CN114216947A - 一种基于dna纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用 - Google Patents

一种基于dna纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用。所述生物传感器包括发夹结构捕获探针DNA H1、发夹结构置换探针DNA H2、发夹结构DNA H3、发夹结构DNA H4、氧化铟锡场效应晶体管。该生物传感器结合生物素‑链霉亲和素新型生物反应放大系统的核酸杂交产物cHCR‑SANTs具有稳定的空间网状结构，且cHCR‑SANTs可向四周不断延伸而不仅是垂直于沟道表面，有效提高了徳拜长度内的核酸杂交效率，从而极大改变了沟道表面的电荷变化，实现超低浓度的目标核酸检测。

Description

一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感 器及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用。
背景技术
新冠病毒的检测至关重要。临床主要针对SARS-CoV-2的抗体和核酸进行检测。SARS-CoV-2抗体检测操作简便、检测快速，但抗体具有一定的窗口期，仅可作为核酸检测的补充手段。核酸检测作为诊断病原体感染的“金标准”，具有早期诊断以及灵敏度和特异性高等特点，适用于无症状感染者的早期筛查以及患者疾病的管控。当前市面上已有的新型冠病毒核酸检测方法有全基因组测序（NGS）、实时荧光反转录酶链式反应（RT-PCR）、CRISPR技术，以及基于等温扩增技术的核酸检测。
其中，NGS技术操作较为复杂、检测时间相对较长(24~72 h)、检测灵敏度相对较低；RT-PCR在操作过程中极易造成气溶胶污染而产生假阳性信号；CRISPR 系统出现时间尚短，仍存在有脱靶的可能，其灵敏度和特异性还有待考证。基于等温扩增技术的核酸检测技术，主要有逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）和切口酶扩增反应（NEAR）技术。其中，RT-LAMP检测程序较复杂、检测时间长(需要花费数小时，且检测结果需要经过复核），常出现假阴性结果；NEAR反应机制复杂，产量易受模板限制，且对于短序列的检测假阳性率高。
常规的场效应晶体管（FET）生物传感器，是在栅极表面固定探针，利用碱基互补配对原则捕获目标核酸，这使得超出徳拜长度的垂直型核酸信号无法检测到。然而在本发明专利中，利用氧化铟锡（ITO）沟道来固定探针，通过结合杂交链反应（HCR）和生物素-链霉亲和素亲和放大系统（BAS）所形成的核酸杂交产物（cHCR-SANTs）具有循环延伸的空间网状结构。这种情况下，核酸产物可向四周不断延伸而不仅是垂直于沟道表面，有效提高了徳拜长度内的核酸杂交效率，从而极大改变了沟道表面的电荷变化，实现超低浓度的目标核酸检测。
本方法相较于其他专利，采用了等温、免标记、无酶参与的杂交链反应（HCR）核酸扩增技术，它是基于两条DNA发夹链同时完成底物识别和信号扩增过程的靶向触发扩增系统，发夹型的DNA结构降低了非特异性杂交的可能性，具有操作简单，检测时间相对较短(约2h)，放大效率高、特异性强等优势；结合基于高选择性、高亲和性的生物素-链霉亲和素（BSA）新型生物反应放大系统，使核酸杂交产物具有不断空间延伸的稳定的网状结构，提高了徳拜长度内的核酸杂交效率；利用易集成、微型化氧化铟锡场效应管作为信号转换器，实现了超低浓度目标物的高灵敏度检测。本发明专利方法有望为即时医疗（point of care）提供一种新型的便携式核酸检测工具。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器，包括以下组件：发夹结构捕获探针DNA H1、发夹结构置换探针DNA H2、发夹结构DNA H3、发夹结构DNA H4、氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）；
所述发夹结构捕获探针DNA H1的核苷酸序列为：5’-CCATAACCTCCACATACCGCAGACGGAATGTCTCCCGTCTGCGGTATGTGGTTTTTTTTTTTTTTT-NH2-3’；
所述发夹结构置换探针DNA H2的核苷酸序列为：5’-GACGGGAGACATTCCGTCTGCGGTATGTGGAATGTCTCTTGTTTGTGGTAACA-3’；
