CN114410750A - 基于环状双足dna步行策略的核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒，该试剂盒包括Probe A、Probe B、Probe D、Probe E、聚合酶、切刻内切酶、辅酶因子、Tris‑HCl、EDTA、TCEP、NaCl、巯基己醇、磷酸缓冲液、dNTPs以及NEB buffer 2.1。本发明提供的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒，构建了可再生的DNA修饰金电极界面，通过茎环结构与哑铃结构DNA在目标核酸与相关酶催化反应下构建的环状DNA结构，能进行电极界面的双足步行反应，可实现目标核酸的超灵敏定量分析，检测限能够达到2.2aM，且具有高选择性特点，能很好的应用于核酸分析检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒。
背景技术
核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，特定序列的核酸片段可以作为指示相应生物物种或生理病理状态的标记物。目前最常用的核酸检测方法为荧光定量PCR，可直接用于DNA的检测。若待测对象为RNA，则需将其先逆转录为DNA，然后进行扩增及后续的检测。一般而言，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。尽管该技术相对成熟，但PCR反应需要独立的实验环境，耗时长，成本相对较高。因此，开发能够提高效率、简化流程的新型核酸分析方案能够对生物医学研究及应用起到积极推动作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，该方法为：
提供单链DNA探针Probe A以及末端修饰有电信号分子的茎环结构探针Probe B，Probe A修饰在电极表面，Probe B通过Hoogsteen作用结合于Probe A上从而也修饰在该电极表面；
提供茎环结构的探针Probe E，Probe E可以被目标核酸打开，并形成一个长茎小环的新型茎环结构，在聚合酶作用下该新型茎环结构与目标核酸发生链置换反应，取代目标核酸，形成的双链DNA拥有切刻内切酶位点，在聚合酶和切刻内切酶的共同酶促反应下产生更多的与目标核酸的序列相同的单链DNA；
提供哑铃型探针Probe D，Probe D上具有Probe C序列；与目标核酸的序列相同的单链DNA能够通过杂交反应打开哑铃型探针Probe D，使Probe D上游离的5’端与3’端序列通过杂交生成环状DNA，该环状DNA两端的单链区域Probe C作为双足步行器的walker序列，与修饰于电极表面的Probe B作用构成DNAzyme结构，在辅酶因子作用下发生切割反应，使得电极的电化学信号强度降低，通过电化学信号强度的变化分析得到目标核酸的浓度。
优选的是，所述电极为金电极，Probe A通过金-巯键修饰在该金电极表面。
优选的是，其中，通过调节溶液的pH值对Probe B与Probe A的结合与分离进行控制。
优选的是，该方法具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理；
2)金电极表面核酸修饰：在金电极表面修饰Probe A，然后将Probe B结合在ProbeA上，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：将待测核酸样本与Probe E、聚合酶、切刻内切酶混合孵育，然后加热使聚合酶、切刻内切酶失活；再加入Probe D和辅酶因子，充分混合，将得到的溶液滴加到修饰有Probe A和Probe B的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
优选的是，所述聚合酶为Klenow fragment，所述切刻内切酶为Nb.BbvCI，辅酶因子为镁离子。
优选的是，该方法具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理；
2)金电极表面核酸修饰：
按照以下配方配制电极固定液：Tris-HCl、EDTA、TCEP、NaCl，pH＝7.4；使用电极固定液稀释Probe A，得到混合液1；将Probe B使用磷酸缓冲液稀释，得到混合液2；
将表面预处理后的金电极插入混合液1中，于室温下反应，随后将金电极冲洗干净后置于巯基己醇中反应；再将金电极插入混合液2中，于室温下反应，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：
将待测核酸样本使用磷酸缓冲液稀释，然后与Probe E、Klenow fragment、Nb.BbvCI、dNTPs、NEB buffer 2.1混合，37℃下孵育，然后加热使Klenow fragment、Nb.BbvCI失活，得到混合液3；
将混合液3与Probe D、镁离子充分混合，将得到的溶液滴加到修饰Probe A和Probe B的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
优选的是，该方法具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理：
