CN111534571A

CN111534571A - 一种用于铅离子检测的cha-sers生物传感器及其制备方法和应用

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Publication number: CN111534571A
Application number: CN202010450097.1A
Authority: CN
Inventors: 吴燕; 陈锦杨; 付翠翠; 石文兵
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN111534571B

Abstract

本发明涉及一种用于铅离子检测的CHA‑SERS生物传感器及其制备方法和应用，所述CHA‑SERS生物传感器，是以银纳米颗粒修饰的单晶硅作为SERS基底，将CHA和DNAzyme引入系统，从而拉近了拉曼信号分子与SERS基底表面之间的距离，达到信号放大的效果。本发明制备的CHA‑SERS生物传感器灵敏度高，最低检测浓度为0.42 pM，并且具有较好的选择性，对其它的重金属离子表现出良好的特异性。同时也扩大了SERS生物传感器的应用范围，具有良好的应用前景。

Description

一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，具体涉及一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

随着科技的发展，铅在社会中的应用越来越广泛，如汽油、染料等。铅离子（Pb²⁺）是一种毒性非常大的重金属离子，而且铅离子又不能通过生物降解，因此在环境中累积，导致食物、水和土壤受污染。铅离子可通过皮肤、消化道、呼吸道进入体内与多种器官结合，研究表明，少量的Pb²⁺能够使人体的健康受到严重伤害。其主要毒性可导致贫血、神经系统损伤、生殖系统损伤等。世界卫生组织严格规定了水、食物和土壤中的铅离子的浓度极限。因此，发展一种高灵敏度、高选择性的方法用于环境中Pb²⁺的检测是十分迫切的。

目前，铅离子的检测方法主要有原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)、电化学法等，这些方法虽然检测灵敏度高，结果准确，但是检测过程繁琐、操作复杂且仪器设备昂贵，需要在实验室条件下进行，难以满足现场快速检测和日常检测的需求。鉴于铅离子对人体造成的危害，以及现有检测方法的不足，开发一种快速便捷检测铅离子含量的方法对维护食品安全和保障人类健康具有很重要的现实意义。

表面增强拉曼散射光谱（SERS）是一种重要的光谱检测技术，在生物检测方面体现出了相当大的优势。一方面，粗糙的金属表面作为SERS基底，能够使SERS信号强度大大增加，增强幅度能够达到10⁶～10¹⁴，因此SERS可对微量或者痕量目标物进行超灵敏检测；另一方面，与其它方法的标记物相比，SERS标记物具有更简单、更广泛、更尖锐的“指纹”信号和良好的重复性。作为一种分析检测技术，SERS技术具有灵敏度高、选择性好、能用于无损检测等优势，可以在水环境中检测物质的结构信息，对于生物体系的研究具有独特的优势。目前，SERS技术已经被用于创建多种生物传感器，但其检测灵敏度还不能满足实际应用，为了提高SERS 生物传感器的检测灵敏度，以往的报道提出过许多增强策略。如用SERS技术与DNA探针相结合用于重金属离子、生物体内组分的检测研究。然而，生物体系结构复杂，存在多种干扰物质以及非特异性结合，会在一定程度上影响SERS信号的高效获得。因此，建立高灵敏度的检测方法是SERS 生物传感器不断向前发展的保证。采用含有“热点”结构的活性基底来增强被测物的SERS信号，利用酶、核酸等与目标物的识别过程使信号分子恰好置于基底上的“热点”位置。但是，这些方法不仅需要复杂的制备技术和组装工艺，而且对仪器设备要求较高。同时，一个目标识别事件只能引入一个信号报告单元，这将大大的限制检测灵敏度的提高，并且选择性也受到限制。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器及其制备方法和应用，解决现有SERS传感器检测灵敏度不高、选择性不好的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器，所述生物传感器包括SERS活性基底、催化发卡组装信号放大（CHA）系统和双链DNAzyme，所述CHA系统包括探针H1和探针H2，所述SERS活性基底为银纳米颗粒修饰的单晶硅片AgNPs@Si，且通过Ag-S键连接有探针H1得到H1-AgNPs@Si基底；所述双链DNAzyme能特异性的识别Pb²⁺，并激发自身的自剪切活性，切割底物链，释放出引发链；所述探针H2和探针H1是具茎环结构的发夹DNA探针，发卡探针H1的粘性末端和茎端区域序列与所述引发链特异性杂交将H1发卡打开，释放出可以打开发卡探针H2的发夹结构序列，从而与探针H2互补序列杂交，由于探针H1和探针H2的杂交能量高于H1与引发链的杂交能量，从而使探针H2通过链置换方式与H1杂交形成稳定的双链结构，并且将引发链释放出来，释放出来的引发链又可以引发下一轮的CHA的发生，实现目标循环和信号放大，所述探针H2的一端用拉曼信号分子R6G标记。

进一步，所述发卡探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；所述发卡探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

本发明的另一个目的在于提供上述用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

1）获得银纳米颗粒修饰的单晶硅片AgNPs@Si的SERS活性基底；

2）将底物链与酶链混合均匀，加热至95℃退火并保持5 min后逐渐冷却至室温，形成Pb²⁺-特异性识别的DNAzyme溶液；

3）将SH-标记的发卡探针H1与含三（2-羧乙基）膦盐酸盐的Tris缓冲溶液充分混合，使二硫键断裂，随后将步骤S1制备的AgNPs@Si SERS活性基底浸泡于发卡探针H1溶液中反应，再浸泡于含NaCl的磷酸缓冲液中，目的是使SH-H1与SERS基底上的AgNPs充分反应。反应结束后用PBS缓冲液冲洗，目的是除掉未反应的DNA，并经氮气吹干，得到H1-AgNPs@Si基底；

4）将探针H2溶液加热至95℃退火并保持5~10min后逐渐冷却至室温，形成发卡结构的探针H2，即得到所述CHA-SERS生物传感器。

作为优选的，所述引物链和酶链的浓度各自独立选自0.5~2.0 μM；所述探针H1的浓度为0.5~2.0 μM。

作为优选的，所述AgNPs@Si的SERS活性基底是通过以下步骤制得：将表面洁净的单晶硅片置于HF溶液中浸泡使其表面形成Si-H键，然后再将单晶硅片浸泡于包含HF的AgNO₃溶液中，并不断摇晃反应均匀，使AgNPs通过还原反应沉积于Si表面，即得到AgNPs@SiSERS基底。

作为优选的，所述单晶硅片浸泡置于5~10 % HF溶液中，反应时间为5~30 min；单晶硅片浸泡于包含10~20 % HF的AgNO₃溶液中，反应时间为1~5 min。反应时间过短，会导致生长在硅片上的AgNPs太小，颗粒之间的距离太大，以致得到的AgNPs@Si SERS 基底的增强效果不好，相反，若反应时间过长，会导致AgNPs聚集，影响基底的SERS增强效果。

本发明的另一个目的在于提供上述生物传感器在检测铅离子方面的应用，所述铅离子的检测方法包括以下步骤：

S1：分别将一系列不同浓度的铅离子溶液加入双链DNAzyme溶液中孵育反应，得到酶切产物，再将所述酶切产物滴加到CHA-SERS生物传感器的H1-AgNPs@Si基底上进行反应，反应完成后用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干，然后将发卡结构的H2探针溶液滴加至基底反应，用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干；其中，孵化反应得到引发链（rS1链）的溶液滴加到基底上，引发CHA反应，rS1链将发卡探针H1打开，H1的部分碱基与rS1链杂交，形成rS1-H1中间体；将H2溶液滴加至基底上，由于rS1-H1中间体不稳定，使发卡探针H1的裸露部分继续与H2反应，最终形成稳定的双链结构H1-H2，并伴随rS1的释放，被释放的rS1继续引发下一轮的CHA反应，经过多次循环反应，最终形成大量的H1-H2双链结构。

S2：对步骤S1反应后的基底进行拉曼散射检测，测得各体系对应的SERS光谱，构建SERS光谱强度和铅离子溶液的浓度的线性关系，进而实现对铅离子的定量检测。

作为优选的，所述孵育温度为30~40℃，反应时间为20~40 min；所述酶切产物与基底反应的温度为30~40℃，反应时间为30~80 min；所述H2探针溶液与基底反应的时间为30~80 min，反应温度为30~40 ℃。若反应温度过高，会导致DNAzyme酶的活性降低，减小反应效率；反应温度过低，不利于激活DNAzyme的酶活性。

作为优选的，所述拉曼散射检测时的激光波长为785 nm，光谱采集范围为500~2000 cm^-1，积分时间1~3 s。

本发明的工作原理：在SERS生物传感器中引入CHA信号放大反应，在目标物Pb²⁺存在下，Pb²⁺特异性催化Pb²⁺-特异性的DNAzyme酶切反应，释放出的引发链rS1与固定于SERS活性基底上的发卡探针H1的茎端区域序列部分杂交，形成不稳定的中间体rS1-H1，同时将H1发卡打开，H1探针裸露出可以打开发卡探针H2的序列，从而与一端标记拉曼信号分子R6G的发卡探针H2互补序列杂交，由于H1和H2的杂交能量高于H1与rS1的杂交能量，从而使H2通过链置换方式与H1杂交形成稳定的双链结构H1-H2，并且将引发链rS1释放出来，释放出来的rS1又可以引发下一轮的CHA的发生，从而促使生成更多的H1-H2双链结构，从而达到信号放大的效果，实现检测灵敏度的提高。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的CHA-SERS生物传感器中，当检测系统中存在目标物Pb²⁺时，Pb²⁺依赖性的DNAzyme则在酶切位点发生相应的自剪切催化反应，导致DNAzyme释放引发链，继而引发更多的CHA反应，生成更多的R6G标记的H1-H2双链结构，因此R6G的SERS信号强度越大。当检测系统中不存在目标物Pb²⁺时，不能激发DNAzyme序列后续的自剪切催化反应，也就不能产生R6G的SERS信号。因此，由于此DNAzyme对Pb²⁺具有高度的依赖性，所以此传感系统对目标物Pb²⁺的检测具有高度的选择性，对其它的重金属离子表现出良好的特异性。其中，DNAzyme能够循环放大自剪切产生的引发链所引发的CHA反应，进而增强R6G的SERS信号变化，增强传感系统的灵敏度，使得此传感器对于Pb²⁺的检测限达到0.42 pM。

2、本发明制备的CHA-SERS生物传感器，银纳米颗粒修饰的单晶硅作为SERS基底，将CHA和DNAzyme引入系统，从而拉近了拉曼信号分子与SERS基底表面之间的距离，达到信号放大的效果。通过引入简单快速、成本低廉的DNA信号放大技术，使目标物循环重复利用，进而提高SERS生物传感器的检测灵敏度。

3、本发明通过引入无酶的催化发卡组装信号放大技术得到放大的增强策略与现有的提高SERS灵敏度的方法有很大不同，本发明无需外源引物与酶，能够实现简单快速、成本低廉的信号放大检测，并且该信号放大技术通过与Pb²⁺-特异性的DNAzyme联用，能够实现低背景信号干扰、高灵敏检测研究，更为重要的是，该方法大大提高了检测的特异性。具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的AgNPs@Si SERS基底扫描电子显微镜图。

图2为实施例1制备的AgNPs@Si SERS基底原子力电子显微镜图。

图3为实施例1制备的AgNPs@Si SERS基底X射线能谱元素分析图。

图4为探针分子的SERS信号强与目标Pb²⁺的浓度关系图。

图5为SERS光谱在1361cm^-1处的峰强度随着目标Pb²⁺的浓度变化的关系图。

图6为SERS生物传感器用于Pb²⁺检测的特异性图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细的描述，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得和/或根据已知的方法制备获得。

实施例1

一、一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器

所述生物传感器包括SERS活性基底、CHA系统和双链DNAzyme，所述CHA系统包括探针H1和探针H2，所述SERS活性基底为银纳米颗粒修饰的单晶硅片AgNPs@Si，且通过Ag-S键连接有发卡探针H1；所述双链DNAzyme能特异性的识别Pb²⁺，并激发自身的自剪切活性，释放出引发链；所述发卡探针H2和发卡探针H1是具茎环结构的发夹DNA探针，所述探针H1的粘性末端和茎端区域序列与所述引发链特异性杂交将H1发卡打开，释放出可以打开探针H2发夹结构的序列，从而与探针H2互补序列杂交，并且探针H1和探针H2的杂交能量高于探针H1与引发链的杂交能量，所述发卡探针H2的一端用拉曼信号分子R6G标记。

二、一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器的制备方法

1、AgNPs@Si SERS基底的制备

（1）单晶硅片的清洗：

取0.5 × 0.5 cm²大小的单晶硅片置于清洁烧杯中，并于超声仪中依次用去离子水、乙醇和去离子水超声清洗10 min，得到表面无杂质的单晶硅片。

再取40 mL体积比3:1的浓度为98 %的浓硫酸和浓度为30 %的过氧化氢混合溶液，向烧杯中缓慢加入并摇匀，将表面无杂质的单晶硅片置于混合溶液中浸泡30 min后以除去难容杂质，然后用去离子水清洗三次以去除残留的反应液，用氮气吹干，备用。

（2）硅氢键的还原：

将清洁干净的单晶硅片置于浓度为5 %的氢氟酸溶液（HF）中浸泡20 min，这里HF的作用是去除在硅片表面覆盖的二氧化硅氧化层或其它杂质，并在硅片表面形成硅氢键（Si-H），用去离子水冲洗干净，氮气吹干，备用。

（3）银纳米颗粒的原位生长：

将形成Si-H键的单晶硅片平铺于干净的表面皿上，光面朝上，向其中迅速加入含10 %HF的硝酸银溶液（2.5 mM）进行反应，反应时间控制为3 min，实现银纳米颗粒在硅片表面的原位生长，从而得到银纳米颗粒修饰的硅基材料SERS基底（AgNPs@Si），反应结束后，用去离子水冲洗干净，用氮气吹干，备用。

将制备得到的AgNPs@Si SERS基底分别进行扫描电子显微镜、原子力电子显微镜和X射线能谱元素分析表征，结果分别如图1、图2和图3所示。

由图1和图2可以看出，沉积于硅片上的AgNPs的粒径大小约为100 nm左右，颗粒大小较为均匀，且SERS基底中AgNPs分布也较为均匀。从图3可以看出是，AgNPs@Si SERS基底中含有Si和Ag两种元素，无其它杂质。

2、H1-AgNPs@Si基底的制备

将SH-标记的探针1（H1）与5.0 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）的Tris缓冲溶液混合1 h，使二硫键断裂。再将其置于95 ℃下退火并保持5 min后逐渐冷却至室温，得到发卡结构的探针H1溶液。随后将制备的AgNPs@Si SERS活性基底浸泡于发卡结构的探针H1溶液中反应24 h，之后向上述步骤溶液中分5次，间隔2~3 h加入1 M氯化钠盐溶液（NaCl），保证盐溶液浓度最终达到0.1 M，再次过夜老化，保证发卡探针H1与银纳米颗粒充分反应，再用100mM PBS缓冲液（pH为7.4）冲洗基底，并经氮气吹干，即得到H1-AgNPs@Si基底。

3、DNAzyme溶液的制备

将50 μL (2 μM) 的单链底物链（S1）与50 μL (2 μM)的单链酶链（S2）混合均匀，加热至95℃退火并保持5 min后逐渐冷却至室温, 形成Pb²⁺-特异性识别的DNAzyme溶液。

其中，底物链和酶链的核酸序列如下所示：

单链底物链：5’-CTCAGAGTAGAGAAGGrATATCACTCA-3’ (rA表示核糖核苷酸，为酶的切割位点)

单链酶链：5’-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC-3’

DNAzyme的结构示意图如下：

4、发夹结构的H2探针的制备

将1 μM的H2探针溶液加热至95℃退火并保持5 min后逐渐冷却至室温，形成发卡结构的H2探针溶液。

三、CHA-SERS生物传感器用于铅离子的检测方法

1、引发Pb²⁺催化DNAzyme的酶切反应：

将不同浓度的Pb²⁺加入到含有双链DNAzyme溶液中，在37 ℃下反应30 min，使Pb²⁺与DNAzyme之间的酶切反应完成，释放引发链，得到酶切产物溶液。

2、引发CHA反应，用于SERS的高灵敏检测：

1）取15 μL的酶切产物溶液滴加至所得到的H1-AgNPs@Si基底上，反应60 min，然后用PBS缓冲液（pH为7.4）冲洗，并经氮气吹干后备用。

2）将含发夹结构的探针H2的溶液滴加至步骤1）得到的基底上，室温下反应60min，然后用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干后，进行SERS检测。

SERS光谱采用EZRaman-M便携式拉曼光谱仪进行检测，激光波长选用785 nm，光谱采集范围为500-2000 cm^-1，积分时间1s，累积3次。

实施例2 CHA-SERS生物传感器用于铅离子检测的灵敏度试验

为了验证本发明CHA-SERS生物传感器的灵敏度，将不同浓度的铅离子（1pM，5pM，10pM，100pM，1nM，10nM和100nM) 分别加入到CHA-SERS生物传感器中。其它的实验步骤同实施例1，检测相应情况下的SERS光谱。结果如图4和图5所示。

从拉曼信号吸收光谱图（图4）可以看出，在1 pM~100 nM范围内，拉曼信号分子（R6G）的SERS信号强度随着目标Pb²⁺的浓度增大而增大。因为Pb²⁺的浓度越大，Pb²⁺切割的DNAzymes反应程度越大，生成的引发链rS1越多，继而引发更多的CHA反应，生成更多的R6G标记的H1-H2双链结构，因此R6G的SERS信号强度越大。

从R6G的SERS光谱在1361cm^-1处的峰强度随着目标Pb²⁺的浓度变化的拟合模拟曲线的数据（图5）分析表明，所构建的检测方法在1 pM到100 nM之间具有良好的线性拟合（R ²=0.998），利用CHA-SERS传感方法对目标Pb²⁺的最低检测浓度达到了0.42 pM。

实施例3 CHA-SERS生物传感器用于铅离子检测的特异性试验

为了验证本发明CHA-SERS生物传感器的特异性，将不同干扰金属离子分别加入到CHA-SERS生物传感器中。其它的实验步骤同实施例1，检测相应情况下的SERS光谱。结果如图6所示。

从图6可以看出，只有在目标物Pb²⁺存在时，R6G的SERS信号强度显著增强；而无目标物Pb²⁺存在时，其它干扰金属离子产生R6G的SERS信号很弱，可忽略不计。结果表明，该CHA-SERS生物传感器对目标Pb²⁺的选择性较好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccttctctac tctgagtcat ctgtagagaa gg 32

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttccttctc tacagatgac tcagagtaga gaagg 35

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcagagtag agaaggrata tcactca 26

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgagtgataa agctggccga gcctcttctc tac 33

Claims

1.一种用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括SERS活性基底、CHA系统和双链DNAzyme，所述CHA系统包括探针H1和探针H2，所述SERS活性基底为银纳米颗粒修饰的单晶硅片AgNPs@Si，且通过Ag-S键连接有探针H1得到H1-AgNPs@Si基底；所述双链DNAzyme能特异性的识别Pb²⁺，并激发自身的自剪切活性，释放出引发链；所述探针H2和探针H1是具茎环结构的发夹DNA探针，所述探针H1的粘性末端和茎端区域序列与所述引发链特异性杂交将探针H1发卡结构打开，释放出可以打开探针H2发夹结构的序列，从而与探针H2互补序列杂交，并且探针H1和探针H2的杂交能量高于探针H1与引发链的杂交能量，所述探针H2的一端用拉曼信号分子R6G标记。

2.根据权利要求1所述用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器，其特征在于，所述探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

3.一种如权利要求1或2所述用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）获得银纳米颗粒修饰的单晶硅片AgNPs@Si的SERS活性基底；

2）将底物链与酶链混合均匀，加热至95℃退火并保持5 min后逐渐冷却至室温，形成Pb² ⁺-特异性识别的DNAzyme溶液；

3）将SH-标记的探针H1与三（2-羧乙基）膦盐酸盐的Tris缓冲溶液充分混合，随后95℃退火并保温5~10min后逐渐冷却至室温，得到发卡结构的探针H1溶液，然后将步骤1）制备的AgNPs@Si SERS活性基底浸泡于发卡结构的探针H1溶液中反应，再浸泡于含NaCl的磷酸缓冲液中，反应结束后用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干，得到H1-AgNPs@Si基底；

4）将探针H2溶液加热至95℃退火并保持5~10min后逐渐冷却至室温，形成发卡结构的探针H2溶液，即得到所述CHA-SERS生物传感器。

4.根据权利要求3所述用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器的制备方法，其特征在于，所述引物链和酶链的浓度各自独立选自0.5~2.0 μM；所述探针H1的浓度为0.5~2.0 μM。

5.根据权利要求3所述用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器的制备方法，其特征在于，所述AgNPs@Si的SERS活性基底是通过以下步骤制得：将表面洁净的单晶硅片置于HF溶液中浸泡使其表面形成Si-H键，然后再将单晶硅片浸泡于包含HF的AgNO₃溶液中，并不断摇晃反应均匀，使银纳米颗粒AgNPs通过还原反应沉积于Si表面，即得到AgNPs@Si SERS基底。

6.根据权利要求5所述用于铅离子检测的CHA-SERS生物传感器的制备方法，其特征在于，所述单晶硅片浸泡置于5~10 % HF溶液中，反应时间为5~30 min；单晶硅片浸泡于包含10~20 % HF的AgNO₃溶液中，反应时间为1~5 min。

7.如权利要求1或2所述生物传感器在检测铅离子方面的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述铅离子的检测方法包括以下步骤：

S1：分别将一系列不同浓度的铅离子溶液加入双链DNAzyme溶液中孵育反应，得到酶切产物，再将所述酶切产物滴加到CHA-SERS生物传感器的H1-AgNPs@Si基底上进行反应，反应完成后用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干，然后将发卡结构的H2探针溶液滴加至基底反应，用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干；

S2：对步骤S1反应后的基底进行拉曼散射检测，测得各体系对应的SERS光谱，构建SERS光谱强度和铅离子溶液的浓度的线性关系，进而实现对待测样品中铅离子的定量检测。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述孵育温度为30~40℃，反应时间为20~40min；所述酶切产物与基底反应的温度为30~40℃，反应时间为30~80 min；所述发卡结构的探针H2溶液与基底反应的时间为30~80 min，反应温度为30~40℃。

10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述拉曼散射检测时的激光波长为785 nm，光谱采集范围为500~2000 cm^-1，积分时间1~3 s。