发夹结构DNA H3的核苷酸序列为：5’-Biotin-TTTTTTTTTTTTGTTTGTGGTAACATCTGAAACTGTTACCACAAACAAGAGACATT-3’；
发夹结构DNA H4的核苷酸序列为：5’-GTTTCAGATGTTACCACAAACAAAATGTCTCTTGTTTGTGGTAACATTTTTTTTTT-Biotin-3’；
发夹结构DNA H3及DNA H4的末端分别固定生物素分子，通过生物素-链霉亲和素亲和系统（BSA）制备DNA纳米四合体SANTs；该DNA纳米四合体SANTs是由四条发夹结构DNAH3或四条发夹结构DNA H4，与一个链霉亲和素分子组成，即H3-SANTs或H4-SANTs。
一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器的使用方法，包括以下步骤：
（1）氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）预处理：用氧等离子体预处理氧化铟锡场效应晶体管。
（2）将APTES溶液加入预处理过的氧化铟锡场效应晶体管中；利用APTES处理氧化铟锡场效应晶体管，使沟道上固定上一层氨基连接分子；
（3）将浓度为5 μmol/L的链霉亲和素（SA）溶液分别与发夹结构DNA H3溶液和发夹结构DNA H4溶液混合，室温条件下，反应得到H3-SANTs和H4-SANTs；
（4）将戊二醛与发夹结构DNA捕获探针DNA H1的混合液滴加在氧化铟锡场效应晶体管沟道上避光反应，使沟道上固定发夹结构DNA捕获探针H1溶液；
（5）在固定有发夹结构DNA捕获探针H1的氧化铟锡场效应晶体管沟道上，滴加待测试样本、发夹结构置换探针DNA H2、H3-SANTs和H4-SANTs混合液；孵育反应；
（6）测试氧化铟锡场效应晶体管的I-V曲线。
上述步骤（1）中，所述氧等离子体预处理条件为：氩气与氧气的比例为2:1-5:1，功率10W-50W，处理2-10min。
上述步骤（2）中，所述APTES溶液的浓度为0.1wt%-5wt%，溶剂为无水乙醇和醋酸的混合液，醋酸的含量为1vol%-10vol%，pH值为5-6；室温下反应2-6小时；反应结束后，用无水乙醇、去离子水清洗干净ITO FET；氮气吹干，110-120℃烘烤30-60分钟。
上述步骤（3）中，所述链霉亲和素（SA）溶液、发夹结构DNA H3溶液和发夹结构DNAH4溶液的浓度为20-50μmol/L；链霉亲和素（SA）溶液分别与发夹结构DNA H3溶液和发夹结构DNA H4溶液以 1:4 的体积比例混合，室温条件下，反应 10-20 分钟，得到H3-SANTs和H4-SANTs。
上述步骤（4）中，所述混合液中戊二醛的浓度为1wt%-2wt%；发夹结构DNA捕获探针DNA H1的终浓度为1 μmol/L；湿盒中避光反应1-2小时；反应结束后，用用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干待用。
上述步骤（5）中，所述混合液中发夹结构置换探针DNA H2、H3-SANTs和H4-SANTs的DNA浓度均为1 μmol/L；孵育2小时后，用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干。
上述一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器在SARS-CoV-2核酸检测中的应用。
上述一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器的工作原理（如图1所示）：
Step1：利用APTES处理氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）沟道，使沟道上固定上一层氨基连接分子；
Step2：利用戊二醛在APTES处理后的ITO FET沟道上固定氨基修饰的发夹结构DNA捕获探针H1；固定方法为化学法固定：采用APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）作为连接分子，用戊二醛将APTES分子的氨基与氨基修饰的发夹结构捕获探针DNA H1的氨基耦联。
Step3：用缓冲溶液清洗干净并干燥器件，接着将待测试样本、置换探针H2、DNA纳米四合体H3-SANTs与H4-SANTs混合滴加到ITO FET沟道上进行孵育；当待测试样本中含有目标DNA核酸序列T时，将引发交联杂交链反应（cHCR）；发夹结构DNA置换探针H2是用于置换T-DNA特异性识别发夹结构DNA捕获探针H1所形成的T-H1-DNA复合物中的T-DNA。作为基于杂交链反应（HCR）与生物素-链霉亲和素系统（BSA）的DNA纳米四合体（SANTs）信号探针，由四条生物素标记的发夹DNA H3或H4和一个链霉亲和素组成的DNA纳米四合体H3-SANTs或H4-SANTs组成。
