CN102057277A - 大麻使用的检测 - Google Patents

大麻使用的检测 Download PDF

Info

Publication number
CN102057277A
CN102057277A CN2009801215686A CN200980121568A CN102057277A CN 102057277 A CN102057277 A CN 102057277A CN 2009801215686 A CN2009801215686 A CN 2009801215686A CN 200980121568 A CN200980121568 A CN 200980121568A CN 102057277 A CN102057277 A CN 102057277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
binding partners
seq
thc
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801215686A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102057277B (zh
Inventor
K·塔金纳恩
H·索德伦德
T·普里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Original Assignee
Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus filed Critical Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus
Publication of CN102057277A publication Critical patent/CN102057277A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102057277B publication Critical patent/CN102057277B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/948—Sedatives, e.g. cannabinoids, barbiturates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Geophysics And Detection Of Objects (AREA)

Abstract

公开了结合伴侣，尤其是特异性识别抗-THC和THC(四氢大麻酚)之间的抗原-抗体免疫复合物的抗体片段。结合伴侣有助于用于检测大麻使用的非竞争性同源性免疫测定。还描述了包含该结合伴侣的测试试剂盒。优选，将免疫测定应用于路边测试来自被怀疑驾驶员的唾液。

Description

大麻使用的检测
发明领域
本发明提供了增强用于检测大麻使用的免疫测定的方法。特别地，本发明涉及结合伴侣，尤其是能够结合四氢大麻酚(THC)和抗-THC-抗体之间的免疫复合物的抗体片段。本发明还涉及包含该结合伴侣的测试试剂盒，以及所述结合伴侣用于检测大麻使用的用途。此外，本发明涉及免疫测定，其中使用了所述结合伴侣。再进一步，本发明涉及编码所述结合伴侣的多核苷酸，和能够表达该多核苷酸的宿主细胞。
本发明的技术背景
药物滥用是个严重的威胁，尤其是对交通安全，并且因此已经研发了各种试验用于方便地测试滥用的药物。这些测试中的许多是免疫测定，并且大部分是竞争性免疫测定，其特异性通常低于非竞争性的免疫测定。Kerrigan和Phillips已经例如比较了12个可购得的ELISA(酶联免疫吸附测定)，这些ELISA用于全血和尿液中的鸦片、脱氧麻黄碱、古柯碱代谢产物、苯环己哌啶和大麻素(Kerrigan S.，&Phillips，W.，2001 Clinical Chemistry 47(3)：540-547)。测试形式是竞争性免疫测定，并且结果并不完全令人满意，产生了一些假的结果和不利的交叉反应性。
不仅可以从血液或尿液，而且可以从唾液测定药物滥用，这是选择用于路边测试的测试基质。Lo Muzio等测试了用于检测尿液中药物的商业快速免疫筛选，并比较了两种生物基质：非常规的生物基质，唾液，和传统的生物基质，尿液。他们发现唾液样本在用于大麻、THC、苯化重氮和三环抗抑郁药的免疫学试验中是阴性的，尽管气相色谱-质谱(GC-MS)分析揭示了其的低浓度，并且推断在与唾液一起使用之前，必须改进测试试剂盒(Lo Muzio L.等，2005，Int J ImmunopatholPharmacol.18(3)：567-573)。
WO 2004/046733公开了用于测定小分析物，如滥用的药物的非竞争性免疫测定。该测定使用了分析物特异性的一级抗体，一级抗体和分析物之间的免疫复合物(IC)特异性的二级抗体和分析物，以提高测定的灵敏性和特异性。所用的抗-IC抗体通过下列方法获自天然人抗体片段噬菌体展示文库：用结合的一级抗体预培养展示噬菌体来挑选结合一级抗体本身的那些，然后分离未结合的噬菌体并用分析物和固定的一级抗体的混合物培养以选择结合固定的一级抗体和分析物之间形成的免疫复合物但不结合抗体本身的噬菌体。对于确定唾液中的吗啡，获得了非常好的结果。
Δ9-四氢大麻酚(Δ9-THC)是大麻的母体药物，并且其快速代谢成可以在尿液中确定的11-nor-Δ9-THC-COOH或11-OH-Δ9-THC。因此，优选通过测定唾液中的Δ9-THC来检测大麻的使用，这是比当在尿液中检测该代谢产物时更好的最近使用的指示。然而，已经发现对于这种分析物难以研发出快速测试，并且市场上的测试试剂盒还不够灵敏。