首先将金电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，取出使用双蒸水冲洗干净；接着在3000和5000目的砂纸上依次打磨金电极，随后使用铝浆继续打磨电极至镜面光滑的程度，使用双蒸水冲洗干净；将打磨后的电极依次置于无水乙醇和超纯水中各超声5分钟，再进行电化学清洗，最后使用双蒸水清洗并用氮气吹干待用；
2)金电极表面核酸修饰：
按照以下配方配制电极固定液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、10mM TCEP、0.1MNaCl，pH＝7.4；使用电极固定液稀释Probe A至浓度为0.8μM，得到混合液1；将Probe B使用10mM的磷酸缓冲液稀释成1μM的浓度，得到混合液2；
将表面预处理后的金电极插入混合液1中，于室温下反应8小时，随后将金电极冲洗干净后置于巯基己醇中反应0.5小时；再将金电极插入混合液2中，于室温下反应1小时，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：
将待测核酸样本使用10mM的磷酸缓冲液稀释成1μM的浓度，然后将50μL待测核酸样本与10μL Probe E、2μL Klenow fragment、3μL Nb.BbvCI、25μL dNTPs、10μL 10×NEBbuffer 2.1混合，37℃下孵育2小时，然后加热到80℃，维持20分钟使Klenow fragment、Nb.BbvCI失活，得到混合液3；
将混合液3与浓度为1.5μM的Probe D、30mM的镁离子充分混合，将得到的溶液滴加到修饰Probe A和Probe B的金电极表面，常温孵育15分钟后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
优选的是，其中，目标核酸的序列为：
5’-GTTGGAGCTAGTGGCGTAG-3’；
Probe A的序列为：5’-SH-(CH2)6-TTTTCCTTCCCTTTCCCTCCTCCC-3’；
Probe B的序列为：
5’-MB-TTTTATCGACGAAGAAAAGTCCAACCTAT/rA/GGAAGAGATCAGCTTCGTCGATCCCTCCTCCCTTTCCCTTCCAACTAGGAAGGGAAAGGGAGGAGGG-3’；
Probe C的序列为：5’-TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTT-3’；
Probe D的序列为：
5’-TCCAACGGCGTAGTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTCTACGCCACTAGCTCCAACTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTGTTGGA-3’；
Probe E的序列为：
5’-CTACGCCACTAGCTCCAACTCCTCAGCGCGTAGGTACTAAGTTGGAGCTAGTGATCCTACGC-3’。
本发明还提供一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测试剂盒，包括如上所述的Probe A、Probe B、Probe D、Probe E、聚合酶、切刻内切酶以及辅酶因子。
优选的是，该基于环状双足DNA步行策略的核酸检测试剂盒还包括Tris-HCl、EDTA、TCEP、NaCl、巯基己醇、磷酸缓冲液、dNTPs以及NEB buffer 2.1。
本发明的有益效果是：本发明提供的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒，构建了可再生的DNA修饰金电极界面，通过茎环结构与哑铃结构DNA在目标核酸与相关酶催化反应下构建的环状DNA结构，能进行电极界面的双足步行反应，可实现目标核酸的超灵敏定量分析，检测限能够达到2.2aM，且具有高选择性特点，能很好的应用于核酸分析检测。
附图说明
图1为本发明的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法的原理示意图；
图2-3为本发明的实施例2中通过电化学交流阻抗及循环伏安图表征电极表面在各步反应后的各项阻抗性质的结果；
图4A为本发明的实施例2中检测不同浓度ctDNA得到的方波伏安曲线，图4B为电化学信号强度变化差值与ctDNA对数浓度的关系曲线图，图4C为错配ctDNA分子与目标ctDNA分子触发反应后的电化学信号强度差值比较结果，4D为本发明的方法与qRT-PCR对相同样本进行检测的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例提供一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，参照图1，该方法的原理为：
提供单链DNA探针Probe A以及末端修饰有电信号分子的茎环结构探针Probe B，Probe A修饰在电极表面，Probe B通过Hoogsteen作用结合于Probe A上从而也修饰在该电极表面；由于Probe B末端修饰有电信号分子，能够给出较强的电化学信号；其中，通过调节溶液的pH值对Probe B与Probe A的结合与分离进行控制；