目标核酸序列T-DNA可特异性识别发夹结构捕获探针DNA H1的粘性末端，形成T-H1-DNA复合物，释放出能促进发夹结构置换探针DNA H2序列互补的粘性末端；发夹结构置换探针DNA H2 可置换下目标核酸T-DNA，形成H1-H2-DNA复合物，释放出能促进发夹结构DNA H3序列互补的粘性末端；DNA纳米四合体H3-SANTs与H1-H2-DNA复合物形成H1-H2-H3-SANTs复合物，释放出能促进发夹结构DNA H4序列互补的粘性末端；DNA纳米四合体H4-SANTs与H1-H2-H3-SANTs复合物形成H1-H2-H3-H4-SANTs复合物，释放出能促进发夹结构DNA H3序列互补的粘性末端。此外，在目标DNA核酸序列T-DNA存在的情况下，在每个链霉亲和素上的四条生物素标记的发夹DNA H3均能与H4 发生循环杂交，最终形成了具有空间立体结构的DNA 纳米组装产物，即cHCR-SANTs。而当不存在目标核酸序列T-DNA的情况下，则不发生任何杂交反应。
Step 4：通过观测ITO FET沟道的电流变化，进而实现对待测试样本中SARS-CoV-2核酸的含量测定。
本发明的优点在于：
本发明提供了一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用。本方法相较于其他专利，利用了等温、无酶参与、免标记的杂交链反应（HCR）扩增技术，它是基于两条 DNA 发夹链同时完成底物识别和信号扩增过程的靶向触发扩增系统，具备操作简便、放大效率高、特异性强等优势；基于高选择性、高亲和性的生物素-链霉亲和素（BSA）新型生物反应放大系统使核酸杂交产物具有不断空间延伸的稳定的网状结构，提高了徳拜长度内的核酸杂交效率；采用易集成、微型化、高灵敏度的氧化铟锡场效应管实现了亚阿摩尔量级超低浓度目标物的高灵敏度检测。
附图说明
图1一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器的工作原理图。
图2 64个裸器件在 Vds = 1 V时的转移特性曲线。
图3不同浓度SARS-CoV-2 DNA核酸随漏极电流变化的响应曲线。
图4本发明各DNA寡核苷酸及其核酸杂交产物cHCR-SANTs的琼脂糖凝胶电泳成像图。
图5不同DNA浓度下的特异性响应曲线。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
表1.实验所用的DNA寡核苷酸探针序列
Figure 702725DEST_PATH_IMAGE001
实施例1基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器的灵敏度实验
（1）氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）用氧等离子体处理，氩气与氧气的比例为4：1，功率15 W，处理2 min。
（2）将APTES溶液加入氧等离子体处理过的ITO FET中；APTES的浓度为5wt%，溶剂为无水乙醇和醋酸的混合液，醋酸的含量为10vol%，pH值为5。室温下反应6小时；反应结束后，用无水乙醇、去离子水清洗干净ITO FET；氮气吹干，110℃烘烤30分钟。
（3）用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配制25μmol/L的发夹结构DNA溶液H1、H2、H3、H4，以及链霉亲和素（SA）溶液，4℃冷藏备用。
（4）将链霉亲和素（SA）溶液分别与发夹结构DNA H3溶液和发夹结构DNA H4以1:4的比例混合，室温条件下，反应15 分钟，得到H3-SANTs和H4-SANTs。
（5）采用戊二醛法将捕获探针H1固定在ITO FET的沟道上。取5 μL混合液（H1终浓度为1 μmol/L，戊二醛的浓度为1wt%，）滴加在ITO FET沟道区，湿盒中避光反应1.5小时。反应结束后，用用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干待用；获得在固定有捕获探针H1的ITO FET。