US 6,326,159和Ullman等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90：1184-1189描述了使用用于增强一级抗体的亲和性和特异性的抗-IC-抗体的免疫测定。在这些论文中，已经研发了第二种抗-IC抗体，其结合与分析物相结合的第一种抗分析物抗体，但是其不结合单独的一级抗体或分析物。公开了识别抗体与四氢大麻酚(THC)的免疫复合物的抗体。通过以下方法获得抗-IC抗体：使用亲和性标记的抗-THC抗体作为免疫原并选择其结合通过Δ9THC的存在而增强的抗-IC抗体。观察到与例如THC-代谢产物的一些交叉反应性，这在法医药物分析中是不利的。通过常规杂交瘤技术制备了抗体，这使得它们太大，以致不能应用于同源性免疫测定中。
Kintz P.等测试了用于测试唾液中药物的商业药物装置，并将结果与GC-MC分析结果相比较，并且发现该测试装置鉴定出只有一位暴露于THC的驾驶员，而18位驾驶员使用GC-MC被测试为阳性的。他们推断目前使用这种样本用于路边测试的局限在于缺少检测足够低浓度的母体化合物(THC)的合适免疫测定(Kintz P.等，2005.J.Anal.Toxicol.29(7)：724-727)。
目前用于确定大麻使用的免疫测定不令人满意，大概是由于低特异性和灵敏度。因此，仍然需要容易、快速和可靠的用于大麻使用的药物测试，其可以用于，例如，路边测试，并优选用于分析口腔流体样本，这是非入侵性的、易于进行，并可以在严密监督下进行。本发明满足了这些需求中的至少一部分。
发明概述
本发明提供了一种新的试剂，其有助于快速而可靠地检测大麻使用。该试剂是能够特异性识别大麻素和抗-大麻素之间形成的免疫复合物的蛋白质。更具体地，本发明提供了包含抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)的结合伴侣，其中所述轻链区具有SEQ ID NO：3的氨基酸23-35、51-57和93-100的氨基酸序列，并且所述重链区具有SEQ IDNO：4的氨基酸29-35、50-60和99-109的氨基酸序列。
本发明进一步提供了包含结合伴侣的测试试剂盒，以及结合伴侣用于检测获自待测试已经使用大麻的人的身体样本中的大麻素的用途。由于高特异性和灵敏度，并且优选小尺寸，结合伴侣尤其适于非竞争性同源性免疫测定，这可以例如在路边用于测试怀疑使用大麻的驾驶员的唾液。
再进一步，本发明提供了用于检测获自身体的样本中的分析物的免疫测定，由此将样本与试剂对反应，该试剂对包含特异性结合分析物的第一结合伴侣和特异性结合分析物和第一结合伴侣的复合物的第二结合伴侣，并且测定第二结合伴侣与所述复合物的结合，由此表明样本中分析物的存在，其中所述分析物是大麻素，并且所述第二结合伴侣包含抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)，其中所述轻链区具有SEQ ID NO：3的氨基酸23-35、51-57和93-100的氨基酸序列，并且所述重链区具有SEQ ID NO：4的氨基酸29-35、50-60和99-109的氨基酸序列。
此外，本发明提供了编码结合伴侣的多核苷酸，和能够表达结合伴侣的宿主细胞。该多核苷酸是DNA或RNA。
在从属权利要求中列出了本发明的有利实施方案。
本发明的其他目的、详细内容和优点将从以下的附图、详述和实施例中变得清楚。
附图简述
图1显示了抗-THC T3Fab轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，和抗-THC T3 Fab VH-CH1重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。显示了所述免疫球蛋白链各自的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。
图2显示了抗-T3+THC免疫复合物Fab 104轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，和抗-T3+THC免疫复合物Fab 104重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。显示了所述免疫球蛋白链各自的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。
图3显示了抗-THC T3 Fab结合抗-T3+THC免疫复合物Fab 104用于各种药物和药物代谢产物获得的THC TR-FRET测试结果。
详述
大麻素是在大麻植物Cannabis sativa中发现的萜烯酚分子的总称。更常见地，其包括一组在结构上与四氢大麻酚(THC)相关并结合大麻素受体的分子。THC是大麻的主要心理活性大麻素，并且与Δ9-四氢大麻酚(Δ9-THC)和D9-四氢大麻酚(D9-THC)同义，在此这些全部可以互换使用。THC在体内代谢成11-nor-D9-THC-COOH和11-OH-D9-THC，这是其他大麻素的实例。本发明的结合伴侣特异性地识别THC和抗-THC之间的免疫复合物，由此与代谢产物的反应明显较低。
本发明的结合伴侣可以用于检测样本的THC的夹层试验中，由此将样本与试剂对反应，该试剂对包含特异性结合THC的第一结合伴侣，和第二结合伴侣，其能够特异性识别THC和抗-THC之间的免疫复合物，并且其是本发明的结合伴侣。第二结合伴侣与第一结合伴侣和THC之间的免疫复合物的结合指示样本中存在THC。
