的轻链可变区；和/或者，所述抗体具有如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区。发明人通过抗体序列比对数据库(NCBI、IMGT)或者相关软件可得到上述抗体的重链可变区序列的CDR区(如SEQ IDNO:4～6、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:86～88、SEQ ID NO:89～91所示)和轻链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:1～3、SEQ ID NO:7～9、SEQ ID NO:83～85所示)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLYSGVPSRFSGSR SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHGTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:13)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGGGGSGGGGSAWYQQKPGKAPKLLIYGGGGSGSGVPSRFSGS RSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGGSGGGGFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIGGTGIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPTNGGTGYAGSV KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGDGFGAMGYWGQGTLVTV(SEQ ID NO:15)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGGGSGGGGSWVRQAPGKGLEWVAGGGGSGGGGSGGG GSKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGGSGGGGSYWGQGTLVTV(SEQ ID NO:16)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLYSGVPSRFSGSR SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHGTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:95)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGGTRYADSVK GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFGAMDYWGQGTLVTV(SEQ ID NO:96)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTGIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPTNGGTGYADSV KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGDGFGAMDYWGQGTLVTV(SEQ ID NO:97)。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链可变区序列与SEQ ID NO:13或14所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代；或者，所述抗体的重链可变区序列与SEQ ID NO:15或16所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一，优选为人源抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:34所示氨基酸序列的轻链。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIGGTGIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPTNGGTGYAGSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGDGFGAMGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGGGSGGGGSWVRQAPGKGLEWVAGGGGSGGGGSGGGGSKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGGSGGGGSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHGTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:19)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGGGGSGGGGSAWYQQKPGKAPKLLIYGGGGSGSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGGSGGGGFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:20)。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种第一方面所述的抗体在制备药物中的用途。由前可知，本发明的上述抗体无抗原结合活性，其可作为中性的药物载体制备药物。例如，采用上述抗体可抗原表位肽融合制备成融合蛋白，由于上述抗体为无抗原结合活性，制备的融合蛋白特异性地与抗原表位肽相应的抗体结合，且不与其他抗体结合，可避免融合蛋白非特异性结合的副作用。
根据本发明的实施例，所述药物包括融合蛋白或ADC药物。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述的抗体在作为药物载体或阴性抗体中的用途。由前可知，本发明的上述抗体无抗原结合活性，其可作为中性的药物载体制备药物，或者可直接作为无抗原结合活性的阴性抗体参照。
根据本发明的实施例，所述药物载体或阴性抗体无抗原结合能力。
第一核酸分子、第一表达载体、第一重组细胞
在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。
为此，在本发明的第二方面，本发明提出了一种第一核酸分子。根据本发明的实施例，所述第一核酸分子编码第一方面所述的抗体。根据本发明实施例的第一核酸分子所编码的抗体的抗原结合活性极低，具有表达量高的优点。
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:25或与其具有至少80％相似性的核苷酸序列。SEQ ID NO:25用于编码具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链。
GAAGTCCAGCTGGTGGAAAGTGGCGGTGGACTGGTTCAACCAGGAGGAAGCCTAAGACTAAGCTGCGCCGCCAGCGGTTTTAACATCGGTGGCACAGGCATCCATTGGGTCCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTAGAGTGGGTCGCAGGCATCTACCCCACTAATGGTGGCACCGGCTACGCTGGTAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATTAGCGCTGACACCAGCAAGAACACTGCTTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCCGAAGACACAGCCGTCTATTACTGTAGTAGAGGCGGAGGTGATGGGTTCGGCGCGATGGGCTACTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:25)。
所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:26或与其具有至少80％相似性的核苷酸序列。SEQ ID NO:26用于编码具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链。
GATATACAGATGACGCAGAGCCCTAGCAGTCTAAGTGCAAGCGTTGGAGACCGTGTCACCATTACCTGCCGCGCTAGCCAGGGCGTCGGCACCGCAGTCGCCTGGTATCAGCAAAAACCGGGTAAGGCTCCAAAGCTGTTGATCTACAGTGCCAGCGGCCTGTACAGCGGTGTGCCAAGTAGGTTCAGCGGGAGCCGGAGTGGGACAGACTTTACACTCACTATTAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGCATGGCACAACACCCCCAACATTCGGGCAGGGAACCAAAGTTGAGATAAAACGAACGGTTGCCGCGCCAAGCGTATTTATCTTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGAGTGGTACAGCC AGCGTTGTCTGCCTTTTGAATAACTTCTATCCTCGGGAGGCAAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCACTCCAAAGCGGTAACAGCCAGGAGAGTGTGACAGAACAGGACAGCAAAGATAGTACCTACAGCCTCAGTAGTACCCTCACACTGAGCAAAGCGGACTATGAAAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAAGTGACCCACCAGGGCCTAAGCAGCCCTGTTACTAAGAGCTTCAACAGAGGCGAATGT(SEQ ID NO:26)。
所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:27或与其具有至少80％相似性的核苷酸序列。SEQ ID NO:27用于编码具有SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的重链。
GAAGTCCAGCTGGTGGAAAGTGGCGGTGGACTGGTTCAACCAGGAGGAAGCCTAAGACTAAGCTGCGCCGCCAGCGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGGGGTTCGTGGGTCCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTAGAGTGGGTCGCAGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGGGGTTCGGGCGGGGGTGGTTCCAAGGGCAGGTTCACCATTAGCGCTGACACCAGCAAGAACACTGCTTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCCGAAGACACAGCCGTCTATTACTGTAGTAGAGGCGGAGGTGGTAGCGGTGGCGGGGGTTCGTACTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:27)。
所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:28或与其具有至少80％相似性的核苷酸序列。SEQ ID NO:28用于编码具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链。
GATATACAGATGACGCAGAGCCCTAGCAGTCTAAGTGCAAGCGTTGGAGACCGTGTCACCATTACCTGCGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGGGGTTCGGCCTGGTATCAGCAAAAACCGGGTAAGGCTCCAAAGCTGTTGATCTACGGTGGCGGGGGTAGCGGCAGCGGTGTGCCAAGTAGGTTCAGCGGGAGCCGGAGTGGGACAGACTTTACACTCACTATTAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTGGTGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGGGGTTTCGGGCAGGGAACCAAAGTTGAGATAAAACGAACGGTTGCCGCGCCAAGCGTATTTATCTTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGAGTGGTACAGCCAGCGTTGTCTGCCTTTTGAATAACTTCTATCCTCGGGAGGCAAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCACTCCAAAGCGGTAACAGCCAGGAGAGTGTGACAGAACAGGACAGCAAAGATAGTACCTACAGCCTCAGTAGTACCCTCACACTGAGCAAAGCGGACTATGAAAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAAGTGACCCACCAGGGCCTAAGCAGCCCTGTTACTAAGAGCTTCAACAGAGGCGAATGT(SEQ ID NO:28)。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体所描述的特征和优点，同样适用于该第一核酸分子，在此不再赘述。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种第一表达载体。根据本发明的实施例，所述第一表达载体携带第二方面所述的第一核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到第一表达载体上时，可以将多核苷酸与第一表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于第一表达载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于第一表达载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。
根据本发明的实施例，所述第一表达载体为真核表达载体，优选地，所述第一表达载体为慢病毒载体。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体所描述的特征和优点，同样适用于该第一表达载体，在此不再赘述。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种第一重组细胞。根据本发明的实施例，所述第一重组细胞包括：携带第二方面所述的第一核酸分子；或，表达第一方面所述的抗体。可以将第一表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得第一重组细胞，然后利用这些第一重组细胞表达本发明提供的抗体。通过该第一重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将第一表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体所描述的特征和优点，同样适用于该第一重组细胞，在此不再赘述。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体所描述的特征和优点，同样适用于该第一核酸分子、第一表达载体和第一重组细胞，在此不再赘述。
