CN114878647A - 一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的dna生物传感器及其检测方法 - Google Patents

一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的dna生物传感器及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的DNA生物传感器及其检测方法，所述生物传感器包括表面修饰有羧基的纳米磁珠，以及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～7所示的DNA walker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4。本发明通过引入磁性纳米颗粒以及在其表面进行核酸适配体的有序组装，极大的简化了产气荚膜梭菌检测过程中的操作步骤，降低了产气荚膜梭菌的检测成本。同时，本发明提供的检测方法具有高灵敏度、低成本、快速等优点。

Description

一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的DNA生物传感器 及其检测方法
技术领域
本发明涉及检测领域，具体涉及一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的DNA生物传感器及其检测方法。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种革兰氏阳性厌氧菌广泛分布于环境中，C.perfringens可以在5-50℃的广泛温度范围内生长，37-45℃是其最适的生长温度，在遇到恶劣环境条件时，可生成孢子存活数年。C.perfringens可以产生毒素摄入人体内易导致食源性疾病，症状包括腹泻和剧烈腹痛，是人畜共患病病原菌。目前国内外通过微生物学、免疫学、生物分子学等各种手段进行产气荚膜梭菌检测的方法正在逐渐被人们开发。
传统微生物检测方法需要长时间的厌氧培养及繁杂的验证，具有耗时长、检测限高等缺点；免疫学方法虽然能够通过抗原抗体结合反应实现快速检测，但是易出现假阳性；生物分子学检测方法具有高灵敏度，但其检测成本较高。因此，本发明开发一种新的产气荚膜梭菌的检测方法，以提高产气荚膜梭菌的检测效率，降低检测成本。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种检测产气荚膜梭菌的DNA生物传感器。
本发明还要解决的技术问题是提供一种检测产气荚膜梭菌的试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供一种快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的检测方法。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种检测产气荚膜梭菌的DNA生物传感器，其包括表面修饰有羧基的纳米磁珠，以及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～7所示的DNA walker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4。
其中，所述表面修饰有羧基的纳米磁珠的浓度为40～60mg/mL，优选为50mg/mL。
其中，所述DNA walker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4均溶于水中，浓度均为40～60μM，优选为50μM。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种检测产气荚膜梭菌的试剂盒，其包括表面修饰有羧基的纳米磁珠，以及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～7所示的DNAwalker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4。
其中，所述表面修饰有羧基的纳米磁珠的浓度为40～60mg/mL，优选为50mg/mL。
其中，所述DNA walker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4均溶于水中，浓度均为40～60μM，优选为50μM。
为了解决上述第三技术问题，本发明公开了一种检测产气荚膜梭菌的方法，如图1所示，利用表面修饰有羧基的纳米磁珠通过酰胺基反应将特异性核酸适配体修饰于其表面，再通过待测样本与核酸适配体特异性结合后发夹结构的寡核苷酸序列在磁珠表面发生恒温链式扩增反应，最终将亚甲基蓝嵌入到DNA双链结构中，通过电化学信号值表征待测物浓度，通过荧光信号验证检测结果。
其中，所述方法具体包括如下步骤：
S1：将表面修饰有羧基的纳米磁珠活化后，在PBS缓冲液中，将DNA walker、Aptamer、H1、H2通过酰胺基反应修饰于活化后的羧基纳米磁珠表面，得到修饰有核酸适配体的纳米磁珠；将产物通过PBS缓冲液洗涤后再次悬浮在PBS缓冲液中，使用牛血清蛋白(2μg/mL)将磁珠表面其他未修饰寡核苷酸链的活性位点封闭；