如在此所用的“结合伴侣”通常是蛋白质或多肽，如包括具有所需结合特性的抗体片段的抗体。抗体是免疫球蛋白分子并且属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD中的任何一类；IgG和IgM是最常用的。优选，结合伴侣是包含配体-结合位点的抗体片段，如Fab或scFv片段。称为Fab片段的片段(抗原结合片段)由通过二硫化物桥键连接免疫球蛋白重链的可变和第一个恒定结构域的免疫球蛋白轻链的可变和恒定结构域组成。Fv(可变结构域)意思是负责配体结合的免疫球蛋白分子的可变区。ScFv(单链Fv)意思是其中抗体的重链和轻链的可变结构域通过肽连接的分子，以从单链mRNA分子合成形成单个多肽链。免疫球蛋白重链和轻链的可变区一起负责配体结合。配体是结合伴侣结合的物质，对于抗体，其是抗原或半抗原。
使用重组噬菌体展示文库可以方便地制备结合伴侣，例如，如WO 2004/046733中所述的。当已经选择第一结合伴侣时，其与其配体复合，并将该复合物用于从推荐文库中选择第二结合伴侣。将没有使用配体的第一结合伴侣用作反选择。第二结合伴侣应当只识别复合物，而不是识别第一结合伴侣，也不是识别游离抗原，不管是任何显著的程度。
可以通过将免疫球蛋白结构域编码cDNA克隆至合适的噬菌体展示载体中来构建噬菌体展示抗体文库。将编码百万个抗体片段变体的DNA成批克隆至作为噬菌体外壳蛋白一部分的载体中。通过在细菌中转化载体可以获得含有百万个具有不同特异性的抗体片段的大文库。细菌的培养导致噬菌体展示抗体片段在其表面上的表达。在噬菌体基因组中携带所展示抗体的基因，由此将基因型和表现型联系起来。所展示蛋白及其DNA之间的物理联系使得可以通过称为淘选(panning)的简单体外选择程序来筛选大量蛋白质变体，各自与其对应的DNA相关。以其最简单的形式，可以通过用已经固定于载体上的目标配体培养噬菌体展示变体的集合来进行淘选，并通过破坏与配体的结合来洗脱特异性结合的噬菌体。然后洗脱的噬菌体在体内扩增。将该过程重复几次，使得有利于最紧密集合序列的噬菌体集合逐步富集。在约3至6轮选择和扩增后，将最好的克隆测序并转化至宿主细胞中，用于进一步表达。宿主细胞可以是真核或原核细胞，例如，酵母、动物、植物或昆虫细胞或细菌细胞。甚至可以是杂交瘤细胞，其在转化后产生重组单克隆抗体。重组结合伴侣或至少其一部分也可以合成产生。
包含识别大麻素的第一结合伴侣和识别大麻素和所述第一结合伴侣之间的免疫复合物的第二结合伴侣的试剂对使得用于大麻素的非竞争性夹层测定是可行的。可以通过全部标准免疫测定来检测夹层。一种伴侣可以固定于载体上，如微滴定孔或珠子。在分析物和另一种结合伴侣的存在下形成夹层。例如，通过使用二级抗体或通过标记至少一种结合伴侣来检测夹层。标记可以是任何常规标记，如放射活性标记、酶或荧光化合物。该测定可以是例如ELISA或FIA。
包含本发明结合伴侣的试剂对很大的优点在于其能够进行同源性免疫测定，即，在溶液中进行免疫测定。省去了固定和洗涤步骤使得试验非常简单。同源性试验给路边测试提供了卓越且方便的工具，例如，由警察在抽查驾驶员等时使用。本发明提供的免疫测定比目前市场上的竞争性测定灵敏高达10倍。待分析的样本可以是任何流体样本，如血液、血清或尿液，但优选是口腔流体，如唾液。分析物优选是THC。
优选的同源性免疫测定是基于荧光共振能量转移(FRET)的一种试验，对于综述，参见
Figure BDA0000037255970000061
J等，1998，Communications inClinical Cytometry，34：159-179。在FRET中，通过分子间的偶极子-偶极子偶联，能量从荧光团分子(供体)激发至高能量状态并且转移至另一个荧光团(受体)。这只有供体和受体之间的距离短
Figure BDA0000037255970000062
以及供体的荧光光谱和受体的吸收光谱部分重叠时才有可能。然后作为荧光变化来检测能量转移。通常利用时间分辩荧光(
Figure BDA0000037255970000063
I.等，1988，Clin.Chem.34：2320-2322)。
通过用形成FRET供体-受体对的荧光团来标记两种结合伴侣(其优选是抗体片段)，可以将FRET应用于本发明。当结合伴侣和分析物是小的时候，荧光团变得非常近，并且获得了可测量的FRET信号。
或者，用于大麻使用的免疫测定可以是例如常规的在微滴定孔中的夹层测试或侧流测试。
本发明的结合伴侣可以包括在测试试剂盒中，其可以进一步含有试验需要的任何其他试剂和使用说明书。优选，测试试剂盒还含有用于结合分析物的第一结合伴侣。更优选，所述结合伴侣包含抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)，其中所述轻链区具有SEQ ID NO：1的氨基酸24-35、51-57和90-98的氨基酸序列，所述重链区具有SEQID NO：2的氨基酸27-36、51-66和99-107的氨基酸序列。优选，测试试剂盒包含用于进行非竞争性的同源性试验的试剂，如例如，TR-FRET测试需要的试剂。试剂盒进一步包含反应溶液、缓冲剂、洗涤溶液和检测工具，如标记物和任选的荧光团。
测试的性能可以使得试剂在微滴定平板的孔中，并加入连续稀释的样本。在优选的模式下，例如，用于警察领域使用，试剂是在容器中的干燥形式。加入唾液，其溶解了试剂并且可以阅读结果，而不需要进一步处理。
优选，测试试剂盒包含用于测定多重药物滥用的试剂，如用于测定，例如，吗啡、可待因、海洛因、安非他明、甲基苯丙胺、古柯碱、巴比妥酸盐和苯并二氮。在这种情况下，测试试剂盒可以包含物理上彼此分开的多重试剂对，例如，以微矩阵的形式，由此可以从单个唾液样本中同时测试多重药物。
