CN114527186B - 一种基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Ti3C2‑Au的microRNA电化学生物传感器及其制备方法和应用;所述传感器包括工作电极和连接有G4‑DNA信号探针的AuNPs胶体;所述工作电极为Ti3C2‑Au复合纳米材料和探针DNA依次沉积在玻碳电极上。本发明待测microRNA通过分别与DNA探针和修饰有G4‑DNA信号探针的AuNPs进行碱基互补配对形成三明治结构,并且利用DNA信号探针形成G四链体结合电信号分子MB,实现检测信号的放大。本发明制备microRNA电化学生物传感器具有优异的性能,包括灵敏度高、线性范围宽和特异性好等特点,适用于血清样品中miRNA的检测。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物传感器技术领域,具体涉及一种基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器及其制备方法和应用。
技术背景
微小RNA(microRNA)是一类由18-25个核苷酸组成的单链非编码内源性RNA分子,通过影响细胞增殖、分化和凋亡在动植物中发挥着至关重要的作用。microRNA的异常表达与多种人类疾病有关,如癌症、糖尿病、心血管疾病、肾脏疾病等。近年来,研究发现microRNA与糖尿病肾病(DN)的发生与发展密切相关。其中,microRNA-377在小鼠DN模型中过表达,可以间接促进纤维连接蛋白的合成。此外,血清microRNA-377的含量在DN患者中上调较高。鉴于microRNA在体液中可以稳定存在,microRNA-377可以作为检测糖尿病肾病的一种新型非侵入性生物标志物。
由于microRNA具有序列短、同源性高和在体液中丰度低等特点,准确、灵敏、快速的对microRNA进行定量仍然具有挑战性。传统的microRNA检测技术有很多,如实时定量聚合酶链反应、诺瑟杂交和微阵列等,但是它们都存在检测时间长、成本高、灵敏度低、依赖精密仪器等局限性。近年来,电化学传感器以其便携、简单、成本低、灵敏度高而备受关注。CN112899348公布了一种用于检测外泌体microRNA的MDTs-CHA体系电化学传感器,但其检测过程较为复杂,且需要设计多种DNA链以形成四面体作为电化学报告信号分子的载体。为了满足真实样品中microRNA的超灵敏检测的需求,基于纳米材料的信号放大策略是增强电化学生物传感性能最有效、应用最广泛的方法之一,具有很好的研究和应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本发明的目的是提供一种基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器及制备方法和应用。该传感器对于检测microRNA具有灵敏度高、检测范围宽和选择性强的特点。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器,包括工作电极和连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体;所述工作电极为Ti3C2-Au复合纳米材料和DNA探针依次沉积在玻碳电极上。
优选的,所述DNA探针的序列为:5′-CTTTGTGTGATTAC-(CH2)6-SH-3′;
优选的,所述G4-DNA信号探针的序列为:
5′-SH-(CH2)6-CGTACAAAAGTTGCATAGGGAGGGAGGGAGGGTC-3′。
优选的,所述基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器,还包括参比电极、对电极;所述参比电极为Ag/AgCl,所述对电极为金属铂;
优选的,所述基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器还包括含有KCl的MB溶液。
优选的,所述Ti3C2-Au复合纳米材料的制备方法为:
(1)将氟化锂分散到盐酸溶液中,搅拌处理;然后加入Ti3AlC2粉末,搅拌刻蚀;离心、洗涤至pH接近中性后,在保护气氛下超声,离心后取上清液冻干,制得Ti3C2纳米片粉末;
(2)将步骤(1)制得的Ti3C2纳米片粉末分散到去离子水中,超声处理,得到Ti3C2悬浮液;
(3)将HAuCl4溶液滴入到步骤(2)制得的Ti3C2悬浮液,室温下反应,离心洗涤后冻干,得到Ti3C2-Au复合纳米材料。
进一步优选的,步骤(1)所述氟化锂与盐酸溶液的质量体积比为1.0-2.0g:20-40mL;所述氟化锂与Ti3AlC2粉末的质量比为1:1-1:2;
进一步优选的,步骤(1)所述搅拌处理的温度为35-45℃,时间为30-50分钟;所述搅拌刻蚀的时间为24-36h;所述保护气氛为氩气,所述超声的时间为1-1.5h;
进一步优选的,步骤(2)所述Ti3C2纳米材料粉末分散在去离子水中配成1-1.5mg/mL的悬浮液;步骤(2)所述超声处理的时间为30-50分钟;
进一步优选的,步骤(3)所述HAuCl4溶液的浓度为10-15mM;所述反应的时间为30-40分钟。
上述的基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)将Ti3C2-Au复合纳米材料分散到去离子水中,超声处理,得到Ti3C2-Au悬浮液;
(2)将所述Ti3C2-Au悬浮液滴涂在玻碳电极表面,制得Ti3C2-Au/GCE;
(3)将DNA探针溶液滴涂到Ti3C2-Au/GCE表面,在2-4摄氏度下孵育12-16小时,然后与封闭剂MCH孵育40-60分钟,制得工作电极MCH/DNA/Ti3C2-Au/GCE;
