CN111172246B - 基于dna步移和滚环扩增信号放大的电化学核酸检测方法 - Google Patents

基于dna步移和滚环扩增信号放大的电化学核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本案涉及一种基于DNA步移和滚环扩增信号放大的电化学核酸检测方法，包括设计两个DNA四面体：DNA walker和DNA track；将它们固定于电极表面；在待测样品中加入padlock探针，随后将电极插入到待测样品中孵育；向待测样品中继续加入DNA连接酶和DNA聚合酶反应；取出电极，在室温下浸入Pb2+中反应，最后与银纳米颗粒孵育；将电极作为工作电极，使用电化学工作站，采用三电极系统记录线性伏安扫描曲线，通过检测伏安电流信号的变化，计算出目标核酸的浓度。本案的检测方法灵敏度高，选择性高，操作简便，检测成本低。

Description

基于DNA步移和滚环扩增信号放大的电化学核酸检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，特别涉及一种基于DNA步移(DNA walking)和滚环扩增信号放大的电化学核酸检测方法。
背景技术
核酸是遗传信息的携带者和基因表达的物质基础，是生命科学和临床医学的研究重点。核酸检测技术已应用到基础研究、药物筛选、环境监测等多个领域。传统的核酸检测方法包括凝胶电泳、聚合酶链式反应(PCR)等，但在实际应用中仍存在一些不足。例如凝胶电泳染色的染料毒性大，PCR容易出现非特异扩增、假阳性高。近年来基于其他技术发展出一系列的核酸传感方法，包括荧光传感器、比色传感器、拉曼传感器等。但仍存在灵敏度不足，检测成本高，操作不便等问题。因此需要发展新型的操作简便、快速灵敏的核酸分析方法。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种基于DNA步移和滚环扩增信号放大的电化学核酸检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种核酸检测方法，用于对待测样品中的目标核酸进行定量检测，包括：
1)设计两个DNA四面体：DNA walker和DNA track；将该DNA walker和DNA track固定于电极表面；
2)在待测样品中加入padlock探针，随后将所述电极插入到待测样品中孵育；向待测样品中继续加入DNA连接酶和DNA聚合酶，于37℃下反应；
3)从待测样品中取出所述电极，将所述电极在室温下浸入Pb2+中反应，最后再与银纳米颗粒孵育；
4)将所述电极作为工作电极，使用电化学工作站，采用三电极系统记录线性伏安扫描曲线，通过检测伏安电流信号的变化，计算出目标核酸的浓度。
优选的是，所述的核酸检测方法，其中，所述目标核酸的序列为：GCTAGAGATTTTCCACACTGACT。
优选的是，所述的核酸检测方法，其中，所述DNA track由探针A1、探针B、探针C和探针D四条序列组装而成；其中，
探针A1：NH2-AGTAAGGrATCACGGTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA；
探针B：SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
探针C：SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
探针D：SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。
优选的是，所述的核酸检测方法，其中，所述DNA walker由探针A2、探针B、探针C和探针D四条序列组装而成；其中，
探针A2：ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAGTAAGAGGCTCAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCGGCCGAGCCTCTTACT；
探针B：SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
探针C：SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
探针D：SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。
优选的是，所述的核酸检测方法，其中，所述padlock探针的序列为：GCTCGGCCAGCTTTCACGGAGTAAGAG。
本发明的有益效果是：本发明结合了DNA walking及滚环扩增，发展出一种新型的DNA电化学检测方法；DNA walking是一类特定DNA结构在链置换或酶催化反应驱动下沿特定轨道定向移动的DNA纳米机器，一般由轨道组件、步行组件和驱动组件所构成；滚环扩增是一种恒温核酸扩增方法，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段；通过目标核酸杂交引发的DNA结构变化生成滚环扩增引物，从而在酶催化反应下得到扩增产物；该扩增产物中的重复序列与电极表面的大量DNA单链序列可形成DNAzyme结构，从而催化酶切，改变电化学信号强度；最终通过比较信号的减弱程度，实现对目标核酸的高灵敏定量检测。此检测方法灵敏度高，操作简便，检测成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本案的核酸检测方法的原理示意图。
图2为本案验证DNA四面体组装的凝胶电泳图。
图3为不同浓度目标核酸触发反应后得到的线性伏安扫描曲线图。
图4为本案检测方法的选择性比较图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例：以GCTAGAGATTTTCCACACTGACT作为目标核酸为例，本实施例涉及的DNA序列如表1：
表1 DNA序列
Figure BDA0002363815520000041