融合蛋白
在本发明的第五方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：中性抗体，所述中性抗体包括抗体FC区段或第一方面所述的抗体；一个或多个PLA2R抗原表位肽，所述PLA2R抗原表位肽与所述中性抗体相连。
发明人经过实验发现，通过将PLA2R抗原表位肽与上述中性抗体融合，得到的融合蛋白可竞争性地与PLA2R抗体结合，防止PLA2R抗体与机体内的PLA2R结合，可有效治疗PLA2R抗体引起的相关疾病。同时，本发明的融合蛋白中的PLA2R抗原表位肽与PLA2R抗体结合，融合蛋白的中性抗体含有Fc片段，Fc片段可与NK细胞的FcγR受体结合，从而介导NK细胞直接杀伤表达膜型PLA2R抗体的B细胞，Fc片段还可以与补体C1q结合并激活补体系统，对表达膜型PLA2R抗体的B细胞发挥裂解效应，由于本发明的融合蛋白特异性地与PLA2R抗体结合，且不与其他抗体结合，其可专一性的清除B细胞，避免非特异性免疫的副作用。并且，本发明的融合蛋白还可以与肝脏FcRn受体结合并得到保护，避免融合蛋白被降解，具有很长的血浆半衰期。因此，该融合蛋白作为药物，具有长半衰期的优势，可降低给药频率，还具有表达性好、产量高、稳定性高、亲和性高、溶解性好和成药性好等优点。
本领域技术人员能够理解的是，氨基酸片段通常分为N端和C端，本发明对于中性抗体和PLA2R抗原表位肽的连接方式不作严格限定，只要是一个片段的N端与另一个片段的C端相连即可。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述中性抗体的N端相连。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗原表位肽包括CysR、FnII以及PLA2R结合区1和/或PLA2R结合区2。
需要说明的是，CysR、FnII、PLA2R结合区1和PLA2R结合区2的具体结构参见图9。
根据本发明的实施例，所述CysR的C端与所述FnII的N端相连，所述FnII的C端与所述PLA2R结合区1的N端相连。
根据本发明的实施例，所述CysR的C端与所述FnII的N端相连，所述FnII的C端与所述PLA2R结合区1的N端相连，所述PLA2R结合区1的C端与PLA2R结合区2的N端相连。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗原表位肽具有如SEQ ID NO:21或22所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO:21或22具有至少95％相似性的氨基酸序列。
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVE(SEQ ID NO:21)。
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEKDAWKYYATHCEPGWNPYNRNCYKLQKEEKTWHEALRSCQADNSALIDITSLAEVEFLVTLLGDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSNDSSVIFTNWHTLEPHIFPNRSQLCVSAEQSEGHWKVKNCEERLFYICKKAGHVLSD(SEQ ID NO:22)。
根据本发明的实施例，所述中性抗体为抗体FC区段，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述抗体FC区段的至少一条的N端相连。
根据本发明的实施例，所述中性抗体为第一方面所述的抗体，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述抗体的至少一条轻链或重链的N端相连。
根据本发明的实施例，所述中性抗体为双链抗体，所述抗体FC区段的每条链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。该融合蛋白上含有两个PLA2R抗原表位肽，即为二价分子。发明人经过实验发现，与单价的天然PLA2R相比，本发明的融合蛋白与PLA2R抗体的结合能力较强，可有效中和PLA2R抗体，保护肾小球组细胞表面的天然PLA2R不被PLA2R抗体攻击。
根据本发明的实施例，第一方面所述的抗体的每条轻链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。该融合蛋白上含有两个PLA2R抗原表位肽，即为二价分子。发明人经过实验发现，与单价的天然PLA2R相比，本发明的融合蛋白与PLA2R抗体的结合能力较强，可有效中和PLA2R抗体，保护肾小球组细胞表面的天然PLA2R不被PLA2R抗体攻击。
根据本发明的实施例，第一方面所述的抗体的每条重链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。该融合蛋白上含有两个PLA2R抗原表位肽，即为二价分子。发明人经过实验发现，与单价的天然PLA2R相比，本发明的融合蛋白与PLA2R抗体的结合能力较强，可有效中和PLA2R抗体，保护肾小球组细胞表面的天然PLA2R不被PLA2R抗体攻击。
根据本发明的实施例，第一方面所述的抗体的每条重链、每条轻链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。发明人经过实验发现，该融合蛋白上含有四个PLA2R抗原表位肽，与单价的天然PLA2R相比，本发明的融合蛋白与PLA2R抗体的结合能力较强，可有效中和PLA2R抗体，保护肾小球组细胞表面的天然PLA2R不被PLA2R抗体攻击。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述连接肽设置于所述PLA2R抗原表位肽与所述抗体之间。
根据本发明的实施例，所述连接肽的N端与所述PLA2R抗原表位肽的C端相连，所述连接肽的C端与所述中性抗体的N段相连。由此，采用过上述连接肽可融合的PLA2R抗原表位肽和中性抗体，提高最终所得到的融合蛋白与PLA2R抗体的结合能力。
根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
根据本发明的实施例，所述连接肽包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)。
根据本发明的实施例，所述抗体FC区段具有如SEQ ID NO:24或者与SEQ ID NO:24具有至少90％相似性的氨基酸序列。
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24)。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ IDNO:59所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ IDNO:19所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ IDNO:65所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ IDNO:59所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ IDNO:65所示氨基酸序列的第二肽段。
示例性地，参考图8，当中性抗体为上述所述的抗体(或称第一抗体)时，融合蛋白的第一肽段为包括第一抗体重链的肽段，融合蛋白的第二肽段为包括第一抗体轻链的肽段，第一肽段和第二肽段通过链间二硫键相连；当中性抗体为上述所述的抗体Fc片段时，融合蛋白为包括抗体Fc片段的肽段。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体所描述的特征和优点，同样适用于该融合蛋白，在此不再赘述。
第二核酸分子、第二表达载体、第二重组细胞
在制备或者获取这些融合蛋白的过程中，可以利用表达这些融合蛋白的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应融合蛋白。
为此，在本发明的第六方面，本发明提出了一种第二核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码第五方面所述的融合蛋白。利用该第二核酸分子可以有效地用于表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述融合蛋白。需要说明的是，这里的第二核酸分子不需要编码上述融合蛋白的全部序列，例如，可以包括两类核酸分子，分别编码两个单体，进一步可以在体外进行组装得到异二聚体，即可形成含有双链抗体的融合蛋白。
根据本发明的实施例，所述第二核酸分子为DNA。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种第二表达载体。根据本发明的实施例，所述第二表达载体携带第六方面所述的第二核酸分子。利用该第二表达载体可以有效地用于表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述融合蛋白。
根据本发明的实施例，所述第二表达载体为真核表达载体，优选地，所述第二表达载体为慢病毒载体。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种第二重组细胞。根据本发明的实施例，所述第二重组细胞包括：携带第六方面所述的第二核酸分子；或，表达第五方面所述的融合蛋白。根据本发明实施例的重组细胞可用于第五方面所述的融合蛋白体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例，所述第二重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述第二重组细胞为哺乳动物细胞。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对融合蛋白所描述的特征和优点，同样适用于该第二核酸分子、第二表达载体和第二重组细胞，在此不再赘述。
药物组合物、免疫吸附剂、试剂盒、吸附产品及其用途
在本发明的第九方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：第五方面所述的融合蛋白。发明人经过大量实验发现，上述药物组合物可有效预防和治疗PLA2R抗体引起的相关疾病，例如PLA2R抗体阳性膜性肾病。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种免疫吸附剂。根据本发明的实施例，所述免疫吸附剂包括：第五方面所述的融合蛋白。发明人经过大量实验发现，上述免疫吸附剂可吸附PLA2R抗体，其可通过免疫吸附有效治疗PLA2R抗体引起的相关疾病，例如PLA2R抗体阳性膜性肾病。
在本发明的第十一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：第五方面所述的融合蛋白。发明人经过大量实验发现，上述试剂盒可有效检测PLA2R抗体含量，并且还可以用于诊断或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病，例如PLA2R抗体阳性膜性肾病。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对融合蛋白、第二核酸分子、第二表达载体和第二重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物、免疫吸附剂和试剂盒，在此不再赘述。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种吸附产品。根据本发明的实施例，所述吸附产品包括：前述的免疫吸附剂；固相载体，所述免疫吸附剂与固相载体相连。本发明的吸附产品可用于吸附PLA2R抗体，例如吸附血液或血浆中的PLA2R抗体，通过吸附血液或血浆中的PLA2R抗体可用于预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病。
需要说明的是，免疫吸附剂和固相载体的连接方式不受具体限制，可偶联，或者可通过化学键相连。
在本文中，所述血液或血浆可来源于任何动物，例如哺乳动物。
示例性地，所述血液或血浆选自人血液或血浆。
根据本发明的实施例，所述吸附产品选自免疫吸附柱或血液净化剂。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述的免疫吸附剂在制备吸附产品中的用途，所述吸附产品用于吸附PLA2R抗体。
根据本发明的实施例，所述吸附产品选自免疫吸附柱或血液净化剂。
根据本发明的实施例，所述吸附产品为免疫吸附柱，所述吸附产品用于预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病。由前可知，上述免疫吸附剂可吸附PLA2R抗体，由此，含有上述免疫吸附剂的免疫吸附柱，可通过免疫吸附剂吸附PLA2R抗体，该免疫吸附柱可有效治疗PLA2R抗体引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
根据本发明的实施例，所述吸附产品为血液净化剂，所述吸附产品用于吸附血液或血浆中的PLA2R抗体。由前可知，上述免疫吸附剂可吸附PLA2R抗体，由此，含有上述免疫吸附剂的血液净化剂，可通过免疫吸附剂吸附PLA2R抗体，该血液净化剂可有效吸附血液或血浆中的PLA2R抗体。
用途
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种第五方面所述的融合蛋白、第六方面所述的第二核酸分子、第七方面所述的第二表达载体、第八方面所述的第二重组细胞或第九方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
根据本发明的实施例，所述中药组合物的剂型包括注射剂。
根据本发明的实施例，所述中药组合物的给药途径包括皮下注射或静脉注射。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对药物组合物、免疫吸附剂和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
在本发明的第十三方面，本发明提出了一种第五方面所述的融合蛋白、第六方面所述的第二核酸分子、第七方面所述的第二表达载体、第八方面所述的第二重组细胞或第九方面所述的药物组合物在制备免疫吸附剂中的用途，所述免疫吸附剂用于吸附PLA2R抗体。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对药物组合物、免疫吸附剂和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
在本发明的第十四方面，本发明提出了一种第五方面所述的融合蛋白、第六方面所述的第二核酸分子、第七方面所述的第二表达载体、第八方面所述的第二重组细胞、第九方面所述的药物组合物或第十方面所述的免疫吸附剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PLA2R抗体。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对融合蛋白、药物组合物、免疫吸附剂和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于上述的用途，在此不再赘述。
方法