(4)将G4-DNA信号探针溶液加入到AuNPs溶液中反应12-16小时后,加入含0.1-0.15M NaCl的10-20mM的PBS缓冲溶液老化24-36小时,然后离心洗涤后收集沉淀,加入10-20M的PBS缓冲溶液,得到连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体。
优选的,步骤(1)中所述Ti3C2-Au悬浮液是将Ti3C2-Au粉末分散在去离子水中配成1-1.5mg/mL的悬浮液;步骤(1)所述超声处理的时间为30-50分钟;
优选的,步骤(2)所述玻碳电极在使用前要对其表面进行打磨:将玻碳电极在氧化铝浆中打磨至镜面,然后依次在去离子水、乙醇、去离子水中超声处理5-10分钟以除去表面残留的氧化铝颗粒;
优选的,步骤(3)中,所述DNA探针溶液的浓度为2.0-2.5μM;所述封闭剂MCH溶液的浓度为1-2mM;
优选的,步骤(4)中,所述PBS缓冲溶液pH为7.0-8.0。
上述的基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器在microRNA检测中的应用,包括以下步骤:
(A)向工作电极滴涂已知浓度的miRNA溶液,在35-40摄氏度恒温孵育60-90分钟;然后与所述连接有G4-DNA信号探针的AuNPs溶液35-40摄氏度恒温孵育60-90分钟;接着与含有KCl的MB(亚甲基蓝)溶液室温下孵育60-90分钟;
(B)打开电化学工作站,将步骤(A)所得传感器于室温下在电化学工作站三电极系统采用方波伏安法进行检测;重复检测多组不同浓度的miRNA标准溶液,根据microRNA标准溶液的电流变化作标准曲线,建立浓度梯度谱线;
(C)向工作电极滴涂待测microRNA溶液,用步骤(A)和步骤(B)相同的条件在电化学工作站三电极系统中采用方波伏安法进行检测,根据步骤(B)所述浓度梯度谱线计算待测液中的miRNA浓度。
优选的,所述步骤(A)中,每次孵育结束后,工作电极用pH7.0-8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,以分别除去未吸附的miRNA、连接有G4-DNA信号探针的AuNPs和MB。
优选的,所述步骤(B)中方波伏安法的电压范围是(-0.5)-(-0.1)V。
本发明的有益效果为:
(1)本发明所用电极修饰材料是通过在Ti3C2的表面自还原HAuCl4制备的,方法清晰简单,易于操作且重复性好;
(2)本发明所制备电化学生物传感器灵敏度高、线性范围宽和特异性好;
(3)本发明所制备电化学生物传感器利用修饰有G4-DNA信号探针的AuNPs形成的G四链体结合MB实现检测信号的进一步放大,其检测限低至1.35aM。
附图说明
图1是本发明基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器传感器的制备和工作原理图;
图2是实施例1得到的Ti3C2-Au(A)和修饰有G4-DNA信号探针的AuNPs(B)的透射电子显微镜图;
图3是实施例2得到的基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器在不同浓度microRNA-377条件下测得的方波伏安法(SWV)曲线与校准曲线;
图4是实施例3得到的基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器在与不同靶标序列的RNA结合时的电流差值;NC:完全错配microRNA;miR-21:microRNA-21;TM:三碱基错配microRNA;SM:单碱基错配microRNA;miR-377:靶标microRNA-377。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚,以下通过具体的实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明的技术方案用于检测microRNA;本发明基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器的制备和工作原理图如图1所示;
以下实施例以microRNA-377为例进行说明;
实施例中的探针序列及microRNA-377如下表1
表1
实施例中使用的Ti3C2纳米材料的制备方法为:
将2.0g氟化锂分散到40mL盐酸中,在35摄氏度下搅拌30分钟,然后加入2.0gTi3AlC2粉末,在搅拌下刻蚀1天;离心、洗涤至pH接近中性后,在氩气流下超声1小时,离心后取上清液冻干,制得Ti3C2纳米片粉末。
实施例1
基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用,包括以下步骤:
(1)工作电极的制备
Ti3C2-Au复合纳米材料的制备
Ti3C2-Au通过Ti3C2表面的自还原作用合成,具体方法如下:
将5mg的Ti3C2纳米材料分散在5mL去离子水中,超声处理30分钟得到1mg/mL的Ti3C2悬浮液;将6250μL浓度为10mM的HAuCl4溶液加入到上述Ti3C2分散液中,室温下搅拌40分钟,离心洗涤后收集沉淀,重新分散在去离子水中后冻干,得到Ti3C2-Au复合纳米材料。本实施例制备的Ti3C2-Au复合纳米材料的透射电子显微镜图如图2中的A所示。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在氧化铝浆中打磨至镜面,并分别在去离子水、乙醇、去离子水中超声5分钟后,用氮气将其表面吹干,得到玻碳电极;将上述制备的Ti3C2-Au复合纳米材料重悬于去离子水中,使其浓度为1mg/mL,并用移液枪滴加10μL在打磨光滑的玻碳电极表面,在室温下干燥后得到Ti3C2-Au修饰的玻碳电极,将上述制备得到的电极与2.0μM的DNA探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在4摄氏度下滴涂孵育12个小时后,与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时,封闭未结合的活性位点,得到工作电极MCH/DNA/Ti3C2-Au/GCE。