（6）在固定有捕获探针H1的ITO FET沟道上，滴加5 μL 待测试样本、H2、H3-SANTs和H4-SANTs混合液；其中，H2、H3-SANTs和H4-SANT的DNA浓度均为1 μmol/L，待测试样本为用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配置梯度浓度的目标序列T-DNA即SARS-CoV-2 DNA（核酸序列为5’-CCGTCTGCGGTATGTGGAA AGGTTATGG-3’），样本浓度分别为0、10zM、100zM、100aM、100fM、100pM、100nM；做梯度浓度实验，孵育2小时后，用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干，待测。
（7）测试处理完毕后的ITO FET的I-V曲线。
氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）的电特性实验：随机选取64个表面干净且完整的裸器件，在Vds = 1 V时，测试ITO FET的Ids-Vgs转移特性曲线，结果如图2所示。
64个裸器件在 Vds = 1 V时的转移特性曲线如图2所示；不同浓度SARS-CoV-2DNA核酸随电极电流变化的响应曲线结果如图3所示，随着目标T-DNA浓度的不断增大，电流值越来越小，表明核酸杂交产物在不断地形成，所带负电荷使沟道势垒高度增加，阻碍了沟道内的载流子从源到漏传输。
实施例2基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器
（1）氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）用氧等离子体处理，氩气与氧气的比例为2：1，功率10 W，处理10min。
（2）将APTES溶液加入氧等离子体处理过的ITO FET中；APTES的浓度为5wt%，溶剂为无水乙醇和醋酸的混合液，醋酸的含量为1vol%，pH值为6。室温下反应4小时；反应结束后，用无水乙醇、去离子水清洗干净ITO FET；氮气吹干，120℃烘烤30分钟。
（3）用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配制20 μmol/L的DNA溶液H1、H2、H3、H4，以及链霉亲和素（SA）溶液，4℃冷藏备用。
（4）将20 μmol/L链霉亲和素（SA）溶液与生物素化 DNA 探针（H3/H4）以1:4 的比例混合，室温条件下，反应 10分钟，得到H3-SANTs和H4-SANTs。
（5）采用戊二醛法将捕获探针H1固定在ITO FET的沟道上。取5 μL混合液（H1终浓度为1 μmol/L，戊二醛的浓度为2wt%）滴加在ITO FET沟道区，湿盒中避光反应1小时；反应结束后，用用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干待用；获得在固定有捕获探针H1的ITO FET。
（6）在固定有捕获探针H1的ITO FET沟道上，滴加5 μL 待测试样本、H2、H3-SANTs和H4-SANTs混合液；其中，H2、H3-SANTs和H4-SANT的DNA浓度均为1 μmol/L，待测试样本为用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配置梯度浓度的目标序列T-DNA即SARS-CoV-2 DNA（核酸序列为5’-CCGTCTGCGGTATGTGGAA AGGTTATGG-3’），样本浓度为100aM；做梯度浓度实验，孵育2小时后，用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干，待测。
（7）测试处理完毕后的ITO FET的I-V曲线。
实施例3基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器
（1）氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）用氧等离子体处理，氩气与氧气的比例为5：1，功率50W，处理6min；
（2）将APTES溶液加入氧等离子体处理过的ITO FET中；APTES的浓度为2wt%，溶剂为无水乙醇和醋酸的混合液，醋酸的含量5vol%，pH值为6。室温下反应6小时；反应结束后，用无水乙醇、去离子水清洗干净ITO FET；氮气吹干，115℃烘烤45分钟；
（3）用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配制50 μmol/L的DNA溶液H1、H2、H3、H4，以及链霉亲和素（SA）溶液，4℃冷藏备用；