在本发明的第十五方面，本发明提出了一种预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：向受试者施用药学上可接受量的第五方面所述的融合蛋白或第九方面所述的药物组合物。根据本发明的实施例，该方法可有效预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述方法的给药途径采用皮下注射或静脉注射。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
在本发明的第十六方面，本发明提出了一种用于预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病的免疫吸附治疗方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：采用第十方面所述的免疫吸附剂对受试者进行治疗。
根据本发明的实施例，所述方法采用体外血液净化对受试者进行治疗。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
在本发明的第十七方面，本发明提出了一种诊断PLA2R抗体引起的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用第五方面所述的融合蛋白、第六方面所述的第二核酸分子、第七方面所述的第二表达载体、第八方面所述的第二重组细胞、第九方面所述的药物组合物、第十方面所述的免疫吸附剂或第十一方面所述的试剂盒对待测样品中的PLA2R抗体进行检测；基于检测结果，确定待测样品中的PLA2R抗体的含量。
根据本发明的实施例，所述待测样品中PLA2R抗体的含量不低于14RU/ml是待测样品来源于患有PLA2R抗体引起的相关疾病的患者的指示，优选为，所述待测样品中PLA2R抗体的含量不低于20RU/ml是待测样品来源于患有PLA2R抗体引起的相关疾病的患者的指示。
根据本发明的实施例，所述待测样品为血液。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
在本发明的第十八方面，本发明提出了一种评估PLA2R抗体引起的相关疾病分期的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用第五方面所述的融合蛋白、第六方面所述的第二核酸分子、第七方面所述的第二表达载体、第八方面所述的第二重组细胞、第九方面所述的药物组合物、第十方面所述的免疫吸附剂或第十一方面所述的试剂盒对待测样品中的PLA2R抗体进行检测，所述待测样品来源于待测患者；基于检测结果，确定待测样品中的PLA2R抗体的含量。
根据本发明的实施例，基于待测样品中的PLA2R抗体的含量，确定待测患者患有PLA2R抗体引起的相关疾病的分期。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
根据本发明的实施例，PLA2R抗体阳性膜性肾病分为四期。
根据本发明的实施例，所述待测样品为血液。
在本发明的第十九方面，本发明提出了一种评估PLA2R抗体引起的相关疾病的预后方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用第五方面所述的融合蛋白、第六方面所述的第二核酸分子、第七方面所述的第二表达载体、第八方面所述的第二重组细胞、第九方面所述的药物组合物、第十方面所述的免疫吸附剂或第十一方面所述的试剂盒对待测样品中的PLA2R抗体进行检测；基于检测结果，确定待测样品中的PLA2R抗体的含量。
根据本发明的实施例，所述待测样品来源于治疗前或后的患有PLA2R抗体引起的相关疾病的患者。
根据本发明的实施例，基于治疗前或后的患有PLA2R抗体引起的相关疾病的患者的待测样品中的PLA2R抗体的含量，确定PLA2R抗体引起的相关疾病的预后效果。
根据本发明的实施例，治疗后的患有PLA2R抗体引起的相关疾病的患者的待测样品中的PLA2R抗体的含量下降是患者预后良好的指示。
根据本发明的实施例，所述待测样品为血液。
根据本发明的实施例，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对融合蛋白、药物组合物、免疫吸附剂和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于上述的方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：中性抗体的制备和选择
1、表达构建
首先，质粒载体采用的是pcDNA3.4瞬时表达载体，该载体包含原生的全长CMV启动子和克隆位点下游的WPRE元件，基于CMV启动子的载体通常对CHO细胞瞬时表达系统具有良好的表达水平，WPRE元件位于多克隆位点下游，可以有效提高基因的转录和表达，在大肠杆菌中，具有氨苄抗性基因。然后，利用PCR技术扩增载体基因pcDNA3.4和目的基因，PCR模板经过基因合成得到，通过同源重组试剂盒将载体片段和目的基因片段连接，DH5α感受态转化得到单克隆，将单克隆扩增后进行测序，经测序确认后，提取质粒得到目的基因重组表达质粒。其中，目的序列编码DNA加上分泌表达信号肽的编码DNA经基因合成，克隆于质粒pcDNA3.4的CMV promoter和WPRE基因之间，具体参见图1。
1.1目的基因(gene of interest)的名称和序列如表1所示，pcDNA3.4载体和目的基因(或称目的片段)的引物与模板如表2所示，其中，RtxH和RtxL用于合成利妥昔(Rituximab，简称Rtx)。
表1：目的基因的名称和序列
| 名称 | 引物 | 氨基酸序列 | 核苷酸序列 |
| RtxH | RtxH-f,RtxH-r | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:36 |
| RtxL | RtxL-f,RtxL-r | SEQ ID NO:30 | SEQ ID NO:37 |
| TrsH | TrsH-f,TrsH-r | SEQ ID NO:31 | SEQ ID NO:38 |
| TrsL | TrsL-f,TrsL-r | SEQ ID NO:32 | SEQ ID NO:39 |
| dTrs1H | dTrsH-f,dTrsH-r | SEQ ID NO:33 | SEQ ID NO:40 |
| dTrs1L(dTrs2L) | dTrsL-f,dTrsL-r | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:41 |
| dTrs2H | dTrsH-f,dTrsH-r | SEQ ID NO:35 | SEQ ID NO:42 |
| dTrs3H | dTrsH-f,dTrsH-r | SEQ ID NO:18 | SEQ ID NO:27 |
| dTrs3L | dTrsL-f,dTrsL-r | SEQ ID NO:20 | SEQ ID NO:28 |
| dTrs4H(dTrsH) | dTrsH-f,dTrsH-r | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:25 |
| dTrs4L(dTrsL) | dTrsL-f,dTrsL-r | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:26 |
注：本实施例中的dTrs1L和dTrs2L为相同的目的基因。
其中，其中，RtxH的氨基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:29)。
RtxL的氨基酸序列：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:30)。
TrsH的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:31)。
TrsL的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:32)。
dTrs1H的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGGTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:33)。
dTrs1L的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHGTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:34)。
dTrs2H的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTGIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPTNGGTGYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGDGFGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:35)。
RtxH的核苷酸序列：
CAAGTGCAGCTCCAGCAGCCCGGGGCTGAACTGGTCAAGCCTGGAGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAAGCCTCCGGCTACACCTTTACATCTTACAACATGCACTGGGTCAAGCAGACCCCAGGACGGGGCTTGGAATGGATTGGTGCCATCTACCCGGGAAACGGCGACACTAGCTATAACCAGAAGTTCAAGGGCAAAGCAACCCTCACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACTGCGTACATGCAGCTGTCGTCCCTGACGTCCGAGGATTCCGCCGTGTATTACTGCGCAAGGTCAACCTACTATGGAGGAGATTGGTACTTCAACGTCTGGGGAGCCGGGACCACTGTGACTGTGTCCGCCGCGTCAACTAAGGGCCCTTCAGTGTTCCCCCTCGCGCCAAGCTCCAAGTCCACTAGCGGCGGGACCGCCGCGCTGGGTTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCGCTGACCTCCGGGGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAATCGAGCGGACTGTACTCCCTGAGCTCCGTGGTCACGGTGCCGTCCTCGAGCC TGGGAACCCAGACCTACATTTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAGGCCGAGCCTAAGTCCTGTGACAAGACCCACACTTGCCCTCCGTGCCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGGCCGTCTGTGTTTCTCTTCCCGCCCAAGCCTAAGGACACTCTCATGATTTCCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGTCGCATGAAGATCCAGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAACCGCGCGAGGAGCAGTACAATTCAACCTACCGGGTGGTGTCGGTGTTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCGAACAAGGCCCTCCCTGCTCCGATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGACAGCCGAGGGAGCCCCAGGTCTACACTCTGCCTCCGTCCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAAGTGTCCCTCACCTGTCTTGTGAAGGGGTTCTACCCAAGCGACATCGCGGTCGAATGGGAATCAAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACGCCCCCGGTGCTGGACTCGGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACTGTGGACAAGTCCCGGTGGCAACAGGGAAACGTGTTCAGCTGTAGCGTGATGCATGAAGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCGCTCTCCCTGTCACCCGGC(SEQ IDNO:36)。
RtxL的核苷酸序列：
CAGATCGTGTTGTCGCAATCCCCGGCCATCCTGTCCGCTTCGCCGGGAGAAAAGGTCACCATGACTTGTCGCGCCTCAAGCAGCGTGTCCTACATTCATTGGTTTCAGCAGAAGCCCGGGTCCAGCCCGAAGCCTTGGATCTACGCAACTAGCAACCTCGCCTCCGGCGTGCCAGTGCGCTTCTCCGGTTCCGGATCGGGAACGTCCTATAGCCTGACTATCTCGAGAGTGGAGGCCGAGGACGCTGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGACCTCGAATCCTCCAACTTTCGGTGGCGGCACCAAGCTGGAGATTAAGAGGACCGTCGCGGCCCCTAGCGTGTTCATTTTCCCCCCGTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGGACAGCCTCAGTGGTCTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCCCGGGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCGCTTCAGAGCGGCAACTCACAAGAGTCCGTGACCGAACAGGACTCGAAGGACAGCACCTACAGCCTCTCCTCCACCCTGACCCTGTCAAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGGCTGTCCTCTCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGAGAGTGC(SEQ ID NO:37)。
TrsH的核苷酸序列：
GAAGTCCAGCTGGTGGAAAGTGGCGGTGGACTGGTTCAACCAGGAGGAAGCCTAAGACTAAGCTGCGCCGCCAGCGGTTTTAACATCAAGGACACATACATCCATTGGGTCCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTAGAGTGGGTCGCAAGGATCTACCCCACTAATGGTTATACCAGGTACGCTGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATTAGCGCTGACACCAGCAAGAACACTGCTTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCCGAAGACACAGCCGTCTATTACTGTAGTAGATGGGGAGGTGATGGGTTCTATGCGATGGATTACTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:38)。
TrsL的核苷酸序列：
