CN113061649B - 检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法，该传感器的构建主要分为三个部分：SERS标签的组装、基于热电极的DSN辅助目标循环信号放大、SERS基底的组装。本发明将AgNCs与4‑MBA和sDNA相结合以制备SERS标签。并将热电极技术与DSN辅助目标循环信号放大技术相结合，在DSN辅助目标循环信号放大过程中，通过提高电极的温度来提高DSN的活性，从而使得酶切循环过程更为高效彻底。本文的SERS传感器对miRNA‑21的检出限达到2.9 fM（S/N=3），且具有很高的特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法。
背景技术
表面增强拉曼散射（SERS）是一种强大的分析技术，因其超高的灵敏度，窄的光谱带以及在各种环境中的通用性性，广泛用于检测包括小分子，蛋白质和核酸在内的生物标记物。 SERS信号通常可以可通过金，银和铜纳米粒子（如银纳米球，金纳米球和金纳米棒）增强。与球形贵金属纳米粒子相比，银纳米立方体（AgNCs）由于具有其几何特征而提供了更大的电场增强。因此，AgNC非常适合利用这些优势的SERS应用增强的近场。例如，Zhu等。通过在还原的氧化石墨烯板上包裹AgNCs开发出一种SERS传感器，用于高度灵敏地检测二硫代氨基甲酸酯杀虫剂，检测限（LOD）估计为10ppb。但据我们所知，AgNCs迄今尚未用作microRNA（miRNA）检测的SERS底物。
酶辅助信号放大技术由于反应条件温和、生物相容性好和催化效率高等优点而广泛用于生化分析中。常用工具酶包括聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、连接酶等。双链特异性核酸酶（DSN）为一种核酸内切酶，因其对DNA双链体和RNA/DNA异源双链体有极强的切割偏好，对单链DNA，单链RNA和双链RNA的活性较小的特性，而在miRNA的信号放大中突显出巨大的优势。因此人们开发了许多基于DSN信号放大的传感器用于miRNA的检测。如Degliangeli等将荧光标记的DNA探针固定在金纳米颗粒（AuNPs）上。当存在目标miRNA时，DNA-RNA异源双链形成并被DSN识别并剪切，使得荧光基团从AuNPs上释放出来从而检测到荧光信号。目标miRNA重复循环杂交酶切，从而释放出更多的荧光基团，实现信号放大。通过荧光信号的改变来实现对目标miRNA的检测。
1990年代，Gründler等人开发了具有对称结构的直接电加热电极，该电极能够消除加热交流电对电化学信号的干扰，从而导致了加热电极的广泛应用和推广。现已有一系列基于不同材料的加热电极已开发并应用于痕量检测，如用将石墨加热电极用于核黄素的高灵敏检测，将玻碳加热电极用于细胞的高敏感检测。此外，将加热电极与生物酶结合可提高酶活性，从而提高检测灵敏度。例如，Wu等人将加热电极与核酸外切酶III结合使用，可对实现对Hg2+的高灵敏的电化学检测。但是据我们所知，加热电极还没有与双链特异性核酸酶（DSN）相结合，进行DSN辅助的目标循环扩增，并用SERS方法进行miRNA的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，包括如下步骤：
（1） SERS标签AgNCs/4-MBA/sDNA的组装
取10 μM 10 μL巯基修饰的sDNA，加入5 mM 10 μL TCEP，室温避光放置1 h，对二硫键进行还原，然后将其混入80 μL 8nM的AgNCs溶液中，加入300 μL的PBSS溶液混合均匀，37 ℃孵育过夜得到AgNCs/sDNA；接着向溶液中加入1 mM 4 μL的对巯基苯甲酸溶液，继续孵育2 h；然后将溶液离心，去除上清液后重新分散在400 μL的PBSS溶液中，重复离心3次后4℃保存备用；
（2）DSN辅助目标循环信号放大过程；
将金热电极HAuE依次用1 μm和0.05 μm的氧化铝粉在抛光布上进行抛光，然后在超纯水中超声清洗3 min，置于0.5 M NaOH溶液中− 0.35 - 1.35 V电位间连续扫描500圈，接着置于5 mM H2SO4溶液中− 0.35 - 1.5 V电位间扫描20圈，对电极进行电化学清洗，最后用超纯水清洗冲洗，氮气吹干；