本发明的结合伴侣包含具有SEQ ID NO：3的抗体轻链的三个CDR和具有SEQ ID NO：4的抗体重链的三个CDR。根据本发明的一个实施方案，该结合伴侣包含完整的可变区，即，所述轻链(VL)和重链(VH)的配体-结合部分。因此，其可以含有SEQ ID NO：3的氨基酸1-111和SEQ ID NO：4的氨基酸1-120。特别地，所述结合伴侣包含SEQ ID NO：3和NO：4的氨基酸序列。相应地，第一结合伴侣包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的完整可变区，即，SEQ ID NO：1的氨基酸1-108，和SEQ ID NO：2的氨基酸1-118。特别地，其包含SEQ ID NO：1和NO：2的氨基酸。在说明书和权利要求中列出的任一个序列或子序列的小变化或改进仍然在本发明的范围内，只要它们没有影响蛋白质的结合活性。这样的变化和改进特别包括保守性氨基酸取代。
通过以下非限制性实施例说明了发明。
实施例1
抗-THC Fab的研发
用弗氏佐剂中的THC缀合BSA(Fitzgerald)将小鼠免疫，并在第二次强化后测试血清样本，并且将在直接ELISA中显示出最佳对抗抗原应答的小鼠选定为抗体噬菌体展示文库的来源。如WO2004/046733中所述的，构建抗体片段噬菌体展示文库，将THC-特异性噬菌体富集，并将单个克隆的Fab基因片段分离、表达和表征。选择抗-THC T3 Fab，用于进一步测定。
将抗-THC T3 Fab轻链的氨基酸序列列为SEQ ID NO：1，抗-THCT3 Fab VH-CH1链的氨基酸序列列为SEQ ID NO：2。Fab轻链的CDR1、CDR2和CDR3对应于SEQ ID NO：1的氨基酸24-35、51-57和90-98。Fab重链的CDR1、CDR2和CDR3对应于SEQ ID NO：2的氨基酸27-36、51-66和99-107。SEQ ID NO：1的第1-108号氨基酸表示轻链可变区，而SEQ ID NO：2的第1-118号氨基酸表示重链可变区。SEQ ID NO：1的第109-215号氨基酸表示小鼠κ轻链的恒定区，和SEQ ID NO：2的第119-221号氨基酸表示小鼠重量的恒定CH1区。图1中还显示了抗-THC T3 Fab的氨基酸序列。
实施例2
抗-THC Fab和THC的免疫复合物的抗-免疫复合物抗体的研发
从天然人scFv噬菌体展示文库选择免疫复合物特异性抗体
用ImmunoPure Sulfo-NHS-LC-生物素试剂盒(Pierce)将T3Fab片段生物素化。将生物素化抗体纯化，并用Econo-Pac 10DG柱(Bio-Rad，CA，USA)将缓冲剂换成PBS。用10μl抗生蛋白链菌素覆盖的磁性珠(Dynal，M-280)和0.5μg生物素化T3 Fab将BSA/PBS中的200μl天然scFv噬菌体展示文库(κ或λ轻链)在+4℃下预培养过夜。从集合的50名健康个体的淋巴细胞构建天然人scFv噬菌体展示文库。估计文库的大小为1x108克隆。天然人scFv噬菌体展示文库含有IgM特异性VH-基因，结合κ或λ特异性VL-基因。从珠子分离出未结合的噬菌体，并用100ng THC、500ng生物素化的T3 Fab和5μl抗生蛋白链菌素覆盖的磁珠将100μl噬菌体在振荡器中在RT下培养1小时。以相似的方式实施选择程序的背景，但从结合反应中省略了THC。用0.5ml PBS将磁珠洗涤五次，并用100μl HCl(pH2.2)将未结合的噬菌体洗脱30分钟。用1M Tris中和洗脱的噬菌体并感染E.coliXL1-蓝细胞。按照WO 2004/046733所述的使细胞生长并将噬菌体纯化。三次淘选轮后，将洗脱噬菌体的量与背景对照孔的洗脱噬菌体的量相比，看到了富集。当测试来自选择轮的洗脱噬菌体集合并分析单个scFV噬菌体克隆时，在噬菌体ELISA中也清楚地看到了通过T3Fab和THC形成的免疫复合物的特异性结合剂的富集。
单个克隆的表征
挑选单个特异性结合T3+THC复合物的scFv噬菌体克隆、测序、表达和测试。选择克隆104用于进一步检查。因为scFv倾向于在表达和纯化过程中聚集，通过克隆人λ轻链的基因区以及VL和VH基因各自的IgG1 CH1恒定区，将免疫复合物特异性克隆104转化成Fab片段。将含有六个组氨酸残基的C-末端标记物插入CH1的C-末端，用于固定化金属亲和性色谱(IMAC)纯化。将104Fab片段克隆至表达载体pKKtac中，并证实序列。将抗-T3+THC免疫复合物Fab 104轻链的氨基酸序列列为SEQ ID NO：3，Fab VH-CH1-6His-Tag区的氨基酸序列列为SEQ ID NO：4。SEQ ID NO：3的第1-111号氨基酸表示轻链的可变区，而SEQ ID NO：4的第1-120号氨基酸表示重链的可变区。SEQ ID NO：3的第112-216号氨基酸表示人λ轻链的恒定区，而SEQID NO：4的第121-223号氨基酸表示人重链CH1区的恒定区。重链恒定区C-末端的六个组氨酸残基有助于通过固定化金属亲和性色谱(IMAC)的Fab片段纯化。
104Fab的表达和纯化
将104 Fab片段的表达载体转化至大肠杆菌(E.coli)生产菌株RV308中。将细胞接种于25ml含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的TB培养基中(酵母提取物12g/l，大豆蛋白胨24g/l，KH2PO42.31g/l，K2HPO4 12.54g/l，甘油5g/l，pH7.1)，并在振荡器上在+37℃下培养过夜。从过夜培养物中，将6ml接种物加入两个含有300ml TB的锥形瓶中，TB中含有100μg/ml氨苄青霉素。将细胞在振荡器上在+37℃下培养直至OD600为4，此后将0.3ml 1M IPTG和100μg/ml氨苄青霉素加入培养物中，然后将培养在振荡器上+30℃下持续过夜。将培养物培养基的上清液用于104 Fab片段的纯化。将细胞在4000g和4℃下离心20分钟，并将上清液倒入干净的烧瓶中。用2mg/ml DNA酶I处理上清液以除去残余的染色体DNA，在+37℃下持续一小时。因为表达的Fab 104在其C-末端具有6×His-标记，可以通过固定化金属亲和性色谱(IMAC)纯化。通过Ni2+螯合琼脂糖(AmershamPharmacia Biotech)纯化Fab 104。用SDS-PAGE检查Fab 104的纯度。