GATATACAGATGACGCAGAGCCCTAGCAGTCTAAGTGCAAGCGTTGGAGACCGTGTCACCATTACCTGCCGCGCTAGCCAGGATGTCAACACCGCAGTCGCCTGGTATCAGCAAAAACCGGGTAAGGCTCCAAAGCTGTTGATCTACAGTGCCAGCTTTCTGTACAGCGGTGTGCCAAGTAGGTTCAGCGGGAGCCGGAGTGGGACAGACTTTACACTCACTATTAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGCATTATACAACACCCCCAACATTCGGGCAGGGAACCAAAGTTGAGATAAAACGAACGGTTGCCGCGCCAAGCGTATTTATCTTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGAGTGGTACAGCCAGCGTTGTCTGCCTTTTGAATAACTTCTATCCTCGGGAGGCAAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCACTCCAAAGCGGTAACAGCCAGGAGAGTGTGACAGAACAGGACAGCAAAGATAGTACCTACAGCCTCAGTAGTACCCTCACACTGAGCAAAGCGGACTATGAAAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAAGTGACCCACCAGGGCCTAAGCAGCCCTGTTACTAAGAGCTTCAACAGAGGCGAATGT(SEQ ID NO:39)。
dTrs1H的核苷酸序列：
GAAGTCCAGCTGGTGGAAAGTGGCGGTGGACTGGTTCAACCAGGAGGAAGCCTAAGACTAAGCTGCGCCGCCAGCGGTTTTAACATCAAGGACACATACATCCATTGGGTCCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTAGAGTGGGTCGCAAGGATCTACCCCACTAATGGTGGCACCAGGTACGCTGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATTAGCGCTGACACCAGCAAGAACACTGCTTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCCGAAGACACAGCCGTCTATTACTGTAGTAGATGGGGAGGTGATGGGTTCGGCGCGATGGATTACTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:40)。
dTrs1L(dTrs2L)的核苷酸序列：
GATATACAGATGACGCAGAGCCCTAGCAGTCTAAGTGCAAGCGTTGGAGACCGTGTCACCATTACCTGCCGCGCTAGCCAGGATGTCGGCACCGCAGTCGCCTGGTATCAGCAAAAACCGGGTAAGGCTCCAAAGCTGTTGATCTACAGTGCCAGCGGCCTGTACAGCGGTGTGCCAAGTAGGTTCAGCGGGAGCCGGAGTGGGACAGACTTTACACTCACTATTAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGCATGGCACAACACCCCCAACATTCGGGCAGGGAACCAAAGTTGAGATAAAACGAACGGTTGCCGCGCCAAGCGTATTTATCTTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGAGTGGTACAGCCAGCGTTGTCTGCCTTTTGAATAACTTCTATCCTCGGGAGGCAAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCACTCCAAAGCGGTAACAGCCAGGAGAGTGTGACAGAACAGGACAGCAAAGATAGTACCTACAGCCTCAGTAGTACCCTCACACTGAGCAAAGCGGACTATGAAAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAAGTGACCCACCAGGGCCTAAGCAGCCCTGTTACTAAGAGCTTCAACAGAGGCGAATGT(SEQ ID NO:41)。
dTrs2H的核苷酸序列：
GAAGTCCAGCTGGTGGAAAGTGGCGGTGGACTGGTTCAACCAGGAGGAAGCCTAAGACTAAGCTGCGCCGCCAGCGGTTTTAACATCAAGGACACAGGCATCCATTGGGTCCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTAGAGTGGGTCGCAGGCATCTACCCCACTAATGGTGGCACCGGCTACGCTGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATTAGCGCTGACACCAGCAAGAACACTGCTTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCCGAAGACACAGCCGTCTATTACTGTAGTAGAGGCGGAGGTGATGGGTTCGGCGCGATGGATTACTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:42)。
表2：pcDNA3.4载体和目的基因的引物与模板
1.2PCR反应采用TAKARA的KOD反应体系(Cat.KFX-101)、反应条件、试剂和PCR目的片段信息如表3～6所示。
表3：目的基因或pcDNA3.4的KOD反应体系
| 试剂 | 浓度 | 终浓度 | 体积(μL) |
| 2*PCR buffer for KOD | 2* | 1* | 25 |
| dNTP | 2mM each | 0.4mM each | 10 |
| 5’引物 | 10μM | 0.5μM | 2.5 |
| 3’引物 | 10μM | 0.5μM | 2.5 |
| 模板(目的基因或pcDNA3.4) | 10ng/μL | 0.2ng/μL | 1 |
| ddH2O | N/A | 8 | |
| KOD FX | 1U/μL | 20mU/μL | 1 |
| 总计 | 50 |
表4：载体pcDNA3.4的PCR反应条件
| 程序 | 温度 | 时间 | 条件 |
| 1 | 94℃ | 2min | |
| 2 | 98℃ | 10s | |
| 3 | 60℃ | 30s | |
| 4 | 68℃ | 6min | Goto Step 2:30cycles |
| 5 | 10℃ | 永久 |
表5：目的基因的PCR反应条件
| 程序 | 温度 | 时间 | 条件 |
| 1 | 94℃ | 2min | |
| 2 | 98℃ | 10s | |
| 3 | 60℃ | 30s | |
| 4 | 68℃ | 2-6min | Goto Step 2:30cycles |
| 5 | 10℃ | 永久 |
表6：PCR目的片段信息
| DNA | 引物 | 模板 | 理论长度 |
| pcDNA3.4载体 | Vector-f,Vector-r | 合成基因pcDNA3.4载体 | 6000bp |
| RtxH | RtxH-f,RtxH-r | 合成基因RtxH | 1500bp |
| RtxL | RtxL-f,RtxL-r | 合成基因RtxL | 800bp |
| TrsH | TrsH-f,TrsH-r | 合成基因TrsH | 1500bp |
| TrsL | TrsL-f,TrsL-r | 合成基因TrsL | 800bp |
| dTrs1H | dTrsH-f,dTrsH-r | 合成基因dTrs1H | 1455bp |
| dTrs1L(dTrs2L) | dTrsL-f,dTrsL-r | 合成基因dTrs1L(dTrs2L) | 744bp |
| dTrs2H | dTrsH-f,dTrsH-r | 合成基因dTrs2H | 1455bp |
| dTrs3H | dTrsH-f,dTrsH-r | 合成基因dTrs3H | 1455bp |
| dTrs3L | dTrsL-f,dTrsL-r | 合成基因dTrs3L | 744bp |
| dTrs4H | dTrsH-f,dTrsH-r | 合成基因dTrs4H | 1455bp |
| dTrs4L | dTrsL-f,dTrsL-r | 合成基因dTrs4L | 744bp |
1.3PCR结束后将样品进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，其中，电泳槽加1*TAE 300mL，于100V、30min跑胶。结果显示，琼脂糖凝胶电泳条带大小与理论大小一致。将电泳结果利用Omega Gel Extraction Kit胶回收试剂盒(Cat.D2500-01)进行回收，20μL洗脱液洗脱得到纯化后的PCR产物。电泳结果如图2-5所示，其中，图2的从左到右的泳道1-9依次为DL5000、pcDNA3.4、pcDNA3.4、pcDNA3.4、pcDNA3.4、trsH、trsL、RtxH和RtxL；图3的从左到右的泳道1-7依次为DL2000、dTrs1H、dTrs1H、dTrs2H、dTrs2H、dTrs1L和dTrs1L；图4的从左到右的泳道1-5依次为DL2000、dTrs3H、dTrs3H、dTrs3L和dTrs3L；图5的从左到右的泳道1-5依次为DL2000、dTrs4H、dTrs4H、dTrs4L和dTrs4L。
1.4将1.3中得到的切胶纯化后的PCR条带进行同源重组，利用NEB的试剂盒(
HiFi DNA Assembly Master Mix，Cat.E2621S)进行片段组装，将同源重组的反应体系在50℃条件下孵育1小时，将得到的反应产物利用Omega Cycle Pure Kit(Cat.D6492-01)进行纯化，用15μL洗脱液进行洗脱。反应体系和质粒表如表7和表8所示。
表7：同源重组的反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | 10 |
| pcDNA3.4载体 | 3 |
| 目的片段 | 0.5-1 |
| 去离子水 | 6-6.5 |
| 总计 | 20 |
表8：质粒表
1.5利用CaCl2感受态细胞DH5a转化，将1.4得到的各个质粒样品分别以1:10的比例加入到感受态细胞中，置于冰上10min，然后金属浴42℃条件下孵育45s，再置于冰上10min，最后将得到的溶液涂布于加入了氨苄青霉素(Amp.终浓度50μg/mL)的LB固体培养基中，37℃条件下过夜培养，第二天挑取单克隆于2ml LB液体培养基中(终浓度50μg/mLAmp.)，在37℃、200rpm条件下摇菌，将得到的菌液进行Sanger测序，得到测通序列，测序引物为CMV-F:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQ ID NO:79)。经测序结果比对后，确认所有测通序列与原序列一致，将单克隆菌液取100μL加入到50mL加入了氨苄青霉素(终浓度50μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下过夜培养，保存菌种，提取质粒，得到目的基因表达质粒。
2、Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白的瞬时表达
2.1转染前约24小时，取FreeStyleTM 
细胞(细胞密度为5-6×105/mL，来自于美国Gibco公司FreeStyleTMMAX CHO表达系统，货号：K900020)，在37℃、5％ CO2和120-135rpm/min条件下培养。
2.2转染当日，稀释细胞至细胞密度为1×106/mL，每个摇瓶中加入10mL细胞(细胞的存活率在95％以上)。
2.3轻轻混合FreeStyleTMMAX Reagent几次，注意不能漩涡震荡。
2.4分别取表9中各蛋白对应质粒各12.5μg，加入OptiPROTMSFM至各自总体积0.2mL并轻轻混合。
2.5取25μL的FreeStyleTMMAX Reagent，加入Opti-ProTMSFM至总体积0.4mL，轻轻混合(注意不能漩涡震荡)。混合均匀后平均加入质粒混合液中，轻轻混合以获得2支0.4mLDNA-FreeStyleTMMAX混合物，并在室温下孵育10分钟，使复合物形成。
2.6慢慢将上述2支0.4mL DNA-FreeStyleTMMAX复合物加入到细胞中，同时缓慢旋转摇瓶。
2.7在37℃、5％ CO2，120-135rpm/min培养细胞，不需要更换或补充培养基，7d后收取细胞液。
表9：不同蛋白所对应质粒
3、Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白的纯化与鉴定
Trs、dTrs1-4和Rtx培养上清经4℃、7000g离心15min后用0.22um针头滤器过滤除菌。以5倍柱体积的Buffer A1(20mM磷酸缓冲液，pH值为7.4)以平衡Protein A层析介质(流速为2mL/min)，加入处理好的样品，Buffer A1冲洗，直到吸收值达到基线，Buffer B1(0.1MGlycine-HCl，pH值为3.0)洗脱，收集洗脱峰样品，目的蛋白洗脱液用1M Tris-HCl(pH值为9.0)调至中性。超滤至PBS缓冲液中。
目的蛋白的鉴定：选择10孔的SDS-PAGE预制胶，于150V条件下跑胶50min。样品90℃加热5min，每孔上样10μg。
SDS-PAGE检测Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白的纯化效果如图6所示，其中，泳道1为Trs洗脱非还原，泳道2为Trs洗脱还原，泳道3为dTrs1洗脱非还原，泳道4为dTrs1洗脱还原，泳道5为dTrs2洗脱非还原，泳道6为dTrs2洗脱还原，泳道7为dTrs3洗脱还原，泳道8为dTrs3洗脱非还原，泳道9为dTrs4洗脱非还原，泳道10为dTrs4洗脱还原，泳道11为Rtx非还原，泳道12为Rtx还原。Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白的表达量如表10所示。
表10：Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白的表达量
| 蛋白样品 | 培养基中蛋白浓度(mg/mL) |
| Trs | 0.0086 |
| dTrs1 | 0.0317 |
| dTrs2 | 0.0182 |
| dTrs3 | 0.00017 |
| dTrs4 | 0.172 |
| Rtx | 0.025 |
4、Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白与Her2结合ELISA
4.1以购买的具有结合活性的Her2(10004-HCCH-B，义翘神州)作为底物，Trs、dTrs1-4或Rtx蛋白作为一抗，HRP偶联的山羊抗人IgG为二抗，用酶联免疫吸附方法检测Her2蛋白与Trs、dTrs1-4或Rtx蛋白的结合情况。
Her2蛋白固体20μg溶于80μL无菌水中，配成0.25mg/mL母液，分装于0.5mL EP管，10μL/管，存放于-80℃。
一抗：Trs(0.44mg/mL)，dTrs1(0.38mg/mL)，dTrs2(0.42mg/mL)，dTrs3(0.115mg/mL)，dTrs4(1.4mg/mL)，Rtx(0.21mg/mL)，其中Trs为阳性对照，Rtx为阴性对照。
二抗：HRP偶联的山羊抗人IgG(生工生物工程(上海)股份有限公司，Cat.No.D110150)。
4.2检测方案：
1)包被：用包被液稀释培养上清，每孔加入0.1μg/100μL Her2蛋白(34μL母液+8466μL包被液)，封板，37℃孵育2h。弃去孔内液体，洗液洗板3次，每次200μL，静置2min。
2)封闭：每孔加入封闭液100μL，4℃过夜，弃去孔内液体。