在固定pDNA前，将10 μM 5 μL巯基修饰的 pDNA与5 mM 5 μL TCEP混匀室温避光处理1 h以断裂二硫键，然后取10μL滴到清洗干净的金热电极表面，4 ℃组装过夜得到pDNA/HAuE；超纯水冲洗后浸泡在2 mM MCH溶液中，室温封闭1 h得到MCH/pDNA/HAuE，同样用超纯水对电极表面进行清洗；
取179 μL一定浓度的miRNA-21，加入20 μL的10×DSN buffer和0.5 U/μL 1 μLDSN酶配置成总体积为200 μL的酶切液；将MCH/pDNA/HAuE浸泡于酶切液中进行酶切反应60min；酶切温度控制为55 ℃；反应完成后，向酶切液中加入10 mM 50 μL EDTA于55℃恒温反应10 min，对DSN酶进行失活处理，得到所需的含有rDNA的酶切液；
（3）SERS基底的组装及检测
按照上述金热电极HAuE相同的处理方法，对直径为3mm的金电极AuE进行抛光清洗；取10 μM 5 μL巯基修饰的cDNA与5 mM 5 μL TCEP混匀，室温避光孵育1 h；再加入PBS缓冲液稀释溶液至50 μL；取10 μL稀释液滴在清洗干净的AuE表面，4℃组装过夜得到cDNA/AuE；用PBS缓冲液冲洗电极表面后置于200 μL 2mM 的MCH溶液中1h，随后置于200 μL1wt.%的BSA溶液中1h，得到BSA/MCH/cDNA/AuE；将电极用PBS缓冲液冲洗干净并用N2轻轻吹干电极表面；滴加10 μL步骤（2）制备获得的含rDNA的酶切液在电极表面，37℃杂交反应4h得到rDNA/BSA/MCH/cDNA/AuE；同样用PBS缓冲液冲洗电极表面除去电极表面未杂交的DNA，然后电极浸泡于65 μL制备好的SERS标签AgNCs/4-MBA/sDNA中，37 ℃杂交反应4h得到SERS基底；然后对基底表面检测进行得到SERS信号。
所述sDNA为TTTTTTAGGGT(T)8-(CH2)6SH；pDNA为SH-(CH2)6-GCGCCCAACATCAGTCTGATAAGCTACCCTAAAAAACCACACGGCGC；cDNA为SH-(CH2)6-(T)8GCGCCGTGTGG。
本发明传感器原理：
将基于热电极的DSN辅助信号放大技术与和AgNCs的SERS增强技术相结合，构建了用于miRNA-21检测的SERS传感器。如图1所示，该传感器的构建主要分为三个部分：SERS标签的组装、基于热电极的DSN辅助目标循环信号放大、SERS基底的组装（具体步骤详见下方传感器的制备过程）。对于SERS标签的组装：信号探针sDNA与拉曼信号分子4-MBA均通过Ag-S键组装到AgNCs表面得到SERS标签AgNCs/4-MBA/sDNA。对于DSN辅助目标循环信号放大过程：巯基修饰的pDNA，通过Au-S键组装到HAuE表面，当目标miRNA-21存在时，pDNA的其中一部分将与目标杂交形成异源双链结构，双链体中的DNA链会被DSN识别并剪切。miRNA-21和pDNA中剩余未杂交的部分（rDNA）将被释放出来。释放出的miRNA-21可以继续与pDNA杂交进行下一个酶切循环，从而产生更多的rDNA片段。在此过程中，通过提高HAuE的温度来提高DSN酶的活性，从而使得该过程进行更快更彻底。SERS基底的组装过程：rDNA的3´端可以与AuE表面的捕获探针cDNA杂交，5′端与SERS标签上的sDNA杂交，将SERS标签组装到AuE表面制得SERS基底，从而在基底表面检测到SERS信号。
本发明的优点在于：
本发明将AgNCs与4-MBA和sDNA相结合以制备SERS标签。并将热电极技术与DSN辅助目标循环信号放大技术相结合，在DSN辅助目标循环信号放大过程中，通过提高电极的温度来提高DSN的活性，从而使得酶切循环过程更为高效彻底。本文的SERS传感器对miRNA-21的检出限达到2.9 fM（S/N = 3），且具有很高的特异性。
附图说明
图1 为检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器原理图。
图2为不同温度下SERS谱图，其中A为在不同电极温度下进行DSN辅助循环放大过程所得SERS谱图，a-g：35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃ ，B为相应SERS谱图在1586 cm−1 处的峰强变化。