S2：将修饰有核酸适配体的纳米磁珠、含有产气荚膜梭菌的待检测样品、TriggerDNA、H3、H4经恒温链式扩增反应，得到结合待检测样品的磁珠；
S3：步骤S2所得磁珠通过PBS缓冲液洗涤后再次悬浮在PBS缓冲液中，中加入亚甲基蓝反应，使得亚甲基蓝充分嵌入到DNA双链内部；
S4：步骤S3所得产物通过PBS缓冲液洗涤后再次悬浮在PBS缓冲液中，取10μL至磁性玻碳电极表面，通过三电极体系在EIS缓冲液中测得电化学DPV信号；
其中，所述DNA walker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～7所示。
其中，各步骤中所使用的PBS缓冲液成分为：pH 7.2～7.4,136.89mM NaCl,2.67mMKCl,8.24mM Na2HPO4,1.76mM NaH2PO4。
步骤S1中，所述将表面修饰有羧基的纳米磁珠活化为表面修饰有羧基的纳米磁珠通过N-羟琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐进行表面基团的活化。
步骤S1中，所述表面修饰有羧基的纳米磁珠的浓度为40～60mg/mL，优选为50mg/mL；所述DNA walker、Aptamer、H1、H2均溶于水中，浓度均为40～60μM，优选为50μM；所述表面修饰有羧基的纳米磁珠与DNA walker、Aptamer、H1、H2水溶液的体积比为10：1～3：1～3：1～3：1～3，优选为10：2：2：2：2。
步骤S1中，所述反应的温度为20～30℃，优选为室温；所述反应的时间为1～3h，优选为2h。
步骤S2中，所述产气荚膜梭菌的上下游引物分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
步骤S2中，所述含有产气荚膜梭菌的待检测样品包括但不限于含有产气荚膜梭菌的待检测的肉制品。
步骤S2中，所述Trigger DNA、H3、H4均溶于水中，浓度均为40～60μM，优选为50μM；所述表面修饰有羧基的纳米磁珠与含有产气荚膜梭菌的待检测样品、Trigger DNA、H3、H4水溶液的体积比为10：1～3：1～3：1～3：1～3，优选为10：2：2：2：2。
步骤S2中，将修饰有核酸适配体的纳米磁珠通过PBS缓冲液洗涤后再次悬浮在PBS缓冲液中，先与含有产气荚膜梭菌的待检测样品进行第一反应；所得产物通过PBS缓冲液洗涤后再次悬浮在PBS缓冲液中，再与Trigger DNA进行第二反应；产物通过PBS缓冲液洗涤后再次悬浮在PBS缓冲液中，再与H3、H4进行第三反应，得到结合待检测样品的磁珠。
其中，所述第一反应后，磁力保留磁珠，将上清液转移至新的离心管内，测定荧光信号峰值。
步骤S2中，所述第一反应、第二反应和第三反应的温度为20～30℃，优选为室温；所述第一反应、第二反应和第三反应的时间为1～3h，所述第一反应的时间优选为2h，所述第二反应的时间优选为1h，所述第三反应的时间优选为2h。
步骤S4中，所述EIS缓冲液成分为：PBS缓冲液中溶解5mM k4[Fe(CN)6]，5mM k3[Fe(CN)6]，100mM KCl。
本发明中，所述室温为25℃。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明通过引入磁性纳米颗粒以及在其表面进行核酸适配体的有序组装，极大的简化了产气荚膜梭菌检测过程中的操作步骤，降低了产气荚膜梭菌的检测成本。
(2)本发明通过荧光标记核酸适配体建立荧光信号通道，通过荧光信号通道与电化学信号通道双验证，极大的提高了检测结果的准确度。
(3)本发明提供的检测方法具有高灵敏度、低成本、快速等优点。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为用于检测产气荚膜梭菌的DNA生物传感器原理图。
图2为特异性引物筛选电泳表征图，1，无菌水；2，恶臭假单胞菌；3，肺炎克雷伯菌；4，大肠杆菌；5，铜绿假单胞菌；6，植物乳杆菌；7，枯草芽孢杆菌；8，沙门氏菌；9，金黄色葡萄球菌；10，匙形梭菌；11，产气荚膜梭菌。
图3为用于检测产气荚膜梭菌的DNA生物传感器原理验证；(A)CV表征；(B)EIS表征；(C)CV不同扫速表征；(D)不同扫速平方根；其中，A、B中a-d分别表示磁珠活化、酰胺基反应、恒温链式扩增反应、嵌入亚甲基蓝后的CV和EIS图谱；其中，C中a-k分别代表的扫速为：25mV/S、50mV/S、100mV/S、150mV/S、200mV/S、250mV/S、300mV/S、350mV/S、400mV/S、450mV/S、500mV/S。
图4为琼脂糖凝胶电泳表征，1，DNA walker；2，Aptamer；3-6，H1-H4；7，triggerDNA；8，DNA walker+aptamer；9，DNA walker+aptamer+C.P.DNA；10，DNA walker+H1+H2；11，DNA walker+H1+H2+Trigger DNA；12，DNA walker+H1+H2+C.P.DNA+H3+H4.各物质浓度均为50μM。