(2)连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体的制备
AuNPs胶体是由柠檬酸钠还原HAuCl4而合成的,具体方法如下:
在回流和剧烈搅拌下煮沸100mL的HAuCl4(0.01%)溶液。然后快速向沸腾的溶液中加入2.5mL柠檬酸三钠(1%),搅拌20min,当反应溶液颜色变为酒红色时,即成功制得AuNPs。
连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体制备方法如下:
取1mL上述制备得到的AuNPs胶体,加入100μL浓度为10μM的G4-DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液),在4摄氏度下反应16小时后,加入含0.1M NaCl的10mM pH7.0 PBS缓冲溶液老化24小时,然后离心洗涤后收集沉淀,加入10mM pH7.4的PBS缓冲溶液,得到连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体。本实施例制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs的透射电子显微镜图如图2中的B所示。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2-Au修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系,其中对电极为铂丝电极,参比电极为Ag/AgCl,构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
工作电极与浓度为10fM的microRNA-377在37摄氏度下孵育1小时,然后与连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体在37摄氏度下孵育1小时,最后与含有50mM KCl的25μM MB溶液60分钟。
打开电化学工作站,于室温下进行电化学实验,在10mM PBS缓冲溶液中进行,采用方波伏安法进行测试,电压范围是(-0.5)-(-0.1)V。
实施例2
基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用,包括以下步骤:
(1)工作电极的制备
Ti3C2-Au复合纳米材料的制备
Ti3C2-Au通过Ti3C2表面的自还原作用合成,具体方法如下:
将5mg的Ti3C2纳米材料分散在5mL去离子水中,超声处理30分钟得到1mg/mL的Ti3C2悬浮液;将6250μL浓度为10mM的HAuCl4溶液加入到上述Ti3C2分散液中,室温下搅拌40分钟,离心洗涤后收集沉淀,重新分散在去离子水中后冻干,得到Ti3C2-Au复合纳米材料。本实施例制备的Ti3C2-Au复合纳米材料的透射电子显微镜图如图2中的A所示。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在氧化铝浆中打磨至镜面,并分别在去离子水、乙醇、去离子水中超声5分钟后,用氮气将其表面吹干,得到玻碳电极;将上述制备的Ti3C2-Au复合纳米材料重悬于去离子水中,使其浓度为1mg/mL,并用移液枪滴加10μL在打磨光滑的玻碳电极表面,在室温下干燥后得到Ti3C2-Au修饰的玻碳电极,将上述制备得到的电极与2.0μM的DNA探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在4摄氏度下滴涂孵育12个小时后,与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时,封闭未结合的活性位点,得到工作电极MCH/DNA/Ti3C2-Au/GCE。
(2)连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体的制备
AuNPs胶体是由柠檬酸钠还原HAuCl4而合成的,具体方法如下:
在回流和剧烈搅拌下煮沸100mL的HAuCl4(0.01%)溶液。然后快速向沸腾的溶液中加入2.5mL柠檬酸三钠(1%),搅拌20min,当反应溶液颜色变为酒红色时,即成功制得AuNPs。
连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体制备方法如下:
取1mL上述制备得到的AuNPs胶体,加入100μL浓度为10μM的G4-DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液),在4摄氏度下反应16小时后,加入含0.1M NaCl的10mM pH7.0 PBS缓冲溶液老化24小时,然后离心洗涤后收集沉淀,加入10mM pH7.4的PBS缓冲溶液,得到连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体。本实施例制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs的透射电子显微镜图如图2中的B所示。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2-Au修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系,其中对电极为铂丝电极,参比电极为Ag/AgCl,构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