本案的检测原理如图1所示：首先合成了银纳米颗粒作为电化学信号探针，可以标记在末端修饰有氨基的DNA链上。然后分别组装两种DNA四面体(DNA walker，DNA track)，按照一定浓度比例固定于金电极表面。这类四面体结构的DNA不仅提高了DNA walking的分子识别效率，而且避免了电极表面修饰普遍需要的间隔分子，如：巯基己醇。DNA track上标记的氨基可以与银纳米颗粒通过银-氨键反应，从而将银纳米颗粒定位在电极的界面上，可得到较高的溶出电流峰。
当待测样品中存在目标核酸时，目标核酸可以打开DNA walker顶端的颈环结构，游离出滚环扩增的单链引物序列，再加入padlock序列孵育，在DNA连接酶(ligase)和DNA聚合酶(phi29)存在的条件下，得到滚环扩增产物；而该滚环扩增产物的大量重复序列可以在Pb2+的帮助下与DNA track顶端单链序列构成DNAzyme结构，同步发生酶切反应(游离出电极表面的单链DNA部分包含有氨基)，而滚环扩增产物可以得以释放，并与其他完整的DNAtrack继续反应，最终电极表面的氨基基团大量损失，从而固定银纳米颗粒的能力大大降低，通过检测降低的溶出伏安电流信号，可以推算出目标核酸的浓度值。
具体操作为：
(1)银纳米颗粒的合成：通过硼氢化钠(NaBH4)还原银离子合成银纳米颗粒。首先制备了浓度为0.25mM的硝酸银(AgNO3)和0.25mM柠檬酸三钠混合溶液。随后，制备浓度为10mM的NaBH4溶液。接着，在剧烈搅拌的条件下将3mL的NaBH4溶液添加到100mL的AgNO3和柠檬酸三钠混合溶液中。反应0.5小时后，将制备的银纳米颗粒静置24小时，随后以12000g的转速离心20分钟，去上清重悬银纳米颗粒，重复三次。
(2)DNA四面体的组装及电极修饰：电极为金电极，其处理采用常规方式进行。配制含有10mM TCEP和50mM MgCl2的10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液，用于分别溶解DNA探针链。将浓度分别为4μM的四个DNA探针链(探针B，C，D和探针A1或A2)等比例混合，加热到95℃反应5min后，缓慢降温到室温，形成四面体DNA。含有探针A1的DNA四面体为DNAtrack，含有探针A2的DNA四面体为DNA walker。然后将处理后的金电极与混合的DNA四面体溶液(DNAtrack,1μM；DNA walker,0.03μM)孵育8小时。
(3)目标核酸定量分析：制备不同浓度的目标核酸标准品，然后将其与1μMpadlock探针混合。然后将DNA四面体修饰的电极与上述混合物孵育1小时。接下来，将其用T4DNA连接酶(6U/mL，50mM Tris-HCl，10mMMgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)在37℃下处理0.5h。之后，用phi29DNA聚合酶(50U/mL，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mMDTT，0.2mg/mL BSA，0.5mM dNTPs)在37℃下进一步处理1h。随后，清洗电极，再将电极在室温下浸入20μM Pb2+中1h。最后，再次清洗电极并与银纳米颗粒孵育15分钟。
(4)电化学检测：采用CHI660D型电化学工作站，采用三电极系统(铂丝对电极、Ag/AgCl参比电极、金工作电极)，记录线性伏安扫描曲线。电解液为0.1M KCl，扫速为100mV/s。
如图2所示，其为组装DNA四面体的凝胶电泳图，从左往右的条带分别为不同DNA序列杂交的产物(探针B,探针B/C,探针B/C/D,探针B/C/D/A1,探针B/C/D/A2)。通过比较DNA条带的大小，可以看出DNA四面体逐步组装成功。
如图3所示，图3为不同浓度目标核酸触发反应后得到的线性伏安扫描曲线(从左往右10-16,10-15,10-13,10-11,10-10,10-9,10-8,10-7,10-6M)，内嵌图为目标核酸浓度对数值与伏安峰值的线性关系。由图3可知，随着待测样本中，目标核酸浓度的增加，电极表面滚环扩增产物的量也随之增加，从而形成的DNAzyme更多，能够在同等时间切割更多的DNA track，从而电极表面固定的银纳米颗粒越少，峰值越小。所得的线性伏安扫描曲线与预测相符，且峰电流与目标核酸浓度的对数值在10-16到10-7范围内呈良好的线性关系。
将与目标核酸序列存在错配的四条序列(mismatch 1、mismatch 2、mismatch 3和mismatch 4)引入检测体系，通过检测最终的线性伏安扫描曲线可知，得到的峰电流与对照实验相当，而只有在目标核酸存在条件下，峰电流才会发生明显下降(如图4所示)，这一结果证实了本案的核酸检测方法的高度选择性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
发明名称：基于DNA步移和滚环扩增信号放大的电化学核酸检测方法
申请人名称：天津国科医工科技发展有限公司、济南国科医工科技发展有限公司
序列名称 序列 (5’ to 3’)
目标核酸 GCTAGAGATTTTCCACACTGACT
探针A1 NH2-AGTAAGGrATCACGGTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA
探针A2 ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAGTAAGAGGCTCAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCGGCCGAGCCTCTTACT
探针B SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC
探针C SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC
探针D SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT
padlock GCTCGGCCAGCTTTCACGGAGTAAGAG
mismatch 1 GTTAGAGATTTTCCACACTGACT
mismatch 2 GCTAGAGATTTTCCACACTGAGT
mismatch 3 GCTAGAGATTTACCACACTGAGT
mismatch 4 GCTAGAGATGTTCCACACTGACT

