CN110687174B - 基于金-硒金属分子界面构建高保真的电化学生物检测平台 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于金‑硒金属分子界面构建高保真的电化学生物检测平台,属于生物检测和分子生物学技术领域。与现有的Au‑S电极‑生物分子界面技术相比,本发明Au‑Se电极‑生物金属性分子界面具有高稳定性、高效性,能抵抗GSH等生物硫醇分子的破坏,有效的抑制GSH的配体交换反应,使得电化学检测分析结果高保真、低假阳性。大大提高了目标生物分子的检测灵敏度,具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物检测和分子生物学技术领域,具体涉及基于金-硒金属分子界面构建高保真的电化学生物检测平台。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
金电极具有高的化学稳定性、可调的光电子性能和表面改性能力、抗氧化性和良好的生物相容性,为开发性价比高,检测速度快,灵敏度高的电化学传感器平台提供了良好的途径。
稳定且可修饰的金电极与生物分子的连接方式对于形成稳定的纳米结构和金与生物分子之间的电子传递至关重要。基于金与硫之间的共价键(Au-S)所构建的Au-S电化学检测平台凭借金电极表面连接核酸、适配体、抗原等免疫分子、氨基酸或多肽等生物分子以及生物酶实现了核酸电化学传感器、免疫电化学传感器、生物分子电化学传感器以及酶催化电化学传感器的构建,并被广泛应用于特异性生物共轭标记和生物传感和医学治疗等领域。
然而,已有研究指出Au-S电化学检测平台中Au-S键形成的电极-分子界面对电化学检测器件来说并不理想。首先,取决于电极-分子界面电子结构的电荷注入能量势垒是电化学检测器件的重要参数。电荷注入能量势垒(费米能级)越小,电极电子越容易注入连接分子,优异的导电性,使得电化学传感器功耗降低。当器件尺寸减小到单个分子水平时,尤其电极-分子界面对器件性能的影响更为显著。金与硫之间的共价键(Au-S)费米能级高,导致电极向分子注入电荷的障碍较大。其次,电化学检测器件的生物选择性是其应用于生物实际样品的另一重要要求。在生物实际样品中含有丰富的谷胱甘肽(GSH)(5mM~10mM)等生物硫醇分子,导致GSH取代硫醇分子发生Au配体交换反应,导致检测信号失真,分析结果假阳性率上升。因此,传统的基于金与硫之间的共价键(Au-S)的电化学检测平台面临着谷胱甘肽(GSH)等生物硫醇影响、优化电极向分子注入电荷障碍等诸多挑战。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明提供一种基于金-硒金属性分子界面所构建的高保真电化学生物检测平台实现实际样品中生物分子高保真、低假阳性的电化学分析系统和方法。由Au-Se键形成的金属-分子界面是一种金属性界面。其HOMO能带宽,其费米能级小于传统的Au-S费米能级,有利于电子从金属到分子的转移和电子输运,提高电化学检测器件检测效率。因此,金-硒键被认为是满足电化学检测器件特性的一种有效的金属性分子界面;另一方面,Au-Se键较Au-S键具有更高的键合能力。更加稳定的电极-分子连接方式阻碍了GSH等硫醇分子的影响,有助于提高检测灵敏度与特异性,提供高保真的检测结果。综上所述,利用本发明可以提高电化学检测器件的生物分子检测效率并有效地减少环境中GSH等生物硫醇分子对分子界面的破坏,降低假阳性,具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明还提供了一种具有金-硒金属性分子界面电极的制备方法,包括:
将MMP-2特异性识别的多肽分子进行Se官能团化,形成Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽分子;
将Au电极置于Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽溶液,孵育,通过Au-Se键作用,在Au电极表面形成金-硒金属性分子界面。
在一些实施例中,所述Se官能团化的具体方法为:利用氨基酸间的酰胺反应在MMP-2特异性识别的多肽分子羧基端(-COOH)连接Se-Cys;
所述Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽序列具体为:
Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-[Se-Gys](SEQ ID NO.1),其中,Se-Cys的-SeH裸露。
在一些实施例中,所述Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽溶液的浓度为10~12μg/mL,溶剂为PBS。
在一些实施例中,所述孵育在37~37.5℃下进行24~25h。
本发明还提供了任一上述的方法制备的具有金-硒金属性分子界面的电极。
本发明还提供了一种金-硒电化学生物检测平台,所述检测平台包括:
具有金-硒金属性分子界面的电极,以及修饰在上述具有金-硒金属性分子界面的电极的寡核苷酸。
所述寡核苷酸为羧基化的富C碱基的寡核苷酸单链;寡核苷酸序列如下:
5′-CCCCCCCCCCCC-COOH-3′(SEQ ID NO.2)。
进一步的,所述寡核苷酸与Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽的氨基端(-NH2)通过酰胺键连接。
本发明还提供了上述金-硒电化学生物检测平台在检测MMP-2中的应用。
本发明还提供了一种基于金-硒电化学生物检测平台检测MMP-2的方法,包括:
向上述电化学生物检测平台加入钼酸钠溶液孵育后,向其中加入待测样品,采用方波伏安法进行电化学分析测定。
所述待测样品为生物样品,所述生物样品包括但不限于细胞样品、组织样品和血液样品;所述血液样品为血清样品。
具体的,所述检测方法包括:对待测样品进行电化学分析测定,得到0.2V处的氧化还原电流值;通过对比标准曲线,确定待测样品中MMP-2的浓度。
本发明的有益效果在于:
(1)与现有技术相比,本发明具有降低了传统电化学生物检测平台的假阳性,使得能够分析GSH等生物硫醇环境中的低含量的目标生物分子,并能保证检测的高保真。
(2)本申请的操作方法简单、灵敏度高、具有普适性,易于规模化生产。同时,通过调整多肽序列,金-硒电化学生物检测平台可实现多种目标生物分子的高保真检测,因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。
图1是本发明实施例1的高保真金-硒电化学生物检测平台的组装、检测原理示意图;
图2是本发明实施例1的电化学生物检测平台的组装电化学表征相关图;A.金-硒电化学生物检测平台的组装循环伏安表征图:(a)裸电极、(b)Se-多肽分子修饰电极和(c)ssDNA修饰电极在5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-中的循环伏安测量;B.金-硒电化学生物检测平台的组装方波伏安表征图:(a)裸电极、(b)Se-多肽分子修饰电极和(c)ssDNA修饰电极在0.5mol/L H2SO4中的方波伏安测量;C.金-硫电化学生物检测平台的组装循环伏安表征图:(a)裸电极、(b)Se-多肽分子修饰电极和(c)ssDNA修饰电极在5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-中的循环伏安测量;D.金-硫电化学生物检测平台的组装方波伏安表征图:(a)裸电极、(b)Se-多肽分子修饰电极和(c)ssDNA修饰电极在0.5mol/L H2SO4中的方波伏安测量;
图3是本发明实施例1的新型金-硒金属性生物分子界面与金-硒电化学生物检测平台的交流阻抗表征图,(a)Au-Se-多肽分子和(b)Au-S-多肽分子在0.5mol/L H2SO4中的交流阻抗测量;
图4是本发明实施例1的金-硒电化学生物检测平台与传统金-硫电化学生物检测平台的GSH稳定性实验图;
图5是本发明实施例1的电化学生物检测平台的MMP-2+GSH稳定性实验图;其中,A为本发明的金-硒电化学生物检测平台;B为传统金-硫电化学生物检测平台。
图6是本发明实施例1的金-硒电化学生物检测平台的特异性实验图;
图7是本发明实施例1的金-硒电化学生物检测平台的MMP-2检测线性实验图;
图8是本发明实施例1的电化学生物检测平台对脂多糖(LPS)刺激肝癌细胞MMP-2分泌浓度实时监测实验图;其中,A为本发明的金-硒电化学生物检测平台;B为传统金-硫电化学生物检测平台。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,传统的基于金与硫之间的共价键(Au-S)的电化学检测平台面临着谷胱甘肽(GSH)等生物硫醇影响、优化电极向分子注入电荷障碍等诸多挑战,更限制了其在生物医学上的实际应用。