工作电极与不同浓度的microRNA-377(0,10-17,10-16,10-15,10-14,10-13,10-12,10-11,10-10M)在37摄氏度下孵育1小时,然后与连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体在37摄氏度下孵育1小时,最后与含有50mM KCl的25μM MB溶液60分钟。
打开电化学工作站,于室温下进行电化学实验,在10mM PBS缓冲溶液中进行,采用方波伏安法进行测试,电压范围是(-0.5)-(-0.1)V。
本实施例制备的基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器在含有不同浓度microRNA-377的PBS缓冲溶液条件中测得的方波伏安法(SWV)曲线与校准曲线如图3所示,并绘制了电流差值(△电流)-浓度的校准曲线,随着microRNA-37浓度的增大,电流响应也急剧增加。电极在10aM-100pM的范围内表现出良好的电化学响应,线性关系曲线为y=1.68x+31.88,R2=0.9992,灵敏度为1.35aM,其中,x为microRNA-377浓度/M取对数后的数值,y为△电流/μA。
实施例3
本实施例电化学检测过程中所使用的检测序列如下表2
表2
基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用,包括以下步骤:
(1)工作电极的制备
Ti3C2-Au复合纳米材料的制备
Ti3C2-Au通过Ti3C2表面的自还原作用合成,具体方法如下:
将5mg的Ti3C2纳米材料分散在5mL去离子水中,超声处理30分钟得到1mg/mL的Ti3C2悬浮液;将6250μL浓度为10mM的HAuCl4溶液加入到上述Ti3C2分散液中,室温下搅拌40分钟,离心洗涤后收集沉淀,重新分散在去离子水中后冻干,得到Ti3C2-Au复合纳米材料。本实施例制备的Ti3C2-Au复合纳米材料的透射电子显微镜图如图2中的A所示。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在氧化铝浆中打磨至镜面,并分别在去离子水、乙醇、去离子水中超声5分钟后,用氮气将其表面吹干,得到玻碳电极;将上述制备的Ti3C2-Au复合纳米材料重悬于去离子水中,使其浓度为1mg/mL,并用移液枪滴加10μL在打磨光滑的玻碳电极表面,在室温下干燥后得到Ti3C2-Au修饰的玻碳电极,将上述制备得到的电极与2.0μM的DNA探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在4摄氏度下滴涂孵育12个小时后,与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时,封闭未结合的活性位点,得到工作电极MCH/DNA/Ti3C2-Au/GCE。
(2)连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体的制备
AuNPs胶体是由柠檬酸钠还原HAuCl4而合成的,具体方法如下:
在回流和剧烈搅拌下煮沸100mL的HAuCl4(0.01%)溶液。然后快速向沸腾的溶液中加入2.5mL柠檬酸三钠(1%),搅拌20min,当反应溶液颜色变为酒红色时,即成功制得AuNPs。
连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体制备方法如下:
取1mL上述制备得到的AuNPs胶体,加入100μL浓度为10μM的G4-DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液),在4摄氏度下反应16小时后,加入含0.1M NaCl的10mM pH7.0 PBS缓冲溶液老化24小时,然后离心洗涤后收集沉淀,加入10mM pH7.4的PBS缓冲溶液,得到连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体。本实施例制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs的透射电子显微镜图如图2中的B所示。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2-Au修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系,其中对电极为铂丝电极,参比电极为Ag/AgCl,构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
工作电极与与浓度为100fM的不同序列的microRNA(分别是表2中目标microRNA-377、与目标microRNA-377有一个碱基错位的序列、与目标microRNA-377有三个碱基错位的序列、与目标microRNA-377碱基完全错位的序列、microRNA-21在37摄氏度下孵育1小时,然后与连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体在37摄氏度下孵育1小时,最后与含有50mM KCl的25μM MB溶液60分钟。
打开电化学工作站,于室温下进行电化学实验,在10mM PBS缓冲溶液中进行,采用方波伏安法进行测试,电压范围是(-0.5)-(-0.1)V。
本实施例制备的基于Ti3C2-Au基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器,与不同序列的目标结合产生的电流响应如图4所示,电流响应有显著性差异,表明制备的传感器具有优异的特异性,具备实际应用的价值。