实施例3
用于THC的同源性时间分辩荧光共振能量转移(TR-FRET)免疫测定
通过LANCE Eu-W1024 ITC螯合物试剂盒(Wallac)，用铕标记抗-THC Fab片段T3。将标记的T3的缓冲液换成50mM Tris，pH7.8，0.9％NaCl。通过Alexa Fluor蛋白质标记试剂盒(MolecularProbes，Inc.)，用Alexa Fluor 647标记抗-T3+THC免疫复合物Fab片段104。
将1μg Eu标记的抗-THC T3Fab和1.5μg Alexa Fluor 647标记的抗免疫复合物Fab 104加入到微滴定孔的60μl唾液中。将用0、3.75、7.5、15、30、60和120ng/ml的药物刺激的40μl唾液样本加入到孔中，这些药物为：D9-THC、11-OH-D9-THC、11-nor-D9-THC-COOH、海洛因和安非他命。简短混合后，通过Victor V荧光计(Perkin ElmerWallac)测量时间分辩荧光共振能量转移(TR-FRET)。结果显示于图3中。
用THC刺激的唾液样本产生了高荧光值，而THC代谢产物产生了明显较低的荧光值，海洛因和吗啡产生了接近从对照(标记的T3和104片段，没有任何添加的药物)检测到的背景荧光的荧光值。Fab104结合T3和THC之间形成的免疫复合物，具有非常高的特异性和灵敏度。该测试能够检测远低于目前市场上快速测试的截留水平(唾液中20ng/ml)的THC。
尽管已经描述了用于提供本发明的试剂和测定的一种策略，但本领域技术人员将清楚多种改变和改进。
Figure IDA0000037256020000011
Figure IDA0000037256020000021
Figure IDA0000037256020000031
Figure IDA0000037256020000041
Figure IDA0000037256020000051
Figure IDA0000037256020000061

Claims (16)

1.包含抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)的结合伴侣，其中所述轻链区具有SEQ ID NO：3的氨基酸23-35、51-57和93-100的氨基酸序列，并且所述重链区具有SEQ ID NO：4的氨基酸29-35、50-60和99-109的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的结合伴侣，其是抗体片段，优选包含SEQ IDNO：3的氨基酸1-111和SEQ ID NO：4的氨基酸1-120，最优选该片段是包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的Fab 104。
3.根据权利要求1的结合伴侣，其特异性识别四氢大麻酚(THC)和抗-THC之间的免疫复合物。
4.包含权利要求1至3任一项的结合伴侣的测试试剂盒。
5.根据权利要求4的测试试剂盒，进一步包含另一种结合伴侣，其包含抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)，其中所述轻链区具有SEQ ID NO：1的氨基酸24-35、51-57和90-98的氨基酸序列，而所述重链区具有SEQ ID NO：2的氨基酸27-36、51-66和99-107的氨基酸序列。
6.根据权利要求4或5的测试试剂盒，包含用于非竞争性同源性免疫测定的试剂，优选用于时间分辩荧光共振能量转移(TR-FRET)。
7.根据权利要求4至6任一项的测试试剂盒，包含用于测定多重滥用药物的试剂。
8.权利要求1至3任一项的结合伴侣用于检测取自待测试已经使用大麻的人的身体样本中的大麻素的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中大麻素是THC。
10.用于检测取自身体的样本中的分析物的免疫测定，由此将样本与试剂对反应，该试剂对包含特异性结合分析物的第一结合伴侣，和特异性结合分析物和第一结合伴侣的复合物的第二结合伴侣，并测定第二结合伴侣与所述复合物的结合，由此指示样本中分析物的存在，其特征在于所述分析物是大麻素，并且所述第二结合伴侣包含抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)，其中所述轻链区具有SEQ ID NO：3的氨基酸23-35、51-57和93-100的氨基酸序列，而所述重链区具有SEQ ID NO：4的氨基酸29-35、50-60和99-109的氨基酸序列。
11.权利要求10的免疫测定，其是非竞争性的同源性免疫测定，优选TR-FRET。
12.权利要求10或11任一项的免疫测定，其中待分析的样本选自血液、尿液和口腔流体。
13.权利要求10的免疫测定，其中从唾液测定THC。
14.权利要求10至13任一项的免疫测定，其中第一结合伴侣包含抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)，其中所述轻链区具有SEQID NO：1的氨基酸24-35、51-57和90-98的氨基酸序列，而所述重链区具有SEQ ID NO：2的氨基酸27-36、51-66和99-107的氨基酸序列。