有鉴于此,本发明的一个具体实施方式中,提供一种高效、高保真的新型电化学传感平台。所述方法包括:构建金-硒金属性分子界面;构建金-硒电化学生物检测平台;MMP-2金-硒电化学生物检测平台的检测分析标准曲线;LPS刺激肝癌细胞中实时MMP-2的检测。
本发明的第一个方面,提供基于金-硒金属性分子界面所构建的保真的金-硒电化学生物检测平台实现实际样品中生物分子高保真、低假阳性的电化学分析检测方法,所述方法包括:
--金-硒金属性分子界面的构建:在MMP-2特异性识别的多肽的羧基端连接连接Se-Cys,实现了多肽分子的Se官能团化。多肽分子通过Au-Se共价键合与Au电极表面,实现了金-硒金属性分子界面的构建。
其中,所述Au-Se共价键键合的具体方法为:Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽溶解于PBS(X1)并配置10nmol/L溶液,所述Au电极需通过化学清洗与电化学清洗,所述构建Se官能团化的多肽PBS溶液并置于Au电极表面37℃进行孵育24h。
--金-硒电化学生物检测平台:Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽连接3′端羧基化修饰的12个C碱基的单链DNA。
所述Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽的氨基端与3′端羧基化修饰的12个C碱基的单链DNA通过酰胺键进行连接。所述12个C碱基的单链DNA作为电化学信号标签应用于MMP-2的电化学分析。
--MMP-2的金-硒电化学生物检测方法原理:
由于C带正电荷,ssDNA结构可以通过静电吸附Mo2O3 2-;DNA骨架中的磷酸盐与钼酸盐发生反应,在0.2V时产生氧化还原电流。当引入目标MMP-2时,MMP-2特异性的识别和裂解多肽。0.2V的氧化还原电流减小了。因此,可以通过电流的变化来检测MMP-2的浓度。
所述检测步骤:
具体的,所述检测步骤包括:构建金-硒金属性分子界面;构建金-硒电化学生物检测平台;构建MMP-2金-硒电化学生物检测平台的检测分析标准曲线;LPS刺激肝癌细胞中实时MMP-2的检测。
本发明的第一个方面,基于Se-Cys,对多肽序列进行修饰,实现了多肽的Se官能团化。
其中,通过氨基酸间的酰胺反应在多肽羧基端链接Se-Cys,从而实现了多肽的Se官能团化。
本发明的第二个方面,Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽通过Au-Se共价键链接到Au电极表面,构建了新型Au-Se金属性生物分子界面。
其中,将构建获得的Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽溶解于PBS(X1)并配置10nmol/L溶液,所述Au电极需通过化学清洗与电化学清洗,将构建获得的Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽PBS溶液并置于Au电极表面37℃进行孵育24h。所形成的Au-Se共价键较Au-S共价键具有更高的键合能量,使得难以被GSH等生物硫醇所破坏。
本发明的第三个方面,基于新型Au-Se金属性生物分子界面,构建金-硒电化学生物检测平台。
其中,Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽连接3′端羧基化修饰的12个C碱基的单链DNA。12个C碱基的单链DNA作为电化学信号标签应用于MMP-2的电化学分析。
所述的金-硒电化学生物检测平台应用检测不限于MMP-2。通过调整多肽序列,金-硒电化学生物检测平台可实现多种目标物的高保真检测。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外,实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法,具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。
实施例1:
构建的实验步骤:
--构建金-硒金属性分子界面:首先合成Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽分子。基于氨基酸间的酰胺反应在氨基端连接Se-Cys,从而实现了多肽的Se官能团化。将硒代半胱氨酸(Se-Cys)修饰的MMP-2特异性识别的多肽(Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-[Se-Gys],宁波康贝生化有限公司)溶解于PBS(X1)并配置10μg/mL多肽分子溶液。