Claims (2)

1.一种用于非疾病诊断和治疗的核酸检测方法，用于对待测样品中的目标核酸进行定量检测，其特征在于，包括：
1）设计两个DNA四面体：DNA walker和DNA track；将该DNA walker和DNA track固定于电极表面；
2）在待测样品中加入padlock探针，随后将所述电极插入到待测样品中孵育；向待测样品中继续加入DNA连接酶和DNA聚合酶，于37℃下反应；
3）从待测样品中取出所述电极，将所述电极在室温下浸入Pb2+中反应，最后再与银纳米颗粒孵育；
4）将所述电极作为工作电极，使用电化学工作站，采用三电极系统记录线性伏安扫描曲线，通过检测伏安电流信号的变化，计算出目标核酸的浓度；
所述DNA track由探针A1、探针B、探针C和探针D四条序列组装而成；其中，
探针A1：NH2-AGTAAGGrATCACGGTTTTTTACATTCCTAAGTCTGAA ACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA；
探针B：SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAG ATGCGAGGGTCCAATAC；
探针C：SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATC TACTATGGCGGCTCTTC；
探针D：SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTT GTATTGGACCCTCGCAT；
所述DNA walker由探针A2、探针B、探针C和探针D四条序列组装而成；其中，
探针A2：ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGA AGAGCCGCCATAGTATTTAGTAAGAGGCTCAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCGGCCGAGCCTCTTACT；
探针B：SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAG ATGCGAGGGTCCAATAC；
探针C：SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATC TACTATGGCGGCTCTTC；
探针D：SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTT GTATTGGACCCTCGCAT；
所述padlock探针的序列为：GCTCGGCCAGCTTTCACGGAGTAAGAG。
2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述目标核酸的序列为：GCTAGAGATTTTCCACACTGACT。
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