15.编码权利要求1至3任一项的结合伴侣的多核苷酸。
16.能够表达权利要求1至3任一项的结合伴侣的宿主细胞。
CN200980121568.6A 2008-06-12 2009-06-05 大麻使用的检测 Active CN102057277B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20085579 2008-06-12
FI20085579A FI20085579A0 (fi) 2008-06-12 2008-06-12 Kannabiskäytön toteaminen
PCT/FI2009/050481 WO2009150295A1 (en) 2008-06-12 2009-06-05 Detection of cannabis use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102057277A true CN102057277A (zh) 2011-05-11
CN102057277B CN102057277B (zh) 2014-12-24

Family

ID=39589343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980121568.6A Active CN102057277B (zh) 2008-06-12 2009-06-05 大麻使用的检测

Country Status (20)

Country Link
US (1) US8518653B2 (zh)
EP (1) EP2297585B1 (zh)
JP (1) JP5675597B2 (zh)
CN (1) CN102057277B (zh)
AU (1) AU2009256482B2 (zh)
BR (1) BRPI0915086B8 (zh)
CA (1) CA2724660C (zh)
CY (1) CY1117631T1 (zh)
DK (1) DK2297585T3 (zh)
EA (1) EA019664B1 (zh)
ES (1) ES2566501T3 (zh)
FI (1) FI20085579A0 (zh)
HR (1) HRP20160237T1 (zh)
HU (1) HUE028677T2 (zh)
MX (1) MX2010013692A (zh)
NZ (1) NZ589300A (zh)
PL (1) PL2297585T3 (zh)
SI (1) SI2297585T1 (zh)
WO (1) WO2009150295A1 (zh)
ZA (1) ZA201008491B (zh)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014511174A (ja) 2011-02-07 2014-05-15 ネオトープ バイオサイエンシーズ リミテッド Ａｐｏｅ免疫療法
JP6156144B2 (ja) * 2011-09-21 2017-07-05 富士レビオ株式会社 親和性複合体に対する抗体
US9970950B1 (en) 2014-03-09 2018-05-15 Hound Labs, Inc. Method and apparatus for detecting acute use of target substance(s)
WO2015142574A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 St & T International, Inc. Cannabis extraction method and compositions
US10308712B2 (en) 2014-03-27 2019-06-04 Bird Rock Bio, Inc. Antibodies that bind human cannabinoid 1 (CB1) receptor
US10319475B1 (en) 2014-06-13 2019-06-11 Enigami Systems, Inc. Method and apparatus for determining relationships between medications and symptoms
US9726684B1 (en) 2015-01-18 2017-08-08 Hound Labs, Inc. Compositions for target substance detection and measurement
US9585867B2 (en) 2015-08-06 2017-03-07 Charles Everett Ankner Cannabinod formulation for the sedation of a human or animal
EP3356833A4 (en) 2015-09-30 2019-04-10 Bird Rock Bio, Inc. ANTIBODIES FOR BINDING HUMAN CANNABINOID RECEPTOR 1 (CB1)
US9823259B1 (en) 2016-04-08 2017-11-21 Walter Nichols Detection device for cannabinoid use