图5为用于检测产气荚膜梭菌的DNA生物传感器特异性验证。
图6为用于检测产气荚膜梭菌的DNA生物传感器线性关系验证，(A)荧光信号通道线性关系；(B)电化学信号通道线性关系。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：产气荚膜梭菌的检测
1.1产气荚膜梭菌特异性引物的筛选
方法：由TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取恶臭假单胞菌(CICC 20677)、肺炎克雷伯氏菌(CICC 20093)、大肠杆菌(CICC C0031)、铜绿假单胞菌(CICC 21625)、植物乳杆菌(CICC 6240)、枯草芽孢杆菌(CICC25064)、沙门氏菌(CICC B0082)、金黄色葡萄球菌(CICC B0172)、匙形梭菌(ATCC 17787)、产气荚膜梭菌(CICC 22949)的基因组，以提取的基因组为模板，利用引物CPA-F(5’-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3’)和CPA-R(5’-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3’)进行PCR扩增，PCR扩增程序为94℃预变性4min；94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证。如图2所示，由结果可知，CPA引物与产气荚膜梭菌具有较好的特异性，可用于DNA生物传感器的制备。
1.2DNA生物传感器原理验证
a、磁珠活化：表面修饰有羧基的磁珠(直径0.3μm，浓度50mg/mL)由生工生物工程(上海)股份有限公司获得，将10μL磁珠加入2mL离心管中，磁力保留磁珠去除上清，加入100μL活化剂(NHS和DEC混合溶液，溶于PBS中，浓度均为25mM)，在室温下振摇1h，经PBS清洗后重新悬浮在100μL PBS缓冲液中，通过电化学工作站进行循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱图(EIS)扫描。
b、酰胺基反应：经活化后的磁珠清洗后重新悬浮在92μL PBS缓冲液中，加入DNAwalker、带有荧光标记的Aptamer、H1、H2(序列见表1，均溶于纯水中，浓度均为50μM)各2μL，在室温下振摇2h，经PBS清洗后重新悬浮在100μL PBS缓冲液中，通过电化学工作站进行循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱图(EIS)扫描。
封闭活性位点：经活化、酰胺基反应得到的功能化磁珠清洗后，加入10μL牛血清蛋白(2μg/mL)室温下振摇1h，封闭磁珠表面其他未修饰寡核苷酸链的活性位点。
c、恒温链式扩增反应：经活化、酰胺基反应、封闭活性位点后得到的功能化磁珠，经PBS清洗后并重新悬浮在98μL PBS缓冲液中，加入2μL产气荚膜梭菌基因组DNA(应用TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取得到DNA样本)，室温下振摇2h。磁珠经PBS缓冲液清洗后并重新悬浮在98μLPBS缓冲液中，加入2μL Trigger DNA(序列见表1，溶于纯水中，浓度为50μM)，室温下振摇1h。通过PBS缓冲液将未反应的Trigger DNA洗掉重新悬浮在96μL PBS缓冲液中，加入H3、H4各2μL(序列见表1，均溶于纯水中，浓度均为50μM)，室温下振摇1h，经PBS清洗后重新悬浮在100μL PBS缓冲液中，通过电化学工作站进行循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱图(EIS)扫描。
d、嵌入亚甲基蓝：经PBS缓冲液清洗后将磁珠悬浮在99μL PBS缓冲液中，最后加入1mM亚甲基蓝1μL，室温振摇1h。检测前再次使用PBS缓冲液将未发生反应的亚甲基蓝洗去，并重新分散在100μL PBS缓冲液中，通过电化学工作站进行循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱图(EIS)扫描。
综合上述四个步骤，对本发明的检测原理进行了验证，结果表明，随着反应的逐步进行，电化学信号强度也在逐步增大，反应体系的电阻抗性也在逐步增大(图3A、B)。
且对步骤d的产物进行不同扫速的循环伏安法(CV)电化学检测(图3C、D)。结果表明随着扫描速率的增加，峰值点位保持不变，此外在不同的扫描速率下(图3D)，阳极和阴极峰点位是一致的，表明峰分离的电化学反应是可逆的。因此，本发明的检测原理是可行的。
随后经2％琼脂糖凝胶电泳验证了寡核苷酸链的组装(图4)，1-7分别为(DNAwalker，Aptamer，H1-H4，trigger DNA)，当Aptamer与DNA walker互补配对后(泳道8)，对比泳道2，条带分子量明显变大，表明Aptamer成功结合在DNA walker表面。随后由于碱基互补配对，Aptamer从DNA walker表面脱离(泳道9)。泳道10与泳道11表明：在没有C.P.DNA存在时，即使存在Trigger DNA，也不会触发后续反应。当产气荚膜序列存在时(泳道12)，条带分子量略微变小，这可能是因为Aptamer被捕获，从而表明DNA生物传感器成功构建。