提供茎环结构的探针Probe E，Probe E可以被目标核酸打开，并形成一个长茎小环的新型茎环结构，在聚合酶作用下该新型茎环结构与目标核酸发生链置换反应，取代目标核酸，形成的双链DNA拥有切刻内切酶位点，在聚合酶和切刻内切酶的共同酶促反应下产生大量的与目标核酸的序列相同的单链DNA；
提供哑铃型探针Probe D，Probe D上具有Probe C序列；与目标核酸的序列相同的单链DNA能够通过杂交反应打开哑铃型探针Probe D，使Probe D上游离的5’端与3’端序列通过杂交生成环状DNA，该环状DNA两端的单链区域Probe C作为双足步行器的walker序列，与修饰于电极表面的Probe B作用构成DNAzyme结构，在辅酶因子作用下发生切割反应，使得电极的电化学信号强度大幅度降低，通过电化学信号强度的变化分析得到目标核酸的浓度。
在优选的实施例中，电极为金电极，Probe A通过金-巯键修饰在该金电极表面。
本实施例中，该方法具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理；
2)金电极表面核酸修饰：在金电极表面修饰Probe A，然后将Probe B结合在ProbeA上，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：将待测核酸样本与Probe E、聚合酶、切刻内切酶混合孵育，然后加热使聚合酶、切刻内切酶失活；再加入Probe D和辅酶因子，充分混合，将得到的溶液滴加到修饰有Probe A和Probe B的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
在优选的实施例中，聚合酶为Klenow fragment，切刻内切酶为Nb.BbvCI，辅酶因子为镁离子。
实施例2
以实施例1为基础，本实施例以具体序列的目标核酸为例对本发明进行进一步说明。
本实施例中涉及的DNA序列如下表：
表1 DNA与RNA序列
其中，Probe T为目标核酸序列，ctM1-ctM6为错配序列，下划线部分为错配碱基。
本实施例中的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理：
首先将金电极浸泡在水虎鱼溶液(98％浓硫酸与30％过氧化氢比例为3：1)中5分钟，取出使用双蒸水冲洗干净；接着在3000和5000目的砂纸上依次打磨金电极，随后使用铝浆(1.0、0.3、0.05μm)继续打磨电极至镜面光滑的程度，使用双蒸水冲洗干净；将打磨后的电极依次置于无水乙醇和超纯水中各超声5分钟，再进行电化学清洗(在0.5M硫酸电解液中循环扫描20圈)，最后使用双蒸水清洗并用氮气吹干待用；
2)金电极表面核酸修饰：
按照以下配方配制电极固定液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、10mM TCEP、0.1MNaCl，pH＝7.4；使用电极固定液稀释Probe A至浓度为0.8μM，得到混合液1；将Probe B使用10mM的磷酸缓冲液(250mM NaCl,pH 7.4)稀释成1μM的浓度，得到混合液2；
将表面预处理后的金电极插入混合液1中，于室温下反应8小时，随后将金电极冲洗干净后置于巯基己醇中反应0.5小时；再将金电极插入混合液2中，于室温下反应1小时，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：
将待测核酸样本使用10mM的磷酸缓冲液稀释成1μM的浓度，然后将50μL待测核酸样本与10μL Probe E、2μL Klenow fragment、3μL Nb.BbvCI、25μL dNTPs、10μL 10×NEBbuffer 2.1混合，37℃下孵育2小时，然后加热到80℃，维持20分钟使Klenow fragment、Nb.BbvCI失活，得到混合液3；
将混合液3与浓度为1.5μM的Probe D、30mM的镁离子充分混合，将得到的溶液滴加到修饰Probe A和Probe B的金电极表面，常温孵育15分钟后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
本实施例中，电化学检测采用CHI660D电化学工作站进行电化学信号的测量。电化学体系中包含铂对电极、饱和甘汞参比电极及金工作电极。循环伏安参数：0.55到-0.2V扫描范围，50mV/s扫描速度；交流阻抗参数：振幅5mV，频率范围0.1Hz到100000Hz；方波伏安参数：振幅25mV，步进4mV，频率50Hz，扫描范围0.05到-0.65V。循环伏安法与交流阻抗法的电解液为5mM铁氰化钾；方波伏安法的电解液为20mM Tris-HCl(pH7.45)。
本实施例中，通过电化学交流阻抗及循环伏安图表征电极表面在各步反应后的各项阻抗性质。参照图2，2(A)交流阻抗图：裸电极(bare electrode)，修饰有Probe A的电极(Probe A)，修饰有Probe A及B杂交体的电极(Probe A/B)，进一步通过控制pH条件后的电极(reset)。(B)修饰有Probe A及B杂交体的电极在调节pH值之后的阻抗数值。(C)方波伏安曲线：裸电极，修饰有Probe A的电极，修饰有Probe A及B杂交体的电极，进一步通过控制pH条件后的电极(regeneration)。(D)修饰有Probe A及B杂交体的电极在调节pH值之后的方波伏安电流值。