然后将经化学清洗与电化学活化的Au电极置于Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽PBS(X1)溶液,并在37℃下进行孵育24h,使得Au电极表面形成金-硒金属性分子界面;
--构建金-硒电化学生物检测平台:基于所构建的金-硒金属性分子界面,Au电极表面通过Au-Se连接的Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽与3′羧基(-COOH)修饰的12个C碱基的单链DNA(5′-CCCCCCCCCCCC-COOH-3′,宁波康贝生化有限公司)通过酰胺键进行连接。首先,将通过Au-Se链接Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽分子的Au电极置于氨基/羧基活化剂((N-羟基琥珀酰亚胺NHS(0.4mol/L)-1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC(0.1mol/L))中进行30min氨基活化处理。将所述12个C碱基的单链DNA(12C-ssDNA)配置成10mmol/L的PBS(X1)溶液,并置于氨基羧基活化剂溶液中(12C-ssDNA终浓度为10μmol/L)继续孵育2小时。连接12C-ssDNA结束后,用PBS(X1)冲洗三次,N2吹干。12C-ssDNA作为电化学信号标签应用于MMP-2的电化学分析。最后在含1mmol/L的6-硫基-1-己醇(MCH)滴加到Au电极表面,孵育0.5h,阻断可能引起非特异性吸附的位点。最后用PBS(X1)冲洗三次,N2吹干后置于4℃待用;
--MMP-2金-硒电化学生物检测平台的检测分析标准曲线:基于构建的金-硒电化学生物检测平台,对MMP-2的检测分析性能进行研究并绘制标准曲线。20μL MMP-2不同浓度(1μmol/L,1×10-1μmol/L,1×10-2μmol/L,1×10–3μmol/L,1×10–4μmol/L,1×10-5μmol/L,1×10-6μmol/L)的PBS(X1)置于电极表面在37℃孵育2h。用PBS(X1)反复冲洗三后,N2吹干。在方波伏安(SWV)表征之前,5μL 1mmol/L Na2MoO4溶液滴到电极表面孵育20min。对不同浓度的MMP-2的PBS(X1)溶液进行检测分析,得到高低不同的0.2V处的氧化还原电流值。对CMMP-2取log10,并与相对应电流峰值绘制标准曲线,从而得到MMP-2金-硒电化学生物检测平台的检测分析标准曲线。基质金属蛋白酶2(MMP-2),又被称作非糖化的明胶酶,是MMPs家族成员中研究最多的成员之一。作为癌症标记物,一般情况下MMP-2在正常组织中的表达量比较低。而当系统受到外界刺激或者处于病理状态下时,MMP-2的表达量会有所升高。目前已经有相关研究阐明,MMP-2在许多的恶性肿瘤(肺癌、肝癌、乳腺癌)中表达水平均增加,并且可以促进肿瘤细胞的浸润、转移以及远处转移,它是肿瘤侵袭转移的重要生物分子标志物。在肿瘤转移的过程中,胞外分泌型酶类的活性会升高,MMP-2能够通过降解细胞外基质中的IV型胶原蛋白进而起到易于肿瘤细胞转移的作用。此外,MMP-2还可以降解V型、VII型胶原蛋白以及明胶,它与肿瘤侵袭转移的关系最为密切。由于MMP-2可以激活细胞外基质中的结构蛋白的潜在活性,它在自发刺激肿瘤细胞迁移、吸引炎症细胞以及肿瘤结节内新生血管形成的早期中发挥着重要的作用,通过对它们活性的检测可以为我们提供肿瘤细胞的恶化情况,有利于实现对肿瘤的检测和治疗。然而MMP-2存在于细胞质与细胞培养液中,存在环境中丰富的GSH等生物硫醇对Au-S电化学检测平台影响显著,使得难以高保真的实现MMP-2的检测分析。因此,一种基于金-硒金属性分子界面所构建的高保真电化学生物检测平台实现实际样品中生物分子高保真、低假阳性的电化学分析系统和方法,并可以提高电化学检测器件的生物分子检测效率并有效地减少环境中GSH等生物硫醇分子对分子界面的破坏,降低假阳性。