表1本发明所应用的寡核苷酸序列
Figure BDA0003553680640000061
Figure BDA0003553680640000071
1.3 DNA生物传感器特异性验证
如1.2所述，磁珠经活化、酰胺基反应后用PBS缓冲液清洗磁珠并重新悬浮在98μLPBS缓冲液中，加入2μL待测DNA样本(产气荚膜梭菌(CICC 22949)、匙形梭菌(ATCC17787)、大肠杆菌(CICC C0031)、植物乳杆菌(CICC 6240)、铜绿假单胞菌(CICC 21625)、杀鲑气单胞菌(CICC 23564)、金黄色葡萄球菌(CICC B0172)、恶臭假单胞菌(CICC 20677)和混合样本)室温下振摇2h使待测样本中的DNA与体系充分发生反应。其中DNA样本均由TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取得到。
随后进行恒温链式扩增反应，经待测样本修饰后的磁珠由PBS缓冲液清洗后并重新悬浮在98μL PBS缓冲液中，加入2μL Trigger DNA(50μM)，室温下振摇1h。通过PBS缓冲液清洗未反应的Trigger DNA并重新悬浮在96μLPBS缓冲液中，加入H3、H4各2μL(50μM)，室温下振摇1h，使得寡核苷酸链在磁珠表面进行充分的恒温链式扩增反应。
最终嵌入亚甲基蓝，经PBS缓冲液清洗后将磁珠悬浮在99μL PBS缓冲液中，最后加入1mM亚甲基蓝1μL，室温振摇1h。检测前再次使用PBS缓冲液将未发生反应的亚甲基蓝洗去，并重新分散在100μL PBS缓冲液中，取10μL进行电化学检测，得到DPV电化学信号(图5)。
结果表明，本发明对产气荚膜梭菌的检测具有极高的特异性，即使在多种菌株的混合样本中依旧能够检测到产气荚膜梭菌。
1.4产气荚膜梭菌浓度与信号峰值的线性关系
如1.2所述，磁珠经活化、酰胺基反应并封闭活性位点后用PBS缓冲液清洗磁珠并重新悬浮在98μLPBS缓冲液中，加入2μL已知产气荚膜梭菌10倍浓度梯度的DNA样本(1-108CFU/mL)。室温下振摇2h使DNA与体系充分发生反应。磁力保留磁珠，将上清液转移至新的离心管内，测定荧光信号峰值。
随后如1.3所述进行恒温链式扩增反应、亚甲基蓝的嵌入，测定DPV电化学信号。
将荧光信号值、DPV电化学值分别与产气荚膜梭菌浓度进行线性关系拟合(图6)，结果表明，线性关系呈极显著。
1.5实际样本的模拟检验
待测物的前处理：首先分别将1mL浓度为10CFU/ml、100CFU/ml完全活化的产气荚膜梭菌(CICC 22949)加入到10g鸡肉(市场购买的冷鲜鸡肉，经辐照无菌化处理)中，以模拟产气荚膜梭菌对鸡肉的污染，加入90mL生理盐水均质取1mL混合液，再通过TIANampBacteria DNA Kit细菌基因组DNA细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取其中DNA得到待测样本。
如1.4所述磁珠经活化、酰胺基反应、与待测样本结合后磁力保留磁珠，将上清液转移至新的离心管内，测定荧光信号。随后进行恒温链式扩增反应、亚甲基蓝的嵌入，测定DPV电化学信号，最终结合荧光信号，将信号峰值带入对应的线性关系中计算样本中产气荚膜梭菌浓度，最终结果测得鸡肉中产气荚膜梭菌浓度分别为1.12CFU/g、10.17CFU/g，与前处理步骤中产气荚膜梭菌添加量相对应几乎相同。
综上，本发明提供的产气荚膜梭菌的快速检测方法可实现5h(总DNA提取1h、恒温链式扩增反应2h、亚甲基蓝的嵌入2h，总计5h)快速检测，由于亚甲基蓝具有可以嵌入核酸双链结构内的特性，故亚甲基蓝的加入可将电信号扩大；通过在核酸适配体修饰一段荧光标记，引入荧光信号通道，与电信号通道进行互相验证，大大增加检测方法的可信度和灵敏度。
本发明提供了一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的DNA生物传感器及其检测方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种用于快速检测肉制品中产气荚膜梭菌的DNA生物传感器及其检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> DNA walker
<400> 1
tttttttttt tttttttttt tacagagcac gggaatgtta ctgcctgt 48
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Aptamer
<400> 2
tcaacggcag taacattagc 20
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> H1
<400> 3
ttttttacag gcagtaacta agccgtagat gttactgcca cgtgcgga 48