3)一抗(Trs、dTrs1-4或Rtx)孵育：用抗体稀释液分别稀释Trs、dTrs1-4和Rtx，每孔加入100μL，封板，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗板3次，每次200μL，静置2min。
4)二抗孵育：用抗体稀释液按照1:2000稀释二抗，每孔加入100μL，封板，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用洗液洗板3次，每次200μL，静置2min。
5)检测：每孔加入TMB 100μL，封板，37℃避光孵育15min，此时孔内呈蓝色，每孔加入终止液100μL，立即变黄，于450nm下检测OD值，检测结果如图7和表11所示。结果发现，和Trs相比，dTrs1-dTrs4与Her2的结合能力逐渐降低，其中dTrs4与Her2结合能力最低，接近于阴性对照Rtx，此外，还发现dTrs4的表达量高，因此可选择dTrs4作为药物骨架。
其中，包被液的配制如下表所示：
封闭液的配制如下表所示：
抗体稀释液的配制如下表所示：
洗液的配制如下表所示：
表11：Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白与Her2结合结果
注：低于下限和高于上限均超出计算范围，其中，低于下限表示结合能力很强，高于上限表示结合能力很弱。
5、Trs、dTrs1-4和Rtx蛋白与IgA、IgM或HAS的结合
5.1实验步骤如下：
1)采用100μL/孔含10μg/mL IgA/IgM/HSA包被液封板，4℃过夜；其中，IgA来源于人类血清(Sigma-Aldrich，I4036)、浓度为1mg/mL，IgM来源于人类血清(Sigma-Aldrich，I8260)、浓度为1mg/mL，HSA(Absin，abs47047388)浓度为20mg/mL；
2)将步骤1)弃液，用PBST(以双蒸水(灭菌)稀释索莱宝10*PBS 10倍，+0.1％吐温)洗板，洗板机洗4次，甩板机在600×g条件下甩干1min，并拍干若干次；
3)加入100μL/孔封闭液(0.5％Casein(pH 7.09，1M NaOH>50mg/mL配制小份，加PBST，HCl调pH后定容配制)，37℃温育60min；然后重复步骤2)洗板；
4)加入100μL/孔10倍梯度稀释(10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001)的各组样品(Trs、dTrs1-4或Rtx)，封板，室温温育30min；然后重复步骤2)洗板；
5)每孔加入100μL检测抗体(Goat Anti-Human IgG-Fc Secondary Antibody(HRPμg/mL)，Sino Biological、SSA001，用PBST进行1:3K稀释至使用浓度为1.2μg/mL)，封板，室温温育30min；然后重复步骤2)洗板；
6)每孔加入100μL索莱宝TMB底物显色液，25℃避光温育6min后，每孔加入100μL索莱宝终止液，测OD450。
5.2结果
以人IgA铺板进行ELISA检测的结果如图21所示，其中p<0.01**、p<0.05*。结果表明，dTrs4作为检测分子产生的信号非常低，甚至低于野生型的Trs，以及无关抗体RTX。因此，可表明dTrs4不与人IgA结合。
其中，图21的差异性分析如下表所示：
以人IgA铺板，10ug/mL时dTRS4与其它分子进行t检验的p值。
以人IgM铺板进行ELISA检测的结果如图22所示，其中p<0.01**、p<0.05*。结果表明，dTrs4作为检测分子产生的信号非常低，甚至低于野生型的Trs，以及无关抗体RTX。因此，可表明dTrs4不与人IgM结合。
其中，图22的差异性分析如下表所示：
以人IgM铺板，10ug/mL时dTRS4与其它分子进行t检验的p值。
以人HSA铺板进行ELISA检测的结果如图23所示，其中p<0.01**、p<0.05*。结果表明，除无关抗体RTX产生的信号略高，其它分子信号均很低。其中，dTrs4作为检测分子产生的信号最低，甚至低于野生型的Trs，以及无关抗体RTX。因此，可表明dTrs4不与人HSA结合。
其中，图23的差异性分析如下表所示：
以人HSA铺板，10ug/mL时dTRS4与其它分子进行t检验的p值。
实施例2：RC1-RC8蛋白的制备和选择
1、表达构建：RC1-RC8蛋白的表达构建的步骤与实施例1中表达构建相同，区别仅在于目的基因的不同。RC1-RC8蛋白的结构示意图如图8所示，PLA2R的结构示意图如图9所示，其中，RC1-RC8蛋白中的PLA2R抗原表位肽CFC1(SEQ ID NO:21)为PLA2R片段的21至367(Glu)氨基酸序列，PLA2R抗原表位肽CFC2(SEQ ID NO:22)为PLA2R片段的21至510(Asp)氨基酸序列。
其中，目的基因的名称、引物、序列和重链、轻链及其信号肽的组成如表12所示，目的基因的名称和序列如表13所示，pcDNA3.4载体和目的基因的引物与模板如表14所示，目的片段信息如表15所示。
其中，
PLA2R信号肽核苷酸序列：
ATGCTGCTGTCGCCGTCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGGGCGCCGCGGGGCTGCGCC(SEQ IDNO:80)。
Trs重链信号肽核苷酸序列：
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGT(SEQ IDNO:81)。
Trs轻链信号肽核苷酸序列：
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC(SEQ ID NO:82)。
纯化后的PCR产物的电泳结果如图10-12所示，其中，图10的从左到右的泳道1-5依次为DL5000、pcDNA3.4、pcDNA3.4、pcDNA3.4和pcDNA3.4；图11的从左到右的泳道1-13依次为DL5000、pcDNA3.4、pcDNA3.4、pcDNA3.4、pcDNA3.4、RC1H-1、RC1H-2、RC2L-1、RC2L-2、RC4H-1、RC4H-2、RC5L-1和RC5L-2；图12的从左到右的泳道1-7依次为DL5000、无关、无关、RC3、RC3、RC6和RC6。
将切胶纯化后的PCR条带进行同源重组，体系与表7一致，构建的质粒表如表16所示。
表12：RC1-RC8蛋白的重链和轻链组成
表13：目的基因的名称和序列
注：RC1H、RC2L、RC4H和RC5L都是通过两段PCR片段拼接而成，即为，RC1H由RC1H-1和RC1H-2拼接而成，RC2L由RC2L-1和RC2L-2拼接而成，RC4H由RC4H-1和RC4H-2拼接而成，RC5L由RC5L-1和RC5L-2拼接而成。
其中，RC1H的氨基酸序列：
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIGGTGIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPTNGGTGYAGSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGDGFGAMGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:57)。
RC1H的核苷酸序列：
GAGGGTGTGGCGGCGGCGCTTACCCCCGAGCGGCTCCTGGAGTGGCAGGATAAAGGAATATTTGTTATCCAAAGTGAGAGTCTCAAGAAATGCATTCAAGCAGGTAAATCGGTTCTGACCCTGGAGAACTGCAAGCAAGCAAACAAGCACATGCTGTGGAAATGGGTTTCAAACCATGGCCTCTTTAACATAGGAGGCAGTGGTTGCCTGGGCCTGAATTTCTCCGCCCCAGAGCAGCCATTAAGCTTATATGAATGTGACTCCACCCTCGTTTCCTTACGGTGGCGCTGTAACAGGAAGATGATCACAGGCCCGCTGCAGTACTCTGTCCAGGTGGCGCATGACAACACAGTGGTGGCCTCACGGAAGTATATTCATAAGTGGATTTCTTATGGGTCAGGTGGTGGAGACATTTGTGAATATCTACACAAAGATTTGCATACAATCAAAGGGAACACCCACGGGATGCCGTGTATGTTTCCCTTCCAGTATAACCATCAGTGGCATCATGAATGTACCCGTGAAGGTCGGGAAGATGACTTACTGTGGTGTGCCACGACAAGCCGTTATGAAAGAGATGAAAAGTGGGGATTTTGCCCTGATCCCACCTCTGCAGAAGTAGGTTGTGATACTATTTGGGAGAAGGACCTCAATTCACACATTTGCTACCAGTTCAACCTGCTTTCATCTCTCTCTTGGAGTGAGGCACATTCTTCATGCCAGATGCAAGGAGGTACGCTGTTAAGTATTACAGATGAAACTGAAGAAAATTTCATAAGGGAGCACATGAGCAGTAAAACAGTGGAGGTGTGGATGGGCCTCAATCAGCTGGATGAACACGCTGGCTGGCAGTGGTCTGATGGAACGCCGCTCAACTATCTGAATTGGAGCCCAGAGGTAAATTTTGAGCCATTTGTTGAAGATCACTGTGGAACATTTAGTTCATTTATGCCAAGTGCCTGGAGGAGTCGGGATTGTGAGTCCACCTTGCCATATATATGTAAAAAATATCTAAACCACATTGATCATGAAATAGTTGAAGGCGGTGGAGGCTCCGGCGGAGGTGGAAGCGAAGTCCAGCTGGTGGAAAGTGGCGGTGGACTGGTTCAACCAGGAGGAAGCCTAAGACTAAGCTGCGCCGCCAGCGGTTTTAACATCGGTGGCACAGGCATCCATTGGGTCCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTAGAGTGGGTCGCAGGCATCTACCCCACTAATGGTGGCACCGGCTACGCTGGTAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATTAGCGCTGACACCAGCAAGAACACTGCTTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCCGAAGACACAGCCGTCTATTACTGTAGTAGAGGCGGAGGTGATGGGTTCGGCGCGATGGGCTACTGGGGACAGGGCACACTCGTGACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQID NO:58)。
RC2L的氨基酸序列：
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHGTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:59)。
RC2L的核苷酸序列：
GAGGGTGTGGCGGCGGCGCTTACCCCCGAGCGGCTCCTGGAGTGGCAGGATAAAGGAATATTTGTTATCCAAAGTGAGAGTCTCAAGAAATGCATTCAAGCAGGTAAATCGGTTCTGACCCTGGAGAACTGCAAGCAAGCAAACAAGCACATGCTGTGGAAATGGGTTTCAAACCATGGCCTCTTTAACATAGGAGGCAGTGGTTGCCTGGGCCTGAATTTCTCCGCCCCAGAGCAGCCATTAAGCTTATATGAATGTGACTCCACCCTCGTTTCCTTACGGTGGCGCTGTAACAGGAAGATGATCACAGGCCCGCTGCAGTACTCTGTCCAGGTGGCGCATGACAACACAGTGGTGGCCTCACGGAAGTATATTCATAAGTGGATTTCTTATGGGTCAGGTGGTGGAGACATTTGTGAATATCTACACAAAGATTTGCATACAATCAAAGGGAACACCCACGGGATGCCGTGTATGTTTCCCTTCCAGTATAACCATCAGTGGCATCATGAATGTACCCGTGAAGGTCGGGAAGATGACTTACTGTGGTGTGCCACGACAAGCCGTTATGAAAGAGATGAAAAGTGGGGATTTTGCCCTGATCCCACCTCTGCAGAAGTAGGTTGTGATACTATTTGGGAGAAGGACCTCAATTCACACATTTGCTACCAGTTCAACCTGCTTTCATCTCTCTCTTGGAGTGAGGCACATTCTTCATGCCAGATGCAAGGAGGTACGCTGTTAAGTATTACAGATGAAACTGAAGAAAATTTCATAAGGGAGCACATGAGCAGTAAAACAGTGGAGGTGTGGATGGGCCTCAATCAGCTGGATGAACACGCTGGCTGGCAGTGGTCTGATGGAACGCCGCTCAACTATCTGAATTGGAGCCCAGAGGTAAATTTTGAGCCATTTGTTGAAGATCACTGTGGAACATTTAGTTCATTTATGCCAAGTGCCTGGAGGAGTCGGGATTGTGAGTCCACCTTGCCATATATATGTAAAAAATATCTAAACCACATTGATCATGAAATAGTTGAAGGCGGTGGAGGCTCCGGCGGAGGTGGAAGCGATATACAGATGACGCAGAGCCCTAGCAGTCTAAGTGCAAGCGTTGGAGACCGTGTCACCATTACCTGCCGCGCTAGCCAGGGCGTCGGCACCGCAGTCGCCTGGTATCAGCAAAAAC CGGGTAAGGCTCCAAAGCTGTTGATCTACAGTGCCAGCGGCCTGTACAGCGGTGTGCCAAGTAGGTTCAGCGGGAGCCGGAGTGGGACAGACTTTACACTCACTATTAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGCATGGCACAACACCCCCAACATTCGGGCAGGGAACCAAAGTTGAGATAAAACGAACGGTTGCCGCGCCAAGCGTATTTATCTTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGAGTGGTACAGCCAGCGTTGTCTGCCTTTTGAATAACTTCTATCCTCGGGAGGCAAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCACTCCAAAGCGGTAACAGCCAGGAGAGTGTGACAGAACAGGACAGCAAAGATAGTACCTACAGCCTCAGTAGTACCCTCACACTGAGCAAAGCGGACTATGAAAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAAGTGACCCACCAGGGCCTAAGCAGCCCTGTTACTAAGAGCTTCAACAGAGGCGAATGT(SEQ ID NO:60)。
RC3的氨基酸序列：
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEGGGGSGGGGSTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:61)。
RC3的核苷酸序列：