实施例4
基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用,包括以下步骤:
(1)工作电极的制备
Ti3C2-Au复合纳米材料的制备
Ti3C2-Au通过Ti3C2表面的自还原作用合成,具体方法如下:
将5mg的Ti3C2纳米材料分散在5mL去离子水中,超声处理30分钟得到1mg/mL的Ti3C2悬浮液;将6250μL浓度为10mM的HAuCl4溶液加入到上述Ti3C2分散液中,室温下搅拌40分钟,离心洗涤后收集沉淀,重新分散在去离子水中后冻干,得到Ti3C2-Au复合纳米材料。本实施例制备的Ti3C2-Au复合纳米材料的透射电子显微镜图如图2中的A所示。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在氧化铝浆中打磨至镜面,并分别在去离子水、乙醇、去离子水中超声5分钟后,用氮气将其表面吹干,得到玻碳电极;将上述制备的Ti3C2-Au复合纳米材料重悬于去离子水中,使其浓度为1mg/mL,并用移液枪滴加10μL在打磨光滑的玻碳电极表面,在室温下干燥后得到Ti3C2-Au修饰的玻碳电极,将上述制备得到的电极与2.0μM的DNA探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在4摄氏度下滴涂孵育12个小时后,与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时,封闭未结合的活性位点,得到工作电极MCH/DNA/Ti3C2-Au/GCE。
(2)连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体的制备
AuNPs胶体是由柠檬酸钠还原HAuCl4而合成的,具体方法如下:
在回流和剧烈搅拌下煮沸100mL的HAuCl4(0.01%)溶液。然后快速向沸腾的溶液中加入2.5mL柠檬酸三钠(1%),搅拌20min,当反应溶液颜色变为酒红色时,即成功制得AuNPs。
连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体制备方法如下:
取1mL上述制备得到的AuNPs胶体,加入100μL浓度为10μM的G4-DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液),在4摄氏度下反应16小时后,加入含0.1M NaCl的10mM pH7.0 PBS缓冲溶液老化24小时,然后离心洗涤后收集沉淀,加入10mM pH7.4的PBS缓冲溶液,得到连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体。本实施例制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs的透射电子显微镜图如图2中的B所示。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2-Au修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系,其中对电极为铂丝电极,参比电极为Ag/AgCl,构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
将人血清用PBS缓冲溶液稀释五十倍后,加入microRNA-377,分别制备得到浓度为0.1,10,1000fM的microRNA-377人血清样品。
工作电极与与上述制备得到浓度为0.1,10,1000fM的microRNA-377人血清样品在37摄氏度下孵育1小时,然后与连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体在37摄氏度下孵育1小时,最后与含有50mM KCl的25μM MB溶液60分钟。
打开电化学工作站,于室温下进行电化学实验,在10mM PBS缓冲溶液中进行,采用方波伏安法进行测试,电压范围是(-0.5)-(-0.1)V。
本实施例制备的基于Ti3C2-Au复合纳米材料的microRNA电化学生物传感器,在实际人血清样品中进行,结果如表3所示,结果表明本实施例制备的生物传感器可以在临床分析中检测应用。
表3
需要说明的是以上实例只是对本发明做了示例性的描述,并非对本发明的范围进行限定,在上述基础上做出的任何简单的变形,修改或者同等替换均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器及其制备方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctttgtgtga ttac 14
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtacaaaag ttgcataggg agggagggag ggtc 34
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aucacacaaa ggcaacuuuu gu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
auaacacaaa ggcaacuuuu gu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
auaacacaga ggcaacauuu gu 22
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uuguacuaca caaaaguacu g 21
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uagcuuauca gacugauguu ga 22