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> H2
<400> 4
ttttttccgt cattgattcg gcatctacaa tgacgg 36
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Trigger DNA
<400> 5
tactttgcct atccgcacgt 20
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> H3
<400> 6
aaggttgtat agtaggcaaa gtaactatac aacctactac ctca 44
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> H4
<400> 7
actttgccta ctatacaatg aggtagtagg ttgtatagta ggaa 44
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> CPA-F
<400> 8
gctaatgtta ctgccgttga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> CPA-R
<400> 9
cctctgatac atcgtgtaag 20

Claims (10)

1.一种检测产气荚膜梭菌的DNA生物传感器，其特征在于，包括表面修饰有羧基的纳米磁珠，以及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～7所示的DNA walker、Aptamer、H1、H2、TriggerDNA、H3、H4。
2.一种检测产气荚膜梭菌的试剂盒，其特征在于，包括表面修饰有羧基的纳米磁珠，以及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～7所示的DNA walker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4。
3.根据权利要求1所述DNA生物传感器或权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述表面修饰有羧基的纳米磁珠的浓度为40～60mg/mL。
4.根据权利要求1所述DNA生物传感器或权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述DNAwalker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4均溶于水中，浓度均为40～60μM。
5.一种检测产气荚膜梭菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将表面修饰有羧基的纳米磁珠活化后与DNA walker、Aptamer、H1、H2经酰胺基反应，得到修饰有核酸适配体的纳米磁珠；
S2：将修饰有核酸适配体的纳米磁珠、含有产气荚膜梭菌的待检测样品、Trigger DNA、H3、H4经恒温链式扩增反应，得到结合待检测样品的磁珠；
S3：向步骤S2所得磁珠中加入亚甲基蓝反应；
S4：取步骤S3所得产物进行电化学检测和/或荧光检测；
其中，所述DNA walker、Aptamer、H1、H2、Trigger DNA、H3、H4的核苷酸序列分别如SEQID NO：1～7所示。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述表面修饰有羧基的纳米磁珠的浓度为40～60mg/mL；所述DNA walker、Aptamer、H1、H2均溶于水中，浓度均为40～60μM；所述表面修饰有羧基的纳米磁珠与DNA walker、Aptamer、H1、H2水溶液的体积比为10：1～3：1～3：1～3：1～3。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述反应的温度为20～30℃；所述反应的时间为1～3h。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述Trigger DNA、H3、H4均溶于水中，浓度均为40～60μM；所述表面修饰有羧基的纳米磁珠与含有产气荚膜梭菌的待检测样品、Trigger DNA、H3、H4水溶液的体积比为10：1～3：1～3：1～3：1～3。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2中，将修饰有核酸适配体的纳米磁珠先与含有产气荚膜梭菌的待检测样品进行第一反应，再与Trigger DNA进行第二反应，再与H3、H4进行第三反应，得到结合待检测样品的磁珠。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述第一反应、第二反应和第三反应的温度为20～30℃；所述第一反应、第二反应和第三反应的时间为1～3h。
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