GAGGGTGTGGCGGCGGCGCTTACCCCCGAGCGGCTCCTGGAGTGGCAGGATAAAGGAATATTTGTTATCCAAAGTGAGAGTCTCAAGAAATGCATTCAAGCAGGTAAATCGGTTCTGACCCTGGAGAACTGCAAGCAAGCAAACAAGCACATGCTGTGGAAATGGGTTTCAAACCATGGCCTCTTTAACATAGGAGGCAGTGGTTGCCTGGGCCTGAATTTCTCCGCCCCAGAGCAGCCATTAAGCTTATATGAATGTGACTCCACCCTCGTTTCCTTACGGTGGCGCTGTAACAGGAAGATGATCACAGGCCCGCTGCAGTACTCTGTCCAGGTGGCGCATGACAACACAGTGGTGGCCTCACGGAAGTATATTCATAAGTGGATTTCTTATGGGTCAGGTGGTGGAGACATTTGTGAATATCTACACAAAGATTTGCATACAATCAAAGGGAACACCCACGGGATGCCGTGTATGTTTCCCTTCCAGTATAACCATCAGTGGCATCATGAATGTACCCGTGAAGGTCGGGAAGATGACTTACTGTGGTGTGCCACGACAAGCCGTTATGAAAGAGATGAAAAGTGGGGATTTTGCCCTGATCCCACCTCTGCAGAAGTAGGTTGTGATACTATTTGGGAGAAGGACCTCAATTCACACATTTGCTACCAGTTCAACCTGCTTTCATCTCTCTCTTGGAGTGAGGCACATTCTTCATGCCAGATGCAAGGAGGTACGCTGTTAAGTATTACAGATGAAACTGAAGAAAATTTCATAAGGGAGCACATGAGCAGTAAAACAGTGGAGGTGTGGATGGGCCTCAATCAGCTGGATGAACACGCTGGCTGGCAGTGGTCTGATGGAACGCCGCTCAACTATCTGAATTGGAGCCCAGAGGTAAATTTTGAGCCATTTGTTGAAGATCACTGTGGAACATTTAGTTCATTTATGCCAAGTGCCTGGAGGAGTCGGGATTGTGAGTCCACCTTGCCATATATATGTAAAAAATATCTAAACCACATTGATCATGAAATAGTTGAAGGCGGTGGAGGCTCCGGCGGAGGTGGAAGCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:62)。
RC4H的氨基酸序列：
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEKDAWKYYATHCEPGWNPYNRNCYKLQKEEKTWHEALRSCQADNSALIDITSLAEVEFLVTLLGDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSNDSSVIFTNWHTLEPHIFPNRSQLCVSAEQSEGHWKVKNCEERLFYICKKAGHVLSDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIGGTGIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPTNGGTGYAGSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGGGDGFGAMGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:63)。
RC4H的核苷酸序列：
GAGGGTGTGGCGGCGGCGCTTACCCCCGAGCGGCTCCTGGAGTGGCAGGATAAAGGAATATTTGTTATCCAAAGTGAGAGTCTCAAGAAATGCATTCAAGCAGGTAAATCGGTTCTGACCCTGGAGAACTGCAAGCAAGCAAACAAGCACATGCTGTGGAAATGGGTTTCAAACCATGGCCTCTTTAACATAGGAGGCAGTGGTTGCCTGGGCCTGAATTTCTCCGCCCCAGAGCAGCCATTAAGCTTATATGAATGTGACTCCACCCTCGTTTCCTTACGGTGGCGCTGTAACAGGAAGATGATCACAGGCCCGCTGCAGTACTCTGTCCAGGTGGCGCATGACAACACAGTGGTGGCCTCACGGAAGTATATTCATAAGTGGATTTCTTATGGGTCAGGTGGTGGAGACATTTGTGAATATCTACACAAAGATTTGCATACAATCAAAGGGAACACCCACGGGATGCCGTGTATGTTTCCCTTCCAGTATAACCATCAGTGGCATCATGAATGTACCCGTGAAGGTCGGGAAGATGACTTACTGTGGTGTGCCACGACAAGCCGTTATGAAAGAGATGAAAAGTGGGGATTTTGCCCTGATCCCACCTCTGCAGAAGTAGGTTGTGATACTATTTGGGAGAAGGACCTCAATTCACACATTTGCTACCAGTTCAACCTGCTTTCATCTCTCTCTTGGAGTGAGGCACATTCTTCATGCCAGATGCAAGGAGGTACGCTGTTAAGTATTACAGATGAAACTGAAGAAAATTTCATAAGGGAGCACATGAGCAGTAAAACAGTGGAGGTGTGGATGGGCCTCAATCAGCTGGATGAACACGCTGGCTGGCAGTGGTCTGATGGAACGCCGCTCAACTATCTGAATTGGAGCCCAGAGGTAAATTTTGAGCCATTTGTTGAAGATCACTGTGGAACATTTAGTTCATTTATGCCAAGTGCCTGGAGGAGTCGGGATTGTGAGTCCACCTTGCCATATATATGTAAAAAATATCTAAACCACATTGATCATGAAATAGTTGAAAAAGATGCGTGGAAATATTATGCTACCCACTGTGAGCCTGGCTGGAATCCCTACAATCGTAATTGCTACAAACTTCAGAAAGAAGAAAAGACCTGGCATGAGGCTCTGCGTTCTTGTCAGGCTGATAACAGTGCATTAATAGACATAACCTCATTAGCAGAGGTGGAGTTTCTTGTAACCCTCCTTGGAGATGAAAATGCATCAGAAACATGGATTGGTTTGAGCAGCAATAAAATTCCAGTTTCCTTTGAATGGTCTAATGACTCTTCAGTCATCTTTACTAATTGGCACACACTTGAGCCCCACATTTTTCCAAATAGAAGCCAGCTGTGTGTCTCAGCAGAGCAGTCTGAGGGACACTGGAAAGTCAAAAATTGTGAAGAAAGACTTTTTTACATTTGTAAAAAAGCAGGCCATGTCCTCTCTGATGGCGGTGGAGGCTCCGGCGGAGGTGGAAGCGAAGTCCAGCTGGTGGAAAGTGGCGGTGGACTGGTTCAACCAGGAGGAAGCCTAAGACTAAGCTGCGCCGCCAGCGGTTTTAACATCGGTGGCACAGGCATCCATTGGGTCCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTAGAGTGGGTCGCAGGCATCTACCCCACTAATGGTGGCACCGGCTACGCTGGTAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATTAGCGCTGACACCAGCAAGAACACTGCTTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCCGAAGACACAGCCGTCTATTACTGTAGTAGAGGCGGAGGTGATGGGTTCGGCGCGATGGGCTACTGGGGACAGGGCACACTCGTG ACCGTTAGTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:64)。
RC5L的氨基酸序列：
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEKDAWKYYATHCEPGWNPYNRNCYKLQKEEKTWHEALRSCQADNSALIDITSLAEVEFLVTLLGDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSNDSSVIFTNWHTLEPHIFPNRSQLCVSAEQSEGHWKVKNCEERLFYICKKAGHVLSDGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHGTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:65)。
RC5L的核苷酸序列：
GAGGGTGTGGCGGCGGCGCTTACCCCCGAGCGGCTCCTGGAGTGGCAGGATAAAGGAATATTTGTTATCCAAAGTGAGAGTCTCAAGAAATGCATTCAAGCAGGTAAATCGGTTCTGACCCTGGAGAACTGCAAGCAAGCAAACAAGCACATGCTGTGGAAATGGGTTTCAAACCATGGCCTCTTTAACATAGGAGGCAGTGGTTGCCTGGGCCTGAATTTCTCCGCCCCAGAGCAGCCATTAAGCTTATATGAATGTGACTCCACCCTCGTTTCCTTACGGTGGCGCTGTAACAGGAAGATGATCACAGGCCCGCTGCAGTACTCTGTCCAGGTGGCGCATGACAACACAGTGGTGGCCTCACGGAAGTATATTCATAAGTGGATTTCTTATGGGTCAGGTGGTGGAGACATTTGTGAATATCTACACAAAGATTTGCATACAATCAAAGGGAACACCCACGGGATGCCGTGTATGTTTCCCTTCCAGTATAACCATCAGTGGCATCATGAATGTACCCGTGAAGGTCGGGAAGATGACTTACTGTGGTGTGCCACGACAAGCCGTTATGAAAGAGATGAAAAGTGGGGATTTTGCCCTGATCCCACCTCTGCAGAAGTAGGTTGTGATACTATTTGGGAGAAGGACCTCAATTCACACATTTGCTACCAGTTCAACCTGCTTTCATCTCTCTCTTGGAGTGAGGCACATTCTTCATGCCAGATGCAAGGAGGTACGCTGTTAAGTATTACAGATGAAACTGAAGAAAATTTCATAAGGGAGCACATGAGCAGTAAAACAGTGGAGGTGTGGATGGGCCTCAATCAGCTGGATGAACACGCTGGCTGGCAGTGGTCTGATGGAACGCCGCTCAACTATCTGAATTGGAGCCCAGAGGTAAATTTTGAGCCATTTGTTGAAGATCACTGTGGAACATTTAGTTCATTTATGCCAAGTGCCTGGAGGAGTCGGGATTGTGAGTCCACCTTGCCATATATATGTAAAAAATATCTAAACCACATTGATCATGAAATAGTTGAAAAAGATGCGTGGAAATATTATGCTACCCACTGTGAGCCTGGCTGGAATCCCTACAATCGTAATTGCTACAAACTTCAGAAAGAA GAAAAGACCTGGCATGAGGCTCTGCGTTCTTGTCAGGCTGATAACAGTGCATTAATAGACATAACCTCATTAGCAGAGGTGGAGTTTCTTGTAACCCTCCTTGGAGATGAAAATGCATCAGAAACATGGATTGGTTTGAGCAGCAATAAAATTCCAGTTTCCTTTGAATGGTCTAATGACTCTTCAGTCATCTTTACTAATTGGCACACACTTGAGCCCCACATTTTTCCAAATAGAAGCCAGCTGTGTGTCTCAGCAGAGCAGTCTGAGGGACACTGGAAAGTCAAAAATTGTGAAGAAAGACTTTTTTACATTTGTAAAAAAGCAGGCCATGTCCTCTCTGATGGCGGTGGAGGCTCCGGCGGAGGTGGAAGCGATATACAGATGACGCAGAGCCCTAGCAGTCTAAGTGCAAGCGTTGGAGACCGTGTCACCATTACCTGCCGCGCTAGCCAGGGCGTCGGCACCGCAGTCGCCTGGTATCAGCAAAAACCGGGTAAGGCTCCAAAGCTGTTGATCTACAGTGCCAGCGGCCTGTACAGCGGTGTGCCAAGTAGGTTCAGCGGGAGCCGGAGTGGGACAGACTTTACACTCACTATTAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGCATGGCACAACACCCCCAACATTCGGGCAGGGAACCAAAGTTGAGATAAAACGAACGGTTGCCGCGCCAAGCGTATTTATCTTTCCCCCCAGTGATGAGCAACTGAAGAGTGGTACAGCCAGCGTTGTCTGCCTTTTGAATAACTTCTATCCTCGGGAGGCAAAGGTCCAGTGGAAAGTGGATAATGCACTCCAAAGCGGTAACAGCCAGGAGAGTGTGACAGAACAGGACAGCAAAGATAGTACCTACAGCCTCAGTAGTACCCTCACACTGAGCAAAGCGGACTATGAAAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAAGTGACCCACCAGGGCCTAAGCAGCCCTGTTACTAAGAGCTTCAACAGAGGCGAATGT(SEQ ID NO:66)。
RC6的氨基酸序列：
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEKDAWKYYATHCEPGWNPYNRNCYKLQKEEKTWHEALRSCQADNSALIDITSLAEVEFLVTLLGDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSNDSSVIFTNWHTLEPHIFPNRSQLCVSAEQSEGHWKVKNCEERLFYICKKAGHVLSDGGGGSGGGGSTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:67)。
RC6的核苷酸序列：