（4）将链霉亲和素（SA）溶液与生物素化 DNA 探针（H3/H4）以 1:4 的比例混合，室温条件下，反应15分钟，得到H3-SANTs和H4-SANTs；
（5）采用戊二醛法将捕获探针H1固定在ITO FET的沟道上。取5 μL混合液（H1终浓度为1 μmol/L，戊二醛的浓度为1.5wt%）滴加在ITO FET沟道区，湿盒中避光反应2小时。反应结束后，用用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干待用；获得在固定有捕获探针H1的ITO FET；
（6）在固定有捕获探针H1的ITO FET沟道上，滴加5 μL 待测试样本、H2、H3-SANTs和H4-SANTs混合液；其中，H2、H3-SANTs和H4-SANTs的DNA浓度均为1 μmol/L，待测试样本为用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配置梯度浓度的目标序列T-DNA即SARS-CoV-2 DNA（核酸序列为5’-CCGTC TGCGGTATGTGGAA AGGTTATGG-3’），样本浓度为100aM；做梯度浓度实验，孵育2小时后，用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干，待测；
（7）测试处理完毕后的ITO FET的I-V曲线。
实施例4核酸杂交产物cHCR-SANTs的形成
（1）淬火处理：分别将DNA溶液H1、H2、H3、H4置于95 ℃加热5分钟后，迅速置于冰水浴中冷却 30 分钟，最后将DNA链放置于 4 °C 冰箱保存、备用。所有DNA的缓冲溶液为5 ×SSC，终浓度为10 μM 。
（2）H3-SANTs和H4-SANTs的制备：将链霉亲和素（SA）溶液与生物素化 DNA 探针（H3或H4）以 1:4 的比例混合，室温条件下，反应15分钟，得到H3-SANTs和H4-SANTs；
（3）T+H1+H2+H3-SANTs+H4-SANTs产物的形成：将配置好的H1、H2、H3-SANTs、H4-SANTs和T-DNA置于5 × SSC缓冲溶液中，37℃条件下反应2h，其中，T、H1、H2、H3-SANTs、H4-SANTs浓度分别均为1μM。
（4）3.5% 凝胶制备：称取 3.5 g 琼脂糖，加入0.5×TBE 缓冲溶液 100 mL，在微波炉中加热融化至溶液呈澄清透明状；加入 10 μL 4S GelRed 核酸染料，摇晃、震荡或翻转保证染色剂充分混合；静置至溶液气泡消失后，铺胶；等待自然凝固后，用铝膜避光，放置-4 ℃冰箱保存、备用。
（5）取 10 μL 待电泳样品，加入 2.5 μL 6 × loading buffer，混合、振匀；加入凝胶进样孔中。取 6 μL DNA marker。
（6）向电泳槽内加入电泳缓冲液（0.5 × TBE缓冲溶液 500 mL ），至少淹没过凝胶2 mm。将加有样品的凝胶轻轻放入电泳槽中。
（7）在 110 V 恒定电压条件下电泳 70 min。结束后，在凝胶成像系统上观察电泳条带并拍照。结果如图4所示。相较于H3和H4泳道，H3-SANTs和H4-SANT泳道分别产生了新的分子量较大的条带，表明了生物素化H3和H4分别与链霉亲和素（SA）结合生成了H3-SANTs和H4-SANT产物；而T+H1+H2+H3-SANTs+H4-SANTs泳道，产生了泳道口堵塞以及拖带现象，表明反应形成了分子量很大的cHCR-SANTs产物。
实施例5基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器的特异性实验
（1）氧化铟锡场效应晶体管（ITO FET）用氧等离子体处理，氩气与氧气的比例为4：1，功率15 W，处理2 min。
（2）将APTES溶液加入氧等离子体处理过的ITO FET中；APTES的浓度为5wt%，溶剂为无水乙醇和醋酸的混合液，醋酸的含量为10vol%，pH值为5。室温下反应6小时；反应结束后，用无水乙醇、去离子水清洗干净ITO FET；氮气吹干，110℃烘烤30分钟。
（3）用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配制25 μmol/L的DNA溶液H1、H2、H3、H4，以及链霉亲和素（SA）溶液，4℃冷藏备用。
（4）将链霉亲和素（SA）溶液与生物素化 DNA 探针（H3/H4）以 1:4 的比例混合，室温条件下，反应15分钟，得到H3-SANTs和H4-SANTs。