--MMP-2实际样品的获取:从培养基上清获得肝癌细胞株HepG2 MMP-2样品。用密度为1×106个细胞/mL的PBS洗涤HEPG2(24-well板中融合80%)两次,然后用10pg/mL LPS在37℃无血清培养基中处理(0h,1h,2h,3h,4h,6h,12h,24h),在5%CO2和95%空气的湿化气氛中处理。取上清液,于-70℃保存备用。
--MMP-2实际样品的电化学检测:
20μL的不同LPS刺激时间的实际样品血清置于MMP-2金-硒电化学生物检测平台电极表面在37℃孵育2h。用PBS(X1)反复冲洗三后,N2吹干。在SWV表征之前,5μL 1mmol/LNa2MoO4溶液滴到电极表面孵育20min。对不同浓度的MMP-2的PBS(X1)溶液进行检测分析,得到高低不同的0.2V处的氧化还原电流值。通过对比标准曲线,实现对实际样品血清中MMP-2的检测分析。与Au-Se电化学检测平台相比,细胞培养液中的GSH对Au-S有显著影响(图5A和图5B),表明金-硒分子界面的稳定性对高保真度、灵敏度和特异性分析结果有重要贡献,并成功实现了MMP-2的电化学检测策略。
最后应该说明的是,以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 基于金-硒金属分子界面构建高保真的电化学生物检测平台
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly
1 5
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccccccccc cc 12
Claims (6)
1.一种基于金-硒电化学生物检测平台检测基质金属蛋白酶 2MMP-2的方法,所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的,其特征在于,包括:
向金-硒电化学生物检测平台加入钼酸钠溶液孵育后,向其中加入待测样品,采用方波伏安法进行电化学分析测定;
所述方法包括:对待测样品进行电化学分析测定,得到0.2 V处的氧化还原电流值;通过对比标准曲线,确定待测样品中MMP-2的浓度;
其中,所述金-硒电化学生物检测平台包括:
具有金-硒金属性分子界面的电极,以及修饰在上述具有金-硒金属性分子界面的电极的寡核苷酸;所述寡核苷酸为羧基化的富C碱基的寡核苷酸单链;所述寡核苷酸序列如下:5′ -CCCCCCCCCCCC-COOH-3′;
所述电极,其制备方法包括:
将MMP-2特异性识别的多肽分子进行Se官能团化,形成Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽分子;
将Au电极置于Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽溶液,孵育,得到具有金-硒金属性分子界面电极;
所述Se官能团化的具体方法为:利用氨基酸间的酰胺反应在MMP-2特异性识别的多肽分子羧基端连接Se-Cys;
所述Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽序列具体为:
Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-[Se-Gys],其中,Se-Cys的-SeH裸露。
2.如权利要求1所述方法,其特征在于,所述待测样品为生物样品。
3.如权利要求2所述方法,其特征在于,所述生物样品包括细胞样品、组织样品和血液样品。
4.如权利要求3所述方法,其特征在于,所述血液样品为血清样品。
5.如权利要求1所述方法,其特征在于,所述Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽溶液的浓度为10~12μg/mL,溶剂为PBS;所述孵育在37~37.5℃下进行24~25 h。
6.如权利要求1所述方法,其特征在于,所述寡核苷酸与Se官能团化的MMP-2特异性识别的多肽的氨基端通过酰胺键连接。
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2019
- 2019-10-25 CN CN201911025356.XA patent/CN110687174B/zh active Active
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CN110687174A (zh) | 2020-01-14 |
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