如图2A所示，裸电极的交流阻抗表现为直线区域，证明金电极具有良好的导电性能；在修饰了Probe A后，出现一个的半圆区(该区域的直径与阻抗值呈正相关)，这是由于同样带负电的DNA骨架排斥电信号分子，证实了通过金-巯键的反应将Probe A的有效固定于电极表面；修饰Probe B后，半圆区的直径进一步加大，证实Probe B通过与Probe A的相互作用也固定在电极表面；进一步调节pH值后，Probe B与Probe A发生解链，脱离电极表面，从而使得阻抗值基本恢复为Probe A修饰电极的程度，证实了通过该方法可以自由控制电极表面Probe A与Probe A/B的组装。本实施例中通过多次调节pH，并计算阻抗值(Rct)的方式进行研究电极的多次复用性能，如图2B所示，阻抗值在多次调节pH后基本保持与初次修饰的数值相当，证实通过反复调节pH的方式能够重复使用电极。由于Probe B末端修饰有亚甲基蓝(MB)，本实施例中通过测量MB的方波伏安曲线峰电流的方式进一步验证pH调节法的效果，首次调节的方波伏安曲线如图2C所示，多次调节后的电流值总结于图2D中，这些结果再一次证实了通过调节pH值，可有效改变电极表面的DNA修饰状态，且多次反应后仍保持较好的稳定数值。
本实施例中，还通过电化学交流阻抗及循环伏安图表征电极表面在各部反应后的各项性质。参照图3，3(A)交流阻抗图：修饰Probe A和Probe B的电极(Probe A/B)，修饰有Probe A和Probe B、Probe C杂交体的电极(Probe A/B/C)，修饰有Probe A和Probe B、Probe C杂交体的电极进一步与Mg2+作用(Probe A/B/C+Mg)，修饰Probe A和Probe B的电极与Probe D、目标核酸Probe T作用(Probe A/B+Probe D/T)，修饰Probe A和Probe B的电极与Probe D、目标核酸Probe T、Mg2+作用(Probe A/B+Probe D/T+Mg)。3(B)循环伏安图；3(C)方波伏安曲线中MB的电流峰；3(D)不同金属离子作为辅酶因子的效果。
如图3A所示，直接将Probe A/B修饰后的电极与Probe C反应后，能够增大阻抗值(半圆区直径增大)，证明Probe C能够打开Probe B的茎环结构，从而固定于电极表面。而后续加入的Mg2+，引起了阻抗值的降低，这是由于Probe B/C所形成的DNAzyme结构在辅酶因子Mg2+作用下，发挥酶切反应，将Probe B切断，从而降低了阻抗值；同样的，Probe D在目标核酸序列作用下能够形成环状结构DNA，包含的两段单链区域均为Probe C序列，因此能够固定于电极表面的Probe B阵列上，加大了阻抗值，而后续加入的Mg2+同样行使辅酶因子的作用，将Probe B切断的同时，使得Probe D/T游离于电极表面外，从而使得阻抗值降低。通过循环伏安图中的峰电流同样可以表征阻抗值的大小，本实施例中测量到的循环伏安图峰电流的变化趋势与阻抗图的趋势一致(图3B),进一步表明反应步骤的有序发生。本实施例中通过方波伏安曲线中MB的电流峰来验证Probe B的切割过程，如图3C所示，在加入Mg2+之后，峰电流的下降说明发生了有效的酶切反应。此外，本实施例中验证了不同金属离子作为辅酶因子的效果，如图3D所示，在引入Ca2+,Cd2+,Cu2+,Mn2+后，峰电流均无明显变化，证明只有Mg2+能过作为辅酶因子协助DNAzyme催化反应。
本实施例中，测试了不同浓度目标核酸引发的亚甲基蓝电流变化趋势，如图4A所示，检测不同浓度ctDNA得到的方波伏安曲线,(0，10aM,20aM,50aM,100aM,500aM,1fM,5fM,10fM,50fM,100fM,1pM,10pM)；可以看出，随着浓度的增加，亚甲基蓝的电化学信号强度逐渐降低(图4A中箭头所示处，由下至上代表的曲线的浓度依次增加)。图4B电化学信号强度变化差值与ctDNA对数浓度的关系曲线图；电化学信号强度变化差值与目标核酸对数浓度值呈线性相关，且线性区间较宽(10-17到10-13M)，据此即可建立得到表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线。
本实施例中，通过电化学信号强度比较验证了本发明的检测方法的选择性，图4C为错配ctDNA分子与目标ctDNA分子触发反应后的电化学信号强度差值比较，通过引入6种错配序列进行实验并比较相应的方波伏安曲线峰电流值，可看出错配序列基本无法引起峰值的较大变化，证实了该方法的高选择性。图4C中的“DNA”表示利用该体系对单独的ctDNA或其他错配序列进行分析；“spiked with Target”表示利用该体系对相应错配序列中加入目标ctDNA的混合物进行分析。
本实施例中，还将本发明的方法与PCR技术进行了对标比较，如图4D为本发明的方法与qRT-PCR对相同样本进行检测的结果，可以看出，两种方法的结果一致性较高，证实了本发明的方法具有较好的实用性。
实施例3