图3为所述DSN用量、反应时间优化以及4-MBA浓度的优化图，其中A为DSN用量优化图，B为反应时间优化，C为4-MBA浓度的优化图。
图4为传感器对miRNA-21的高灵敏检测图。
图5为传感器的选择性图。
具体实施方式
传感器的制备过程所用碱基序列以及缓冲液
Tris缓冲液：10 mM Tris，0.1M NaCl，pH 7.4；
PBS缓冲液：10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4；
PBSS缓冲液：10 mM PB，0.1 M NaCl，0.01%（wt/vol）SDS，pH 7.4。
实施例1
一种检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，包括如下：
（1） SERS标签AgNCs/4-MBA/sDNA的组装
取10 μM 10 μL巯基修饰的sDNA，加入5 mM 10 μL TCEP，室温避光放置1 h，对二硫键进行还原，然后将其混入80 μL 8nM的AgNCs溶液中，加入300 μL的PBSS溶液混合均匀，37 ℃孵育过夜得到AgNCs/sDNA；接着向溶液中加入1 mM 4 μL的对巯基苯甲酸溶液，继续孵育2 h；然后将溶液离心，去除上清液后重新分散在400 μL PBSS溶液中，重复离心3次后4℃保存备用。
（2）DSN辅助目标循环信号放大过程；
将金热电极依次用1 μm和0.05 μm的氧化铝粉在抛光布上进行抛光，然后在超纯水中超声清洗3 min，置于0.5 M NaOH溶液中− 0.35 - 1.35 V电位间连续扫描500圈，接着置于5 mM H2SO4溶液中− 0.35 - 1.5 V电位间扫描20圈，对电极进行电化学清洗，最后用超纯水清洗冲洗，氮气吹干；
在固定pDNA前，将10 μM 5 μL巯基修饰的 pDNA与5 mM 5 μL TCEP混匀室温避光处理1 h以断裂二硫键，然后取10μL滴到清洗干净的金热电极表面，4 ℃组装过夜得到pDNA/HAuE；超纯水冲洗后浸泡在2 mM MCH溶液中，室温封闭1 h得到MCH/pDNA/HAuE，同样用超纯水对电极表面进行清洗；
取179 μL一定浓度的miRNA-21，加入20 μL的10×DSN buffer和0.5 U/μL 1 μLDSN酶配置成总体积为200 μL的酶切液；将MCH/pDNA/HAuE浸泡于酶切液中进行酶切反应60min；酶切温度控制为55℃；反应完成后，向酶切液中加入10 mM 50 μL EDTA于55℃恒温10 min，对DSN酶进行失活处理，得到所需的含有rDNA的酶切液；
（3）SERS基底的组装及检测
按照上述HAuE相同的处理方法，对直径为3mm的金电极（AuE）进行抛光清洗；取10μM 5 μL巯基修饰的cDNA与5 mM 5 μL TCEP混匀，室温避光孵育1 h；向上述混合液中加入PBS缓冲液稀释溶液至50 μL；取10 μL稀释液滴在清洗干净的AuE表面，4℃组装过夜得到cDNA/AuE；用PBS缓冲液冲洗电极表面后置于置于200 μL 2mM 的MCH溶液中1h，随后置于200 μL 1wt.%的BSA溶液中1h，得到BSA/MCH/cDNA/AuE；将电极用PBS缓冲液冲洗干净并用N2轻轻吹干电极表面；滴加10 μL步骤（2）制备获得的含rDNA的酶切液在电极表面，37℃杂交反应4h得到rDNA/BSA/MCH/cDNA/AuE；同样用PBS缓冲液冲洗电极表面除去电极表面未杂交的DNA，然后电极浸泡于65 μL制备好的SERS标签AgNCs/4-MBA/sDNA中，37 ℃杂交反应4h得到SERS基底；然后对基底表面检测进行得到SERS信号。 所用激光为He-Ne，激光波长为632.8nm，激光功率为最大功率的5%。
实施例2 温度的影响
双链特异性核酸酶（DSN）的活性与温度密切相关，为了研究金热电极HAuE的温度对DSN辅助目标循环信号放大过程的影响，将MCH/pDNA/HAuE浸入在含10 pM miRNA-21和0.6 U DSN的1× DSN缓冲溶液中，在不同电极温度下酶切90 min。用不同温度下酶切所得溶液进行SERS基底的组装，测得SERS谱图。如图2所示，当HAuE温度从35℃升高到55 ℃时，SERS峰强逐渐增加，而当温度高于60℃时，峰强开始下降。表明在一定范围内，升高温度可以提高DSN的活性，酶辅助循环过程更彻底，相应的SERS信号更强。因此本发明选择55 ℃作为最佳温度。