US9933445B1 (en) 2016-05-16 2018-04-03 Hound Labs, Inc. System and method for target substance identification
US9921234B1 (en) 2016-06-17 2018-03-20 Hound Labs, Inc. Compositions and methods for detection of target constituent in exhaled breath
US11026596B1 (en) 2017-05-19 2021-06-08 Hound Labs, Inc. Detection and measurement of target substance in exhaled breath
US11187711B1 (en) 2017-09-11 2021-11-30 Hound Labs, Inc. Analyte detection from breath samples
US11860174B2 (en) 2017-12-15 2024-01-02 Bomi LLC Anti-cannabidiol antibody and uses thereof
US20200035118A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Joseph Pandolfino Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes
US10897925B2 (en) 2018-07-27 2021-01-26 Joseph Pandolfino Articles and formulations for smoking products and vaporizers
US11426097B1 (en) 2018-10-17 2022-08-30 Hound Labs, Inc. Rotary valve assemblies and methods of use for breath sample cartridge systems
US20200245898A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Hound Labs, Inc. Single-use Microfluidic Cartridge for Detection of Target Chemical Presence in Human Breath
US11977086B2 (en) 2019-03-21 2024-05-07 Hound Labs, Inc. Biomarker detection from breath samples
US11933731B1 (en) 2020-05-13 2024-03-19 Hound Labs, Inc. Systems and methods using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy for detecting tetrahydrocannabinol
US11806711B1 (en) 2021-01-12 2023-11-07 Hound Labs, Inc. Systems, devices, and methods for fluidic processing of biological or chemical samples using flexible fluidic circuits

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6326159B1 (en) * 1986-10-09 2001-12-04 Dade Behring Marburg Gmbh Receptors for immune complexes
WO2004046733A1 (en) * 2002-11-18 2004-06-03 Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus Non-competitive immunoassay for small analytes
WO2007141278A2 (en) * 2006-06-06 2007-12-13 Crucell Holland B.V. Human binding molecules having killing activity against enterococci and staphylococcus aureus and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
DE3433652A1 (de) * 1984-09-13 1986-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Immunchemisches messverfahren fuer haptene und proteine
WO1987007147A1 (en) * 1986-05-28 1987-12-03 Murex Corporation Method for producing monoclonal antibodies to an immunogenic antibody-antigen conjunction