本实施例提供一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测试剂盒，包括实施例1或2中的Probe A、Probe B、Probe D、Probe E、聚合酶、切刻内切酶和辅酶因子。进一步优选的实施例中还包括Tris-HCl、EDTA、TCEP、NaCl、巯基己醇、磷酸缓冲液、dNTPs以及NEB buffer2.1等试剂。利用本实施例的核酸检测试剂盒，基于实施例1或2中的方法，结合电化学检测能够实现核酸浓度的检测。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
发明名称：基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒
序号 名称 序列 (5’ to 3’)
SEQ ID No. 1 Probe A SH-(CH2)6-TTTTCCTTCCCTTTCCCTCCTCCC
SEQ ID No. 2 Probe B MB-TTTTATCGACGAAGAAAAGTCCAACCTAT/rA/GGAAGAGATCAGCTTCGTCGATCCCTCCTCCCTTTCCCTTCCAACTAGGAAGGGAAAGGGAGGAGGG
SEQ ID No. 3 Probe C TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTT
SEQ ID No. 4 Probe D TCCAACGGCGTAGTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTCTACGCCACTAGCTCCAACTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTGTTGGA
SEQ ID No. 5 Probe E CTACGCCACTAGCTCCAACTCCTCAGCGCGTAGGTACTAAGTTGGAGCTAGTGATCCTACGC
SEQ ID No. 6 Probe T GTTGGAGCTAGTGGCGTAG
SEQ ID No. 7 ctM1 GTTGGAGCTAGTGGATCAG
SEQ ID No. 8 ctM2 GTTGACACTAGTGGCGTAG
SEQ ID No. 9 ctM3 GTTGGAGCGCGTGGCGTAG
SEQ ID No. 10 ctM4 GTTGGAATTAGTGGCGTAG
SEQ ID No. 11 ctM5 GTTGGAGCTAGTAGCGTAG
SEQ ID No. 12 ctM6 GTTGGATCTAGTGGCGTAG
Claims (10)
1.一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法为：
提供单链DNA探针Probe A以及末端修饰有电信号分子的茎环结构探针Probe B，ProbeA修饰在电极表面，Probe B通过Hoogsteen作用结合于Probe A上从而也修饰在该电极表面；
提供茎环结构的探针Probe E，Probe E可以被目标核酸打开，并形成一个长茎小环的新型茎环结构，在聚合酶作用下该新型茎环结构与目标核酸发生链置换反应，取代目标核酸，形成的双链DNA拥有切刻内切酶位点，在聚合酶和切刻内切酶的共同酶促反应下产生更多的与目标核酸的序列相同的单链DNA；
提供哑铃型探针Probe D，Probe D上具有Probe C序列；与目标核酸的序列相同的单链DNA能够通过杂交反应打开哑铃型探针Probe D，使Probe D上游离的5’端与3’端序列通过杂交生成环状DNA，该环状DNA两端的单链区域Probe C作为双足步行器的walker序列，与修饰于电极表面的Probe B作用构成DNAzyme结构，在辅酶因子作用下发生切割反应，使得电极的电化学信号强度降低，通过电化学信号强度的变化分析得到目标核酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，所述电极为金电极，Probe A通过金-巯键修饰在该金电极表面。
3.根据权利要求2所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，其中，通过调节溶液的pH值对Probe B与Probe A的结合与分离进行控制。
4.根据权利要求3所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理；
2)金电极表面核酸修饰：在金电极表面修饰Probe A，然后将Probe B结合在Probe A上，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：将待测核酸样本与Probe E、聚合酶、切刻内切酶混合孵育，然后加热使聚合酶、切刻内切酶失活；再加入Probe D和辅酶因子，充分混合，将得到的溶液滴加到修饰有Probe A和Probe B的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
5.根据权利要求4所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，所述聚合酶为Klenow fragment，所述切刻内切酶为Nb.BbvCI，辅酶因子为镁离子。