实施例3 DSN用量、反应时间优化以及4-MBA浓度的优化
为了获得更优异的检测性能，对实验过程中一些重要的条件进行了优化：DSN辅助目标循环信号放大过程中DSN的用量和反应时间，以及SERS标签的组装过程中信号分子4-MBA的浓度进行了优化。选择1586 cm−1处的SERS峰强作为效果评估的指标。首先对DSN的用量进行了探究。如图3-A所示，当DSN用量从0.1 U增加到0.5 U时，SERS强度也随之增强，当用量超过0.5 U后强度基本保持不变。因此，将0.5 U作为DSN的最佳用量。
然后对反应时间进行了优化，如图3-B所示，SERS强度随着反应时间的延长而增加，于60 min后趋于平稳。因此，将60 min作为后续实验的最佳反应时间。
另外，4-MBA的浓度直接影响到检测时的SERS峰强，因此对4-MBA的浓度也进行了优化。如图3-C，随着4-MBA浓度从1 μM增加到10 μM，SERS强度迅速增强。由于当4-MBA的浓度超过10 μM时，AgNCs粒子会出现聚集情况而无法继续试验，因此选择10 μM作为4-MBA分子的最佳浓度。
实施例4传感器对miRNA-21的高灵敏检测
在最优实验条件下，使用不同浓度的miRNA-21对传感器的分析性能进行探究。相应的SERS谱图如图4-A，可以看出当miRNA-21浓度从1×10−14 M增加至1×10−9 M，SERS强度也逐渐增强。图4-C（曲线a）为SERS强度与miRNA-21浓度的对数的线性关系，可以看出SERS强度与miRNA-21浓度在10 fM至1 nM范围呈良好的线性关系。线性方程为y = 33631.06 +2283.48 lg C（M）（R2 = 0.998），其中y表示1586 cm−1处的SERS峰强，计算得到检测限（LOD）为2.9 fM（S/N = 3）。
为了进一步探索HAuE的温度对传感器检测的影响，探究了HAuE温度为25 ℃，在其它条件为最优条件下，SERS峰强与miRNA-21浓度间的关系。如图4-C（曲线b），miRNA-21浓度与SERS强度在100 pM至10 nM范围内呈线性关系，线性方程为y = 8501.46 + 733.18 lg C（M）（R2 = 0.96）。计算得到LOD为7.4 pM（S/N = 3）。表明HAuE温度在55℃下，比在25℃下，检测极限可以降低大约3个数量级，进一步说明了通过提高HAuE的温度可以极大提高DSN的活性，从而提高miRNA-21检测的灵敏度。
实施例5 本发明SERS传感器对其它miRNA的响应：
我们使用miRNA-141（UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG），miRNA-155（UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU）和非互补序列作为干扰物来评估该传感器的选择性。实验在相同的最佳条件下进行（即实施例1步骤），干扰物的浓度比目标物miRNA-21（1 pM）高10倍。如图5所示，在存在目标物miRNA-21的情况下，可以观察到明显的SERS信号，而空白实验（不存在miRNA-21）或加入其他干扰物质时，几乎无SERS信号。这些结果清楚地表明，本申请所提出的SERS传感器对于miRNA-21的检测具有极好的选择性。
实施例6本发明SERS传感器用于血清中加标回收率检测：
为了验证该传感器在miRNA-21检测中的适用性和可靠性，采用标准添加方法在血清样品中检测了目标miRNA-21，结果如表1。将不同浓度的miRNA-21（0.1、1和10 pM）加入稀释100倍的血清中，回收率在80.2 %至90.0 %的范围内，相对标准偏差（RSD）在2.8 %至6.9%之间。这些结果表明，所制备的传感器选择性高，有望用于实际样品检测。
表1
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> pDNA
<400> 1
gcgcccaaca tcagtctgat aagctaccct aaaaaaccac acggcgc 47
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> cDNA
<400> 2
ttttttttgc gccgtgtgg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> sDNA
<400> 3
ttttttaggg ttttttttt 19
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> miRNA-21
<400> 4
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> miRNA-141
<400> 5
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> miRNA-155
<400> 6
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
Claims (2)
1.一种检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于：包括如下：
（1）SERS标签AgNCs/4-MBA/sDNA的组装
取10μM 10μL巯基修饰的sDNA，加入5mM 10μL TCEP，室温避光放置1h，对二硫键进行还原，然后将其混入80μL 8nM的AgNCs溶液中，加入300μL的PBSS溶液混合均匀，37℃孵育过夜得到AgNCs/sDNA；接着向溶液中加入1mM 4μL的对巯基苯甲酸溶液，继续孵育2h；然后将溶液离心，去除上清液后重新分散在400μL的PBSS溶液中，重复离心3次后4℃保存备用；
（2）DSN辅助目标循环信号放大过程
将金热电极HAuE依次用1μm和0.05μm的氧化铝粉在抛光布上进行抛光，然后在超纯水中超声清洗3min，置于0.5M NaOH溶液中-0.35~1.35 V电位间连续扫描500圈，接着置于5mMH2SO4溶液中-0.35~1.5 V电位间扫描20圈，对电极进行电化学清洗，最后用超纯水清洗冲洗，氮气吹干；
在固定pDNA前，将10μM 5μL巯基修饰的pDNA与5mM 5μL TCEP混匀室温避光处理1h以断裂二硫键，然后取10μL滴到清洗干净的金热电极表面，4℃组装过夜得到pDNA/HAuE；超纯水冲洗后浸泡在2mM MCH溶液中，室温封闭1h得到MCH/pDNA/HAuE，同样用超纯水对电极表面进行清洗；
取179μL一定浓度的miRNA-21，加入20μL的10×DSN buffer和0.5U/μL 1μL DSN酶配置成总体积为200μL的酶切液；将MCH/pDNA/HAuE浸泡于酶切液中进行酶切反应60min；酶切温度控制为55℃；反应完成后，向酶切液中加入10mM 50μL EDTA于55℃恒温反应10min，对DSN酶进行失活处理，得到所需的含有rDNA的酶切液；
（3）SERS基底的组装及检测
按照上述金热电极HAuE相同的处理方法，对直径为3mm的金电极AuE进行抛光清洗；取10μM 5μL巯基修饰的cDNA与5mM 5μL TCEP混匀，室温避光孵育1h；再加入PBS缓冲液稀释溶液至50μL；取10μL稀释液滴在清洗干净的AuE表面，4℃组装过夜得到cDNA/AuE；用PBS缓冲液冲洗电极表面后置于200μL 2mM的MCH溶液中1h，随后置于200μL 1wt.%的BSA溶液中1h，得到BSA/MCH/cDNA/AuE；将电极用PBS缓冲液冲洗干净并用N2轻轻吹干电极表面；滴加10μL步骤（2）制备获得的含rDNA的酶切液在电极表面，37℃杂交反应4h得到rDNA/BSA/MCH/cDNA/AuE；同样用PBS缓冲液冲洗电极表面除去电极表面未杂交的DNA，然后电极浸泡于65μL制备好的SERS标签AgNCs/4-MBA/sDNA中，37℃杂交反应4h得到SERS基底；然后对基底表面检测进行得到SERS信号；
所述sDNA为TTTTTTAGGGT(T)8-(CH2)6SH；pDNA为SH-(CH2)6-GCGCCCAACATCAGTCTGATAAGCTACCCTAAAAAACCACACGGCGC；cDNA为SH-(CH2)6-(T)8GCGCCGTGTGG。
2.如权利要求1所述的制备方法制备获得的检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器。
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