Claims (8)
1.一种基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器在microRNA检测中的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(A)向工作电极滴涂已知浓度的miRNA溶液,在35-40摄氏度恒温孵育60-90分钟;然后与连接有G4-DNA信号探针的AuNPs溶液35-40摄氏度恒温孵育60-90分钟;接着与含有KCl的MB溶液室温下孵育60-90分钟;
(B)打开电化学工作站,将步骤(A)所得传感器于室温下在电化学工作站三电极系统采用方波伏安法进行检测;重复检测多组不同浓度的miRNA标准溶液,根据microRNA标准溶液的电流变化作标准曲线,建立浓度梯度谱线;
(C)向工作电极滴涂待测microRNA溶液,用步骤(A)和步骤(B)相同的条件在电化学工作站三电极系统中采用方波伏安法进行检测,根据步骤(B)所述浓度梯度谱线计算待测液中的miRNA浓度;
所述基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器包括工作电极和连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体;所述工作电极为Ti3C2-Au复合纳米材料和DNA探针依次沉积在玻碳电极上;所述基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器还包括含有KCl的MB溶液;
所述Ti3C2-Au复合纳米材料的制备方法为:
(1)将氟化锂分散到盐酸溶液中,搅拌处理;然后加入Ti3AlC2粉末,搅拌刻蚀;离心、洗涤至pH接近中性后,在保护气氛下超声,离心后取上清液冻干,制得Ti3C2纳米片粉末;
(2)将步骤(1)制得的Ti3C2纳米片粉末分散到去离子水中,超声处理,得到Ti3C2悬浮液;
(3)将HAuCl4溶液滴入到步骤(2)制得的Ti3C2悬浮液,室温下反应,离心洗涤后冻干,得到Ti3C2-Au复合纳米材料。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,
所述DNA探针的序列为:5′-CTTTGTGTGATTAC-(CH2)6-SH-3′;
所述G4-DNA信号探针的序列为:
5′-SH-(CH2)6-CGTACAAAAGTTGCATAGGGAGGGAGGGAGGGTC-3′。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器,还包括参比电极、对电极;所述参比电极为Ag/AgCl,所述对电极为金属铂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(1)所述氟化锂与盐酸溶液的质量体积比为1.0-2.0g:20-40mL;所述氟化锂与Ti3AlC2粉末的质量比为1:1-1:2;
步骤(1)所述搅拌处理的温度为35-45℃,时间为30-50分钟;所述搅拌刻蚀的时间为24-36h;所述保护气氛为氩气,所述超声的时间为1-1.5h;
步骤(2)所述Ti3C2纳米材料粉末分散在去离子水中配成1-1.5mg/mL的悬浮液;步骤(2)所述超声处理的时间为30-50分钟;
步骤(3)所述HAuCl4溶液的浓度为10-15mM;所述反应的时间为30-40分钟。
5.权利要求1-4任一项所述的应用,其特征在于,所述基于Ti3C2-Au的microRNA电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤:
(1)将Ti3C2-Au复合纳米材料分散到去离子水中,超声处理,得到Ti3C2-Au悬浮液;
(2)将所述Ti3C2-Au悬浮液滴涂在玻碳电极表面,制得Ti3C2-Au/GCE;
(3)将DNA探针溶液滴涂到Ti3C2-Au/GCE表面,在2-4摄氏度下孵育12-16小时,然后与封闭剂MCH孵育40-60分钟,制得工作电极MCH/DNA/Ti3C2-Au/GCE;
(4)将G4-DNA信号探针溶液加入到AuNPs溶液中反应12-16小时后,加入含0.1-0.15MNaCl的10-20mM的PBS缓冲溶液老化24-36小时,然后离心洗涤后收集沉淀,加入10-20M的PBS缓冲溶液,得到连接有G4-DNA信号探针的AuNPs胶体。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,步骤(1)中所述Ti3C2-Au悬浮液是将Ti3C2-Au粉末分散在去离子水中配成1-1.5mg/mL的悬浮液;步骤(1)所述超声处理的时间为30-50分钟;
步骤(2)所述玻碳电极在使用前要对其表面进行打磨:将玻碳电极在氧化铝浆中打磨至镜面,然后依次在去离子水、乙醇、去离子水中超声处理5-10分钟以除去表面残留的氧化铝颗粒;
步骤(3)中,所述DNA探针溶液的浓度为2.0-2.5μM;所述封闭剂MCH溶液的浓度为1-2mM;
步骤(4)中,所述PBS缓冲溶液pH为7.0-8.0。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(A)中,每次孵育结束后,工作电极用pH7.0-8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,以分别除去未吸附的miRNA、连接有G4-DNA信号探针的AuNPs和MB。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤(B)中方波伏安法的电压范围是(-0.5)-(-0.1)V。
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