6.根据权利要求5所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理；
2)金电极表面核酸修饰：
按照以下配方配制电极固定液：Tris-HCl、EDTA、TCEP、NaCl，pH＝7.4；使用电极固定液稀释Probe A，得到混合液1；将Probe B使用磷酸缓冲液稀释，得到混合液2；
将表面预处理后的金电极插入混合液1中，于室温下反应，随后将金电极冲洗干净后置于巯基己醇中反应；再将金电极插入混合液2中，于室温下反应，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：
将待测核酸样本使用磷酸缓冲液稀释，然后与Probe E、Klenow fragment、Nb.BbvCI、dNTPs、NEB buffer 2.1混合，37℃下孵育，然后加热使Klenow fragment、Nb.BbvCI失活，得到混合液3；
将混合液3与Probe D、镁离子充分混合，将得到的溶液滴加到修饰Probe A和Probe B的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
7.根据权利要求6所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
1)金电极表面预处理：
首先将金电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，取出使用双蒸水冲洗干净；接着在3000和5000目的砂纸上依次打磨金电极，随后使用铝浆继续打磨电极至镜面光滑的程度，使用双蒸水冲洗干净；将打磨后的电极依次置于无水乙醇和超纯水中各超声5分钟，再进行电化学清洗，最后使用双蒸水清洗并用氮气吹干待用；
2)金电极表面核酸修饰：
按照以下配方配制电极固定液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、10mM TCEP、0.1M NaCl，pH＝7.4；使用电极固定液稀释Probe A至浓度为0.8μM，得到混合液1；将Probe B使用10mM的磷酸缓冲液稀释成1μM的浓度，得到混合液2；
将表面预处理后的金电极插入混合液1中，于室温下反应8小时，随后将金电极冲洗干净后置于巯基己醇中反应0.5小时；再将金电极插入混合液2中，于室温下反应1小时，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；
3)核酸定量分析：
将待测核酸样本使用10mM的磷酸缓冲液稀释成1μM的浓度，然后将50μL待测核酸样本与10μL Probe E、2μL Klenow fragment、3μL Nb.BbvCI、25μL dNTPs、10μL 10×NEBbuffer 2.1混合，37℃下孵育2小时，然后加热到80℃，维持20分钟使Klenow fragment、Nb.BbvCI失活，得到混合液3；
将混合液3与浓度为1.5μM的Probe D、30mM的镁离子充分混合，将得到的溶液滴加到修饰Probe A和Probe B的金电极表面，常温孵育15分钟后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。
8.根据权利要求7所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，其中，目标核酸的序列为：5’-GTTGGAGCTAGTGGCGTAG-3’；
Probe A的序列为：5’-SH-(CH2)6-TTTTCCTTCCCTTTCCCTCCTCCC-3’；
Probe B的序列为：
5’-MB-TTTTATCGACGAAGAAAAGTCCAACCTAT/rA/GGAAGAGATCAGCTTCGTCGATCCCTCCTCCCTTTCCCTTCCAACTAGGAAGGGAAAGGGAGGAGGG-3’；
Probe C的序列为：5’-TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTT-3’；
Probe D的序列为：
5’-TCCAACGGCGTAGTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTCTACGCCACTAGCTCCAACTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTGTTGGA-3’；
Probe E的序列为：
5’-CTACGCCACTAGCTCCAACTCCTCAGCGCGTAGGTACTAAGTTGGAGCTAGTGATCCTACGC-3’。
9.一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-8中任意一项所述的Probe A、Probe B、Probe D、Probe E、聚合酶、切刻内切酶以及辅酶因子。
10.根据权利要求9所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括Tris-HCl、EDTA、TCEP、NaCl、巯基己醇、磷酸缓冲液、dNTPs以及NEB buffer 2.1。
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