JPH05504841A (ja) * 1990-09-14 1993-07-22 バイオサイト・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド リガンドレセプター及びリガンドのコンプレックスに対する抗体及びリガンド―レセプターアッセーでのそれらの用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6326159B1 (en) * 1986-10-09 2001-12-04 Dade Behring Marburg Gmbh Receptors for immune complexes
WO2004046733A1 (en) * 2002-11-18 2004-06-03 Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus Non-competitive immunoassay for small analytes
WO2007141278A2 (en) * 2006-06-06 2007-12-13 Crucell Holland B.V. Human binding molecules having killing activity against enterococci and staphylococcus aureus and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009256482A1 (en) 2009-12-17
JP5675597B2 (ja) 2015-02-25
US8518653B2 (en) 2013-08-27
EA201071435A1 (ru) 2011-08-30
CN102057277B (zh) 2014-12-24
EP2297585A1 (en) 2011-03-23
ES2566501T3 (es) 2016-04-13
EA019664B1 (ru) 2014-05-30
HUE028677T2 (en) 2016-12-28
NZ589300A (en) 2011-11-25
PL2297585T3 (pl) 2016-09-30
DK2297585T3 (en) 2016-03-29
BRPI0915086B8 (pt) 2021-07-27
FI20085579A0 (fi) 2008-06-12
US20110086364A1 (en) 2011-04-14
SI2297585T1 (sl) 2016-06-30
AU2009256482B2 (en) 2014-11-13
JP2011524013A (ja) 2011-08-25
CY1117631T1 (el) 2017-04-26
ZA201008491B (en) 2011-08-31
CA2724660C (en) 2019-07-09
EP2297585B1 (en) 2016-03-02
CA2724660A1 (en) 2009-12-17
BRPI0915086A2 (pt) 2016-07-26
MX2010013692A (es) 2011-03-04
EP2297585A4 (en) 2012-05-02
BRPI0915086B1 (pt) 2020-05-12
WO2009150295A1 (en) 2009-12-17
HRP20160237T1 (hr) 2016-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102057277B (zh) 大麻使用的检测
EP1579222B1 (en) Non-competitive immunoassay for small analytes
Lim et al. Noncompetitive detection of low molecular weight peptides by open sandwich immunoassay
US20110020840A1 (en) Method and kits for detecting antibodies against therapeutic antibodies
Shu et al. Development of a noncompetitive idiometric nanobodies phage immumoassay for the determination of fumonisin B1
CN108779169A (zh) 针对包含蓝细菌环肽肝毒素的免疫复合物的抗体
Sun et al. Development of magnetic separation and quantum dots labeled immunoassay for the detection of mercury in biological samples
EP3129403B1 (en) Antibody against ht-2 toxin-ht-2 toxin antibody complex
US20080188007A1 (en) Fluorescent single chain antibody and its use in detection of analytes
WO2022221877A2 (en) Lateral flow analysis and breast cancer
CN114280289A (zh) 一种磁微粒化学发光检测试剂盒及其检测方法
WO2021113736A1 (en) Single-domain antibody to chloramphenicol
AU2003282143B2 (en) Non-competitive immunoassay for small analytes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant