CN113252764B - 一种核酸纳米结构及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸纳米结构及其制备方法与应用，所述核酸纳米结构包括四条核酸单链，所述第一单链核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二单链核酸序列如SEQID NO.2所示，所述第三单链核酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第四单链核酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明方案制备的核酸纳米结构形状、体积可灵活设计，易于与DNA、RNA、蛋白质和小分子等目标物相互作用，便于探针修饰，在纳米孔检测过程中放大信号，减慢速度，产生高分辨的检测信号，实现了多种孔径的纳米孔传感器对单分子目标物的检测。

Description

一种核酸纳米结构及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米孔检测技术领域，具体涉及基于一种核酸纳米结构及其制备方法与应用。
背景技术
HPV18是人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)中的一个型别，是世界卫生组织(WHO)确认的、与宫颈癌高度相关的13种高危型HPV之一。HPV16和HPV18引起70％的宫颈癌和宫颈癌癌前病变。其中与HPV18有关的宫颈癌占10％-20％，在腺癌中HPV18感染率最高，为37.7％，相关技术通过用蛋白质纳米孔检测，这种方法灵敏度低，机械性能差；利用核酸纳米结构信号放大器的结构变化检测核酸分子，此方法核酸纳米结构结构变化前后的信号差距小，难以定量分析；结合cas12a剪切系统剪切大结构，通过检测大结构变化来检测核酸分子，此方法电流阻塞信号数量由多到少，灵敏度低。因此，构建一种固态纳米孔传感器用以准确和快速检测HPV18对于识别那些有HPV相关癌症风险的人是至关重要的。
纳米孔具有操作简单、单分子分辨率高、无标记等优点，已成为一种很有前途的生物分子传感平台。经过近二十年的发展，已经形成了两种主要的纳米孔，即蛋白质纳米孔和固态纳米孔。蛋白质纳米孔在分析小尺寸靶点时具有极高的分辨率，可用于基因测序和研究分子间的相互作用。然而，蛋白质纳米孔的孔径固定，机械稳定性差，限制了其应用范围。近年来，常用的固体纳米通道有三种：在石墨烯和氮化硅纳米膜上用离子束或电子束轰击得到的纳米通道，化学腐蚀聚合物薄膜中的重金属离子轨迹得到的锥形纳米通道和拉制毛细管得到的玻璃纳米孔。其中玻璃纳米孔由于制备简单、机械稳定性好、成本低、易于化学修饰，结构稳定，具有可调孔径和表面功能性，因此受到越来越多的关注。
纳米孔传感器的传感原理是在两个腔室之间施加一个电位差，当带电的生物聚合物通过电泳驱动通过纳米孔时，这会暂时阻止离子通过，从而导致电流下降，可以看到一个电流-时间轨迹，其对应于单分子过孔，这通常被称为事件。对事件大小、形状、持续时间和速率的分析为解释分子长度、形状、电荷和浓度提供了基础。
尽管玻璃毛细管纳米孔的直径可以在很大范围内调节，但是直接检测不同的生物分子仍然是一个巨大的挑战，原因有三个。首先，为了获得最佳的信噪比，目标物直接过孔检测法需要与之严苛匹配的纳米孔孔径，因此为不同的目标物找到匹配的孔径是一个费时费力的过程。在制备玻璃纳米孔时，需要反复优化拉伸参数，这往往是一项艰巨且耗时较长的工作。另外，当检测小分子目标物时，缓冲体系中一些带电高分子等干扰物在小孔径固态纳米孔检测过程中容易造成堵塞，导致传感器的机械稳定性差，测量过程效率低。其次，由于和目标物结构相似的带电干扰物也会产生过孔事件，引入一定程度的噪声。干扰的性质通常是未知的，因此低特异性纳米孔传感器可能导致不可预测的噪声水平，并导致后续数据分析的困难。第三，纳米孔的重复性差。虽然可以通过调整拉伸参数来调整孔径，但由于批次的不同，导致不同实验的传感信号也不同，使得传感器的重复性很低。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种核酸纳米结构，能够准确和快速检测单分子核酸片段。
本发明还提出上述核酸纳米结构的制备方法。
本发明还提出一种上述核酸纳米结构的应用。
本发明还提出一种检测核酸片段的方法。
本发明还提出一种上述方法的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种核酸纳米结构，所述包括四条核酸单链，所述第一单链核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二单链核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三单链核酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第四单链核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一些实施方式中，所述第一单链核酸序列由84个碱基组成，第二单链核酸序列由84个碱基组成，第三单链核酸序列由84个碱基组成，第四单链核酸序列由99个碱基组成。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构的其中一条单链核酸序列为含粘性末端的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构由核酸单链杂交合成。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构由四条核酸单链杂交合成。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构为自组装核酸纳米结构。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构为四面体、六面体、圆柱形、二聚体中的一种。
根据本发明的第二方面，提出了上述核酸纳米结构的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：先将所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸、第四单链核酸混合后放于90～95℃处理3～8min，20～40s快速降温至2～8℃放置4～8h即得核酸纳米结构。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构的制备方法：先将所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸、第四单链核酸混合后放于95℃处理5min，30s快速降温至4℃放置6h即得核酸纳米结构。
在本发明的一些实施方式中，所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸和第四单链核酸溶解于Tris-镁盐缓冲液(TM Buffer)中进行杂交。
在本发明的一些实施方式中，所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸和第四单链核酸的摩尔浓度比为(1～3):(1～2):(1～2):(1～4)。
在本发明的一些实施方式中，所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸和第四单链核酸的摩尔浓度比为1:1:1:1。
根据本发明的第三方面，提出了一种核酸纳米结构的应用，所述应用为核酸纳米结构在制备病毒、细菌或癌症核酸片段检测试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构在制备蛋白质、小分子、离子检测试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构在制备信号转导载体中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸纳米结构在制备纳米孔的信号转导载体中的应用。
根据本发明的第四方面，提出了一种检测核酸片段的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、待测目标核酸片段进行剪切得到单链核酸；
S2、步骤S1所得的单链核酸中加入磁珠和生物素；
S3、权利要求1-3所述的核酸纳米结构与步骤S2所得的溶液进行连接；
S4、将步骤S3所得的连接产物溶液进行检测，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中，剪切方式采用CRISPR-Cas12a剪切系统、限制性内切酶的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中，剪切方式采用CRISPR-Cas12a剪切系统。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中，所述连接方法为：将上述核酸纳米结构和剪切系统溶液混合在室温下孵育30min。取30μl链霉亲和素修饰的磁珠悬浮液转移到干净的PCR管中，并用160μl TM缓冲液洗涤五次。将上述混合溶液加入含有磁珠的PCR管中，在室温下孵育30min，同时轻轻摇晃试管，将反应后的PCR管置于磁铁上，提取10μL上清液，用于检测。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，检测采用固体纳米孔检测平台进行检测。
在本发明的一些实施方式中，纳米孔的基底材料为氮化硅，玻璃管和基因改造大孔蛋白中的一种。
在本发明的一些实施方式中，固态纳米孔检测平台检测，包括将上述上清液加入到固态纳米孔检测平台的检测池的一侧流道内，将一对Ag/AgCl电极分别浸入所述检测池和玻璃管中，施加300～900mV的跨膜电压，采集电流阻断信号。
在本发明的一些实施方式中，所述电压为400mV。
在本发明的一些实施方式中，所述固态纳米孔检测平台通过以下方法构建：将石英玻璃管除杂后安装在CO2-laser-actuated pipette puller拉制仪中并设置两段程序：(1)Heat 750，Filament 5，Velocity 50，Delay140，and Pull 50；(2)Heat 800，Filament4，Velocity 30，Delay 155，and Pull 250，得到玻璃锥形纳米孔，管内注入电解质溶液，将电解质溶液加入到检测池的流道内，确保纳米孔为唯一的电解质连通通道，从而形成固态纳米孔检测平台。
在本发明的一些实施方式中，所述电解质溶液为1mol/L的KCl溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述石英玻璃管选用内径为0.5mm，外径为1mm的石英玻璃管。
在本发明的一些实施方式中，所述石英玻璃管除杂过程包括浸泡在新鲜制备的食人鱼溶液中1～3小时以去除杂质后采用去离子水清洗石英玻璃管，干燥后即可使用。
在本发明的一些实施方式中，所述食人鱼溶液的制备方法采用体积比为7：3的H2SO4和H2O2溶液进行配制。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥采用真空干燥箱中70-90℃干燥15-30分钟。
根据本发明的第五方面，提出了上述方法的应用，所述应用为上述方法在检测病毒、细菌或癌症核酸中的应用，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的。
在本发明的一些实施方式中，所述方法在检测单分子蛋白质中的应用。
根据本发明实施方式的核酸纳米结构及其制备方法与应用，至少具有如下有益效果：本发明通过以核酸纳米结构作为信号传导载体，由于其形状、体积可灵活设计，易于与DNA、RNA、蛋白质和小分子等目标物相互作用，便于探针修饰，在纳米孔检测过程中放大信号，减慢速度，产生高分辨的检测信号，该体系具有与孔径匹配的良好结构和良好的比表面积，传感器具有良好的信噪比、重复性和选择性，极大地拓宽了传感器的应用范围，同时也避免了调整合适孔径大小以匹配不同的目标分子的繁琐过程。同时本发明方案采用玻璃纳米孔传感器检测方法，使所使用的纳米孔传感器摆脱对检测分子、离子尺寸的依赖性，实现了大孔径，多孔径的固态纳米孔传感器对病毒核酸的检测，克服了单分子目标物在应用纳米孔传感器检测时过孔速度过快的缺陷，增加检测信号的电流变化幅值。以固态纳米孔为检测工具，不仅具有单分子单颗粒的高灵敏度，操作简单，快速高效，提供了低成本，高灵敏的检测平台，本发明能准确、实时实现对单分子目标物的检测，对生命科学研究中的单分子检测具有重要的指导意义。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的DNA四面体的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图；其中，A为合成DNA四面体的第一条单链ssDNA，B为合成DNA四面体的第二条单链ssDNA，C为合成DNA四面体的第三条单链ssDNA，D为合成DNA四面体的第四条单链ssDNA；
图2为本发明测试例中的待测目标病毒核酸HPV18激活CRISPR-Cas12a剪切系统，剪切单链DNA的示意图；
图3为本发明测试例中的有无被剪切的单链DNA结合制备的DNA四面体和磁球的示意图；
图4为本发明测试例中的固态纳米孔检测平台进行目标病毒核酸HPV18检测的原理图；
图5为本发明测试例中的待测目标病毒核酸HPV18，样品溶液在纳米孔传感器检测过程中产生的特异性电流信号图；
图6为本发明测试例中的纳米孔事件率与溶液中目标物HPV18的浓度的关系图；
图7为本发明测试例中的HPV18和溶液中其他病毒核酸片段在纳米孔中检测到的事件率结果对比图；
图8为本发明测试例中的事件信号源的验证实验图，其中，a为存在不同组分的情况下玻璃状纳米孔的电流信号图；b为典型事件信号的放大图；
图9为本发明测试例中的不同构型的核酸纳米结构在纳米孔传感器检测过程中产生的特异性电流信号图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1核酸纳米结构的制备
本实施例制备了一种核酸纳米结构，采用序列A、B、C、D四条ssDNA合成将核酸纳米结构制备成DNA四面体，A、B、C、D四条ssDNA的核苷酸序列如表1所示，该DNA四面体具有三维空间结构，具体过程为：
(1)将置于EP管的四条序列A、B、C、D的ssDNA干粉分别放置于离心机4000rpm60s短暂离心，溶解于纯水中。按照要求体积加入纯水，使四条ssDNA核苷酸序列的终浓度分别都为100uM。
(2)各取5ul 100uM的A、B、C、D链，溶解在30ul TM buffer(50mM MgCl2 and 20mMTris，pH8.0，25℃)中，使得A、B、C、D链的浓度为10uM。
(3)将装有上述A、B、C、D链混合液的PCR试管放在PCR仪，设置温度95℃5min，30s快速降温至4℃。取出储存在4℃冰箱中6h，得到10uM的DNA四面体，所得的DNA四面体的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1。
表1组成DNA四面体的ssDNA核苷酸序列
Figure BDA0003041063530000071
Figure BDA0003041063530000081
实施例2目标病毒单链核酸的制备
将待测目标病毒核酸加入CRISPR-Cas12a剪切系统，剪切单链DNACRISPR-Cas12a剪切溶液由50nM Cas12a、36nM crRNA和50nM待测病毒核酸组成。
具体制备方法：
(1)将的crRNA干粉、单链DNA和待测物病毒核酸的干粉放在离心机中4000rpm60s短暂离心后，将其分别溶解在纯水中。使crRNA终浓度为20μM，单链DNA和待测病毒核酸终浓度分别为100μM。
crRNA干粉的核苷酸序列为(5’→3’)：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACAAUAUGUGCUUCUACACA(SEQ ID NO.5)。
单链DNA的核苷酸序列为5’biotin-(T80)-CACAAATCCTAAACG3’(SEQ ID NO.6)。
(2)取3.6μl 200nM的crRNA，0.7μl 1μM的Cas12a和5μl 200nM的ssDNA溶解在9.5μl的IDT缓冲中(100mM NaCl，5mM MgCl2，20mM HEPES，和0.1mM EDTA，pH 6.5，25℃)形成CRISPR-Cas12a剪切溶液。将CRISPR-Cas12a剪切溶液在仪器BioRad T100 thermal cycler中设置37℃10min。然后，将1.2μl 10μM的生物素修饰的单链DNA加入CRISPR-Cas12a剪切系统并在37℃下培养30分钟，使得CRISPR-Cas12a剪切系统裂解单链DNA。
实施例3 DNA四面体与病毒核酸复合物的制备
本实施例制备了一种DNA四面体与病毒核酸复合物，具体过程为：
将1μl实施例1中制备的DNA四面体和实施例2中制备的剪切系统溶液混合在室温下孵育30min。取30μl链霉亲和素修饰的磁珠悬浮液转移到干净的PCR管中，并用160μlTM缓冲液洗涤五次。将上述混合溶液加入含有磁珠的PCR管中，在室温下孵育30min，同时轻轻摇晃试管。将反应后的PCR管置于磁铁上，提取10μL上清液，用于纳米孔检测。
实施例4固态纳米孔检测平台进行检测
(1)搭建固态纳米孔检测平台
取内径为0.5mm，外径为1mm的石英玻璃管，将它们浸泡在新鲜制备的食人鱼溶液(VH2SO4：VH2O2＝7：3)中2小时以去除有机杂质后用去离子水清洗石英玻璃管，将清洗后的石英玻璃管放入真空干燥箱中80℃干燥20分钟。然后将处理后的石英玻璃管安装在CO2-laser-actuated pipette puller拉制仪中并设置两段程序：1)Heat 750，Filament 5，Velocity 50，Delay140，and Pull 50；2)Heat 800，Filament 4，Velocity 30，Delay 155，and Pull 250；得到玻璃锥形纳米孔，管内注入1M KCl电解质溶液，将电解质溶液1M KCl溶液加入到检测池的流道内，确保纳米孔为唯一的电解质连通通道，从而形成固态纳米孔检测平台。
(2)采用固体纳米孔检测平台进行检测
将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的检测池和玻璃管中，并连接膜片钳检测系统。
将实施例3中得到的上清液样品加入到检测池中，并施加400mV的偏置电压，确保目标病毒核酸在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。通过检测到阻塞信号，从而实现对目标病毒核酸的检测。
测试例
1、病毒HPV18型的检测
使用本发明实施例1制备的DNA四面体对病毒HPV18型进行检测，实验方法同实施例1-4所述的方法相同。
检测结果如图2-7所示，图2为将待测目标病毒核酸HPV18加入CRISPR-Cas12a剪切系统后激活CRISPR-Cas12a剪切系统，剪切单链DNA的示意图，图3是剪切的单链DNA结合制备的DNA四面体和磁球的示意图；图4是固态纳米孔检测平台进行目标病毒核酸HPV18检测的原理图；图5为加入目标病毒核酸HPV18与未加入目标病毒核酸HPV18在纳米孔传感器检测过程中产生的特异性电流信号图，从图中可以看出，当HPV18存在于分析物溶液中，它将特异性地结合到crRNA，激活Cas12a的反式切割活性，激活的Cas12a将裂解单链DNA连接体，将DNA四面体从磁珠表面释放到溶液中，然后在电场作用下通过纳米孔转移，造成电流阻塞，产生电流阻塞信号，相反，如果HPV18不存在，Cas12a将不具有裂解活性，DNA四面体将不释放到检测溶液中，因此不产生电流阻塞信号；图6是纳米孔事件率与溶液中目标物HPV18的浓度的关系图，从图中可以看出，在不同浓度的HPV18溶液加入到剪切体系中，通过纳米孔传感器检测到的DNA四面体事件率和溶液中HPV18浓度线性关系图。从图中可以看出随着HPV18浓度的增加，溶液中DNA四面体事件率线性提高，DNA四面体事件率和HPV18的浓度成线性关系，可以进行定量分析；图7为本发明HPV18和溶液中其他病毒核酸片段在纳米孔中检测到的检出率的结果对比图，从图中可以看出，剪切系统中crRNA和HPV16、HIV的识别效率远远低于HPV18，进一步说明了crRNA和HPV18的高效特异性，因此，本发明方案制备的DNA四面体固态纳米孔传感器可实现病毒HPV18型的快速，高特异性检测，对病毒的最低检测限为0.5nM。
2、基于DNA四面体的纳米孔传感器过孔事件的原因探究
为了验证过孔事件是由DNA四面体信号传导载体在检测核酸靶向物中的DNA四面体结构变化引起的，进行如下实验：实验组(1)在固态纳米孔检测平台加入包含HPV18靶向Cas12a复合物的样品，同时添加DNA四面体和磁珠(MB)和生物素-DNA(接头)，实验步骤同实施例1-4相同。对照组(1)与实验组的不同之处在于只含有HPV 18靶向物；(2)与实验组的不同之处在于只含有Cas12a复合物；(3)与实验组的不同之处在于只含有DNA四面体；(4)与实验组的不同之处在于只含有DNA四面体和磁珠(MB)和生物素-DNA(接头)。
实验结果如图8所示，从图a中可以看出，对于仅包含HPV 18靶向或Cas12a复合物的样品，未发现过孔事件(电流信号的产生)，表明纳米孔对这些小型生物分子是惰性的。当添加DNA四面体时，可以观察到良好的过孔事件。然后，如果添加了磁珠(MB)和生物素-DNA(接头)，则纳米孔电信号消失，这表明DNA四面体已结合到磁珠的表面并被固定。在有或没有HPV 18靶标的情况下执行完整的转换方法后，观察到两个完全不同的结果。没有靶标时，看不到过孔信号，而有靶标时，可见到过孔信号，信号模式与DNA四面体完全相同，这表明该过孔信号实际上是通过将靶标转化为DNA四面体而引起的。典型检出放大信号如图b所示，从图中可以看出，在CRISPR-cas12a系统的辅助下，利用DNA四面体作为信号传感器，可实现短链ssDNA或dsDNAnanopore传感器，用于HPV 18检测。
3、不同核酸纳米结构对检测电流信号的影响
采用本实施例1的方案将核酸纳米结构分别制备成DNA四面体、六面体、圆柱形和二聚体，制备方法和检测方法同实施例1-4相同，分别使用不同构型的核酸纳米结构对HPV18进行检测。
检测结果如图9所示，从图中可以看出，不同构型的核酸纳米结构均可以作为纳米孔的信号转导载体，产生电信号，检测目标检测物的存在和进行目标检测物的浓度定量。
本发明方案通过设计一个与纳米孔孔径相匹配的核酸纳米结构作为信号传导载体，此型号传到载体具有良好脉冲信号、并且与溶液中可能存在的干扰物有巨大差异，将未知的目标物转化为已知的、标准的信号传导载体，利用信号传导载体过孔的脉冲峰间接定性和定量检测目标物，而不是通过纳米孔直接检测生物分子靶点，使用比检测物尺寸大的固态纳米孔传感器，可实现强抗干扰能力、低堵孔率和可多次重复使用。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 广州大学
<120> 一种核酸纳米结构及其制备方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctggagat acatgcacat tacggctttc cctattagaa ggtctcaggt gcgcgtttcg 60
gtaagtagac gggaccagtt cgcc 84
<210> 2
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcgcacctg agaccttcta atagggtttg cgacagtcgt tcaactagaa tgccctttgg 60
gctgttccgg gtgtggctcg tcgg 84
<210> 3
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccgaggac tcctgctccg ctgcggtttg gcgaactggt cccgtctact taccgtttcc 60
gacgagccac acccggaaca gccc 84
<210> 4
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgtaatgt gcatgtatct ccaggctttc cgcagcggag caggagtcct cggcctttgg 60
gcattctagt tgaacgactg tcgccgttta ggatttgtg 99
<210> 5
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uaauuucuac uaaguguaga uacaauaugu gcuucuacac a 41
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacaaatcct aaacg 15

Claims (11)

1.一种核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构包括四条核酸单链，所述第一单链核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二单链核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三单链核酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第四单链核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构的其中一条单链核酸序列为含粘性末端的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构为四面体、六面体、圆柱形、二聚体中的一种。
4.根据权利要求1～2任一所述的核酸纳米结构的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：先将所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸、第四单链核酸混合后放于90～95℃处理3～8min，20～40s快速降温至2～8℃放置4～8h即得核酸纳米结构。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸和第四单链核酸的摩尔浓度比为(1～3):(1～2):(1～2):(1～4)。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一单链核酸、第二单链核酸、第三单链核酸和第四单链核酸的摩尔浓度比为1：1：1：1。
7.根据权利要求1～3任一所述的核酸纳米结构在制备病毒、细菌或癌症核酸片段检测试剂中的应用。
8.根据权利要求1～3任一所述的核酸纳米结构在制备蛋白质、小分子、离子检测试剂中的应用。
9.根据权利要求1～3任一所述的核酸纳米结构在制备信号转导载体中的应用。
10.一种检测核酸片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、待测目标核酸片段进行剪切得到单链核酸；
S2、步骤S1所得的单链核酸中加入生物素和磁珠；
S3、权利要求1-3任一项所述的核酸纳米结构与步骤S2所得的溶液进行连接；
S4、将步骤S3所得的连接产物溶液进行检测。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，剪切方式采用CRISPR-Cas12a剪切系统、限制性内切酶的一种。
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