GAGGGTGTGGCGGCGGCGCTTACCCCCGAGCGGCTCCTGGAGTGGCAGGATAAAGGAATATTTGTTATCCAAAGTGAGAGTCTCAAGAAATGCATTCAAGCAGGTAAATCGGTTCTGACCCTGGAGAACTGCAAGCAAGCAAACAAGCACATGCTGTGGAAATGGGTTTCAAACCATGGCCTCTTTAACATAGGAGGCAGTGGTTGCCTGGGCCTGAATTTCTCCGCCCCAGAGCAGCCATTAAGCTTATATGAATGTGACTCCACCCTCGTTTCCTTACGGTGGCGCTGTAACAGGAAGATGATCACAGGCCCGCTGCAGTACTCTGTCCAGGTGGCGCATGACAACACAGTGGTGGCCTCACGGAAGTATATTCATAAGTGGATTTCTTATGGGTCAGGTGGTGGAGACATTTGTGAATATCTACACAAAGATTTGCATACAATCAAAGGGAACACCCACGGGATGCCGTGTATGTTTCCCTTCCAGTATAACCATCAGTGGCATCATGAATGTACCCGTGAAGGTCGGGAAGATGACTTACTGTGGTGTGCCACGACAAGCCGTTATGAAAGAGATGAAAAGTGGGGATTTTGCCCTGATCCCACCTCTGCAGAAGTAGGTTGTGATACTATTTGGGAGAAGGACCTCAATTCACACATTTGCTACCAGTTCAACCTGCTTTCATCTCTCTCTTGGAGTGAGGCACATTCTTCATGCCAGATGCAAGGAGGTACGCTGTTAAGTATTACAGATGAAACTGAAGAAAATTTCATAAGGGAGCACATGAGCAGTAAAACAGTGGAGGTGTGGATGGGCCTCAATCAGCTGGATGAACACGCTGGCTGGCAGTGGTCTGATGGAACGCCGCTCAACTATCTGAATTGGAGCCCAGAGGTAAATTTTGAGCCATTTGTTGAAGATCACTGTGGAACATTTAGTTCATTTATGCCAAGTGCCTGGAGGAGTCGGGATTGTGAGTCCACCTTGCCATATATATGTAAAAAATATCTAAACCACATTGATCATGAAATAGTTGAAAAAGATGCGTGGAAATATTATGCTACCCACTGTGAGCCTGGCTGGAATCCCTACAATCGTAATTGCTACAAACTTCAGAAAGAA GAAAAGACCTGGCATGAGGCTCTGCGTTCTTGTCAGGCTGATAACAGTGCATTAATAGACATAACCTCATTAGCAGAGGTGGAGTTTCTTGTAACCCTCCTTGGAGATGAAAATGCATCAGAAACATGGATTGGTTTGAGCAGCAATAAAATTCCAGTTTCCTTTGAATGGTCTAATGACTCTTCAGTCATCTTTACTAATTGGCACACACTTGAGCCCCACATTTTTCCAAATAGAAGCCAGCTGTGTGTCTCAGCAGAGCAGTCTGAGGGACACTGGAAAGTCAAAAATTGTGAAGAAAGACTTTTTTACATTTGTAAAAAAGCAGGCCATGTCCTCTCTGATGGCGGTGGAGGCTCCGGCGGAGGTGGAAGCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:68)。
表14：pcDNA3.4载体和目的基因的引物与模板
表15：PCR目的片段信息
表16：质粒表
| 质粒名称 | 目的片段 | 目的片段体积 | 去离子水体积 |
| pcDNA3.4-RC1H | RC1H-1,RC1H-2 | 各0.5μL | 6μL |
| pcDNA3.4-RC2L | RC2L-1,RC2L-2 | 各0.5μL | 6μL |
| pcDNA3.4-RC3 | RC3 | 0.5μL | 6.5μL |
| pcDNA3.4-RC4H | RC4H-1,RC4H-2 | 各0.5μL | 6μL |
| pcDNA3.4-RC5L | RC5L-1,RC5L-2 | 各0.5μL | 6μL |
| pcDNA3.4-RC6 | RC6 | 0.5μL | 6.5μL |
2、RC1-RC8蛋白的瞬时表达
2.1转染前约24小时，取FreeStyleTM 
细胞(细胞密度为5-6×105/mL，来自于美国Gibco公司FreeStyleTMMAX CHO表达系统，货号：K900020)，37℃、5％ CO2，120-135rpm/min培养。
2.2转染当日，稀释细胞至细胞密度为1×106/mL，每个摇瓶中加入10mL细胞(细胞的存活率在95％以上)。
2.3轻轻混合FreeStyleTMMAX Reagent几次，注意不能漩涡震荡。
2.4分别取表17中各蛋白对应质粒各12.5μg，加入OptiPROTMSFM至各自总体积0.2mL并轻轻混合。
2.5取25μL的FreeStyleTMMAX Reagent，加入Opti-ProTMSFM至总体积0.4mL，轻轻混合(注意不能漩涡震荡)。混合均匀后平均加入质粒混合液中，轻轻混合以获得2支0.4mLDNA-FreeStyleTMMAX混合物，并在室温下孵育10分钟，使复合物形成(RC3、RC6蛋白取12.5μLFreeStyleTMMAX Reagent，加入Opti-ProTMSFM至总体积0.2mL，最终获得1支0.4mL DNA-FreeStyleTMMAX混合物)。
2.6慢慢将上述2支0.4mL DNA-FreeStyleTMMAX复合物加入到细胞中(RC3、RC6蛋白只有1支DNA-FreeStyleTMMAX复合物)，同时缓慢旋转摇瓶。
2.7在37℃、5％ CO2和120-135rpm/min条件下培养细胞，不需要更换或补充培养基，7d后收取细胞液。
表17：RC1-RC8蛋白所对应的质粒
3、RC1-RC8蛋白的纯化与鉴定
RC1-RC8培养上清经4℃、7000g条件下离心15min后，用0.22μm针头滤器过滤除菌。以5倍柱体积的Buffer A1以平衡Protein A层析介质(流速为2mL/min)，加入处理好的样品，Buffer A1冲洗，直到吸收值达到基线，Buffer B1洗脱，收集洗脱峰样品，目的蛋白洗脱液用1M Tris-HCl(pH值为9.0)调至中性。Super dex200过滤至PBS中。
目的蛋白的鉴定：选择10孔的SDS-PAGE预制胶，于150V条件下跑胶50min。样品90℃加热5min，每孔上样3μg。
SDS-PAGE检测RC1-RC8蛋白的纯化效果如图13所示，其中，泳道M为marker，泳道1为RC1洗脱非还原，泳道2为RC1洗脱还原，泳道3为RC2洗脱还原，泳道4为RC2洗脱非还原，泳道5为RC3洗脱非还原，泳道6为RC3洗脱还原，泳道7为RC4洗脱还原，泳道8为RC4洗脱非还原，泳道9为RC5洗脱非还原，泳道10为RC5洗脱还原，泳道11为RC6洗脱非还原，泳道12为RC6洗脱还原，泳道13为RC7洗脱非还原，泳道14为RC7洗脱还原，泳道15为RC8洗脱非还原，泳道16为RC8洗脱还原。RC1-RC8蛋白的表达量如表18所示。
表18：RC1-RC8蛋白的表达量
| 样品 | 培养基中蛋白浓度(mg/mL) |
| RC1 | 0.363 |
| RC2 | 0.333 |
| RC3 | 0.0234 |
| RC4 | 0.19 |
| RC5 | 0.243 |
| RC6 | 0.087 |
| RC7 | 0.123 |
| RC8 | 0.103 |
4、RC1-RC8的稳定性考察
球蛋白分子在水溶液中单独存在时是低能量状态，会形成疏水氨基酸包裹在内，亲水氨基酸曝露在外的折叠状态。但在多个或大量分子存在时，多个分子之间发生相互作用，改变折叠状态形成能量上更低的大分子聚集物。温度升高会促进蛋白质的聚集。蛋白质聚集是许多球蛋白的常见现象，蛋白质聚集会导致蛋白质失去原有的高级结构以及功能，会影响蛋白质药物质量标准的确定以及制剂成分，通常是蛋白质药物或各种应用场景中避免的。作为候选药物分子，通常倾向于选择聚集程度较低的分子。因此，对本实施例步骤3制备得到的RC1-RC8进行稳定性考察，具体步骤如下：
RC2在-20℃储存时有明显降解，稳定性较差，未进行后续实验。
取RC1、RC3、RC4、RC5、RC6、RC7和RC8、以及CC1h(氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:93所示，采用本领域常规方法制备获得)分别采用样品缓冲液(25mM磷酸钠+75mM NaCl+40％甘油(pH 7.0))稀释至相同的浓度，然后在37℃下考察24小时和48小时，结果参见图24。
其中，RC1、RC3、RC4、RC5、RC6、RC7、RC8和CC1h的分子量如下表所示：
| 蛋白 | CC1h | RC1 | RC2 | RC3 | RC4 | RC5 | RC6 | RC7 | RC8 |
| 分子量(KD) | 41 | 223 | 223 | 130 | 257 | 257 | 164 | 304 | 371 |
结果发现，CC1h在37℃放置24h后出现聚集(约82KD)，且48h后聚集增加。RC3,RC6几乎无聚集；RC1,RC4出现少量的二倍分子量条带，且48h强于24h，但相较于CC1h，RC1,RC4聚集程度较轻。因此，进一步说明RC3、RC6、RC1和RC4相对CC1h具有较轻的聚集倾向，可能具有较好的成药性。
其中，CC1h的氨基酸序列和核苷酸序列如下所示：
EGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEGGHHHHHH(SEQ ID NO:92)；
gagggtgtggcggcggcgcttacccccgagcggctcctggagtggcaggataaaggaatatttgttatccaaagtgagagtctcaagaaatgcattcaagcaggtaaatcggttctgaccctggagaactgcaagcaagcaaacaagcacatgctgtggaaatgggtttcaaaccatggcctctttaacataggaggcagtggttgcctgggcctgaatttctccgccccagagcagccattaagcttatatgaatgtgactccaccctcgtttccttacggtggcgctgtaacaggaagatgatcacaggcccgctgcagtactctgtccaggtggcgcatgacaacacagtggtggcctcacggaagtatattcataagtggatttcttatgggtcaggtggtggagacatttgtgaatatctacacaaagatttgcatacaatcaaagggaacacccacgggatgccgtgtatgtttcccttccagtataaccatcagtggcatcatgaatgtacccgtgaaggtcgggaagatgacttactgtggtgtgccacgacaagccgttatgaaagagatgaaaagtggggattttgccctgatcccacctctgcagaagtaggttgtgatactatttgggagaaggacctcaattcacacatttgctaccagttcaacctgctttcatctctctcttggagtgaggcacattcttcatgccagatgcaaggaggtacgctgttaagtattacagatgaaactgaagaaaatttcataagggagcacatgagcagtaaaacagtggaggtgtggatgggcctcaatcagctggatgaacacgctggctggcagtggtctgatggaacgccgctcaactatctgaattggagcccagaggtaaattttgagccatttgttgaagatcactgtggaacatttagttcatttatgccaagtgcctggaggagtcgggattgtgagtccaccttgccatatatatgtaaaaaatatctaaaccacattgatcatgaaatagttgaaggaggtcatcaccatcaccatcac(SEQ ID NO:93)。
5、RC1-RC8对血浆样品中PLA2R-Ab的中和
采用当前唯一获美国FDA批准用于PLA2R抗体阳性膜性肾病诊断的试剂盒(德国欧蒙，ELISA法定量检测血液样品中PLA2R-Ab浓度)进行检测，所有步骤按照说明书进行。对3例PLA2R抗体阳性膜性肾病阳性患者的血浆分别编号为pMN-2、pMN-4及pMN-7。
检测了RC1-RC8对这3例膜性肾病阳性病人血浆中PLA2R-Ab的中和效果，得到了如图14-16和表19的中和率。其中，图14-16中的中和率neutralization ratio＝(1-(加入抑制剂后的PLA2R-Ab检测值/不加抑制剂的PLA2R-Ab检测值))*100％，该值越大，表明能够检测到的自身免疫抗体越少，相应的抑制效果越好。(假定静脉给药，生物利用度100％，本抑制剂在人身上的分布容积为8L，则本研究中抑制剂浓度相当于5μg/mL*8L＝40mg/人的剂量)。
中和率的计算如下所示：
诊断试剂盒中的捕获分子为PLA2R。
未加药物分子时：
其中，[PLA2R·Ab]1对应了抗体的检测浓度。
加入药物分子后：
其中，[PLA2R·Ab]2对应了此时抗体的检测浓度。
中和率neutralization ratio(NR)：
在ELISA检测中，PLA2R作为捕获抗原是大大过量的，因此[PLA2R]2≈[PLA2R]1，故
即加入药物分子导致PLA2R-Ab在血浆中减少的比例。可代表药物分子的中和效果。
表19：RC1-RC8对这3例膜性肾病阳性病人血浆中PLA2R-Ab的中和率
3组实验中RC1-RC8蛋白的给药量均为5μg/mL。pMN-2为阳性样品，针对血浆中浓度在44.79RU/mL左右的自身免疫抗体，各组药物都表现出超过95％的中和效果。pMN-4为阳性样品，针对血浆中浓度在124.905RU/mL左右的自身免疫抗体，各组药物都表现出超过80％的中和效果。pMN-7为阳性样品，针对血浆中浓度在53.72RU/mL左右的自身免疫抗体，除了RC5中和率为77.63％外，其余各组药物都表现出超过80％的中和效果。
6、RC3和RC6的固定化
取一定体积保存于异丙醇中的NHS-Bestarose(AA0031，博格隆(上海)生物技术有限公司)介质于重力柱中，用预冷的偶联溶液A3(1mM盐酸)(0～4℃)至少洗涤30min，1mL介质用20mL的偶联溶液A3溶液洗涤；RC3、RC6经超滤将其缓冲环境置换为偶联溶液B3(0.1M碳酸氢钠，0.5M氯化钠，pH 8.3)中(配基偶联浓度10mg/mL填料)。将洗好的介质用偶联溶液A3(1mL介质约0.5mL偶联溶液A3)稀释，并与配基溶液等体积混合，4℃震荡过夜。抽去偶联上清并加入封闭液(0.1M Tris-HCl，pH8.5)，室温封闭处理4h；采用封闭液与0.2M醋酸，在pH3.5的条件下交替洗涤5次，每次用3倍填料体积洗涤。用PBS清洗后使用或保存于0.1M磷酸缓冲液中，得到RC3-NHS Bestarose和RC6-NHS Bestarose。
7、固定化RC3和RC6对血浆样品中PLA2R-Ab的吸附
将RC3-NHS Bestarose、RC6-NHS Bestarose充分重悬取100μL分别加入对应EP管，1000g离心5min后小心吸去上清。加入500μL PBS重悬-离心-吸去上清2次以清洗填料。EP管中加入100μL患者血浆重悬，轻微震荡30min后1000g离心5min。小心吸取上清收集到3只EP管中，分别标记为RC3-pMN和RC6-pMN。ELISA方法检测固定化后RC3和RC6对PMN-4和PMN-7血浆样品中PLA2R-Ab的吸附，方法如本实例的第4部分(RC1-RC8对血浆样品中PLA2R-Ab的中和)。结果参见图17-18，结果表明，固定化后RC3和RC6对PMN-4和PMN-7血浆样品中PLA2R-Ab的清除率均在80％以上。
其中，图17中固定化后RC3和RC6对PMN-4血浆样品中PLA2R-Ab的清除率：
RC3-NHS Bestarose＝(225.55-43.16)/225.55*100％＝80.86％，
RC6-NHS Bestarose＝(225.55-13.82)/225.55*100％＝93.87％。
图18中固定化后RC3和RC6对PMN-7血浆样品中PLA2R-Ab的清除率：
RC3-NHS Bestarose＝(52.03-6.26)/52.03*100％＝87.96％，
RC6-NHS Bestarose＝(52.03-4.67)/52.03*100％＝91.02％。
8、RC1-RC8小鼠急性毒性试验
将购买回来的BALB/c雌性小鼠进行适应性饲养一周，随机分为8组，分为RC1组、RC2组、RC4组、RC5组、RC7组、RC8组、安慰组(又称“Buffer”)和空白组(又称“Notreatment”)，每组5只，称重并做标记。按10倍40mg/人剂量进行给药。在给药前称量小鼠体重，然后进行给药，具体为，RC1组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL的RC1蛋白、RC2组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL的RC2蛋白、RC4组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL的RC4蛋白、RC5组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL的RC5蛋白、RC7组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL的RC7蛋白、RC8组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL的RC8蛋白、安慰组注射0.1mL PBS、空白组不注射。给药当天记为第0天，给药完成后，留观1h，未观察到小鼠存在有呼吸困难、运动减少、震颤等明显不良反应。并在24h、48h、72h对小鼠进行称重，此后每48h对小鼠称重一次至给药第十天。
小鼠皮下注射RC1、RC2、RC4、RC5、RC7、RC8蛋白体重趋势图，由图19所示，结果表明，实验组与对照组小鼠体重无明显差异。
将购买回来的BALB/c雌性小鼠进行适应性饲养一周，随机分为4组，分为RC3组、RC6组、安慰组(又称“Buffer”)和空白组(又称“No treatment”)，每组5只，称重并做标记。按10倍40mg/人剂量进行给药。在给药前称量小鼠体重，然后进行给药，具体为，RC3组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL RC3蛋白、RC6组皮下注射0.1mL浓度为1mg/mL RC6蛋白、安慰组注射0.1mLPBS、空白组不注射。给药当天记为第0天，给药完成后，留观1h，未观察到小鼠存在有呼吸困难、运动减少、震颤等明显不良反应。并在24h、48h、72h对小鼠进行称重，此后每48h对小鼠称重一次至给药第三十天。
小鼠皮下注射RC3、RC6蛋白体重趋势图，由图20所示，结果表明，实验组与对照组小鼠体重无明显差异。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (16)
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括：
中性抗体，所述中性抗体包括抗体FC区段或第一抗体；
一个或多个PLA2R抗原表位肽，所述PLA2R抗原表位肽与所述中性抗体相连；
其中，所述第一抗体包括：轻链可变区CDR和重链可变区CDR；
重链可变区CDR1序列如GX1X2X3X4X5X6X7X8X9所示，
重链可变区CDR2序列如X10X11X12X13X14X15GX16X17X18X19X20X21X22X23所示，
重链可变区CDR3序列如X24GGX25X26X27X28X29X30X31Y所示，
X1为G或F，X2为G或N，X3为G或I，X4为G、K或S，X5为G或D，X6为G或T，X7为G或Y，X8为G或I，X9为H或S，X10为R或G，X11为G或I，X12为G或Y，X13为G或P，X14为T或S，X15为G或N，X16为G或Y，X17为G或T，X18为G、S或R，X19为G或Y，X20为G或A，X21为G或D，X22为G或S，X23为S或V，X24为G或W，X25为G或D，X26为G或S，X27为G或F，X28为G或Y，X29为G或A，X30为G或M，X31为S、G或D；
条件是X1为F、X2为N、X3为I、X4为K、X5为D、X6为T、X7为Y、X8为I、X9为H、X10为R、X11为I、X12为Y、X13为P、X14为T、X15为N、X16为Y、X17为T、X18为R、X19为Y、X20为A、X21为D、X22为S、X23为V、X24为W、X25为D、X26为G、X27为F、X28为Y、X29为A、X30为M、X31为D不同时成立；
轻链可变区CDR1序列如X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41A所示，
轻链可变区CDR2序列如X42X43X44X45X46X47S所示，
轻链可变区CDR3序列如X48X49X50X51X52X53X54X55X56所示，
X32为G或R，X33为G或A，X34为G或S，X35为G或Q，X36为G、D或S，X37为G或V，X38为G或N，X39为G或T，X40为G或A，X41为S或V，X42为G或S，X43为G或A，X44为G或S，X45为G或F，X46为L或S，X47为G或Y，X48为G或Q，X49为G或Q，X50为G或H，X51为G或Y，X52为S或T，X53为G或T，X54为G或P，X55为G或P，X56为G或T；
条件是X32为R、X33为A、X34为S、X35为Q、X36为D、X37为V、X38为N、X39为T、X40为A、X41为V、X42为S、X43为A、X44为S、X45为F、X46为L、X47为Y、X48为Q、X49为Q、X50为H、X51为Y、X52为T、X53为T、X54为P、X55为P、X56为T不同时成立。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链可变区CDR和轻链可变区CDR满足如下至少之一的条件：
X4为G或S，X5为G，X21为G，X31为S或G，X36为G或S；
任选地，所述重链可变区CDR中，X1为G或F，X2为G或N，X3为G或I，X4为G或S，X5为G，X6为G或T，X7为G或Y，X8为G或I，X9为H或S，X10为G，X11为G或I，X12为G或Y，X13为G或P，X14为T或S，X15为G或N，X16为G，X17为G或T，X18为G或S，X19为G或Y，X20为G或A，X21为G，X22为G或S，X23为S或V，X24为G，X25为G或D，X26为G或S，X27为G或F，X28为G，X29为G或A，X30为G或M，X31为S或G；
所述轻链可变区CDR中，X32为G或R，X33为G或A，X34为G或S，X35为G或Q，X36为G或S，X37为G或V，X38为G，X39为G或T，X40为G或A，X41为S或V，X42为G或S，X43为G或A，X44为G或S，X45为G，X46为L或S，X47为G或Y，X48为G或Q，X49为G或Q，X50为G或H，X51为G，X52为S或T，X53为G或T，X54为G或P，X55为G或P，X56为G或T。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一抗体包括选自下列至少之一的CDR序列：
轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85；
重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90和SEQ ID NO:91；
任选地，所述轻链可变区CDR序列包括与SEQ ID NO:1～3、SEQ ID NO:7～9和SEQ IDNO:83～85具有至少85％相似性的氨基酸序列中的至少之一；
所述重链可变区CDR序列包括与SEQ ID NO:4～6、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:86～88和SEQ ID NO:89～91具有至少85％相似性的氨基酸序列中的至少之一；
任选地，所述第一抗体包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQ ID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
任选地，所述第一抗体包括：
分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:86、87和88或者与SEQ ID NO:86、87和88具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:89、90和91或者与SEQ ID NO:89、90和91具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
任选地，所述第一抗体包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ IDNO:4、5和6具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQID NO:10、11和12具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQ ID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:86、87和88或者与SEQ ID NO:86、87和88具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:83、84和85或者与SEQ ID NO:83、84和85具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO:89、90和91或者与SEQ ID NO:89、90和91具有至少85％相似性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一抗体含有：
重链骨架区序列和轻链骨架区序列中的至少之一；
其中，所述重链骨架区序列和轻链骨架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体中的至少之一，优选为人源抗体；
任选地，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区；和/或者，
所述第一抗体具有如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区；
任选地，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ IDNO:15所示氨基酸序列的重链可变区；
任选地，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ IDNO:16所示氨基酸序列的重链可变区；或者
所述第一抗体具有如SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的重链可变区；或者
所述第一抗体具有如SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一，优选为人源抗体；
任选地，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:35所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链；
任选地，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO:19所示氨基酸序列的轻链；
任选地，所述第一抗体具有如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO:20所示氨基酸序列的轻链；或者
所述第一抗体具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链；或者
所述第一抗体具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链。
6.根据权利要求1～5任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述中性抗体的N端相连；
任选地，所述PLA2R抗原表位肽包括CysR、FnII、以及PLA2R结合区1和/或PLA2R结合区2；
任选地，所述CysR的C端与所述FnII的N端相连，所述FnII的C端与所述PLA2R结合区1的N端相连；
任选地，所述CysR的C端与所述FnII的N端相连，所述FnII的C端与所述PLA2R结合区1的N端相连，所述PLA2R结合区1的C端与PLA2R结合区2的N端相连；
任选地，所述PLA2R抗原表位肽具有如SEQ ID NO:21或22所示氨基酸序列或者与SEQID NO:21或22具有至少95％相似性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1～5任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述中性抗体为抗体FC区段，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述抗体FC区段的至少一条的N端相连；
任选地，所述中性抗体为双链抗体，所述抗体FC区段的每条链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连；
任选地，所述抗体FC区段具有如SEQ ID NO:24或者与SEQ ID NO:24具有至少90％相似性的氨基酸序列；
任选地，所述中性抗体为所述第一抗体，所述PLA2R抗原表位肽的C端与所述抗体的至少一条轻链或重链的N端相连；
任选地，所述第一抗体的每条轻链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连；
任选地，所述第一抗体的每条重链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连；
任选地，所述第一抗体的每条重链、每条轻链的N端分别与一个PLA2R抗原表位肽的C端相连。
8.根据权利要求1～5任一项所述的融合蛋白，其特征在于，进一步包括连接肽，所述连接肽设置于所述PLA2R抗原表位肽与所述中性抗体之间；
任选地，所述连接肽的N端与所述PLA2R抗原表位肽的C端相连，所述连接肽的C端与所述中性抗体的N段相连；
任选地，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
任选地，所述连接肽包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQID NO:19所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的第二肽段；或者
所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的第一肽段和具有如SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的第二肽段。
9.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～8任一项所述的融合蛋白；
任选地，所述核酸分子为DNA。
10.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求9所述的核酸分子；
任选地，所述表达载体为真核表达载体，优选地，所述表达载体为慢病毒载体。
11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括：
携带权利要求9所述的核酸分子；或，
表达权利要求1～8任一项所述的融合蛋白；
任选地，所述重组细胞是通过将权利要求10所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的；
任选地，所述重组细胞为真核细胞；
优选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
12.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～8任一项所述的融合蛋白；
任选地，进一步包括药学上可接受的辅料。
13.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1～8任一项所述的融合蛋白。
14.权利要求1～8中任一项所述的融合蛋白、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗PLA2R抗体引起的相关疾病；
任选地，所述PLA2R抗体引起的相关疾病选自PLA2R抗体阳性膜性肾病。
15.权利要求1～8中任一项所述的融合蛋白、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的药物组合物在制备免疫吸附剂中的用途，所述免疫吸附剂用于吸附PLA2R抗体。
16.权利要求1～8中任一项所述的融合蛋白、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PLA2R抗体。
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