（5）采用戊二醛法将捕获探针H1固定在ITO FET的沟道上。戊二醛的浓度为1wt%，取5 μL混合液（H1终浓度为1 μmol/L）滴加在ITO FET沟道区，湿盒中避光反应1.5小时，反应结束后，用用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干待用；获得在固定有捕获探针H1的ITO FET。
（6）在固定有捕获探针H1的ITO FET沟道上，滴加5 μL 待测试样本、H2、H3-SANTs和H4-SANTs混合液；其中，H2、H3-SANTs和H4-SANT的DNA浓度均为1 μmol/L，待测试样本为用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液配置的互补目标DNA（即T-DNA：5’-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3’，与发夹结构捕获探针DNA H1的粘性末端序列完全互补）及非互补DNA（即5’-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCTAA-3’），浓度各均为1pM、10pM、100pM、10nM；做梯度浓度实验，孵育2小时后，用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干，待测。
（7）测试处理完毕后的ITO FET的I-V曲线，结果如图5所示。随着待测试样本浓度的不断增大，加入互补目标DNA的响应随之增大，而加入非互补DNA的响应几乎不变，表明了基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器具有良好的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> DNA H1
<400> 1
ccataacctc cacataccgc agacggaatg tctcccgtct gcggtatgtg gttttttttt 60
tttttt 66
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> DNA H2
<400> 2
gacgggagac attccgtctg cggtatgtgg aatgtctctt gtttgtggta aca 53
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> DNA H3
<400> 3
tttttttttt ttgtttgtgg taacatctga aactgttacc acaaacaaga gacatt 56
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> DNA H4
<400> 4
gtttcagatg ttaccacaaa caaaatgtct cttgtttgtg gtaacatttt tttttt 56
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> T-DNA
<400> 5
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 非互补DNA
<400> 6
caggtggaac ctcatcagga gatgctaa 28

Claims (8)

1.一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器，其特征在于，包括以下组件：发夹结构捕获探针DNA H1、发夹结构置换探针DNA H2、发夹结构DNA H3、发夹结构DNA H4、氧化铟锡场效应晶体管；
所述发夹结构捕获探针DNA H1的核苷酸序列为：5’-CCATAACCTCCACATACCGCAGACGGAATGTCTCCCGTCTGCGGTATGTGGTTTTTTTTTTTTTTT-NH2-3’；
所述发夹结构置换探针DNA H2的核苷酸序列为：5’-GACGGGAGACATTCCGTCTGCGGTATGTGGAATGTCTCTTGTTTGTGGTAACA-3’；
发夹结构DNA H3的核苷酸序列为：5’-Biotin-TTTTTTTTTTTTGTTTGTGGTAACATCTGAAACTGTTACCACAAACAAGAGACATT-3’；
发夹结构DNA H4的核苷酸序列为：5’-GTTTCAGATGTTACCACAAACAAAATGTCTCTTGTTTGTGGTAACATTTTTTTTTT-Biotin-3’；
发夹结构DNA H3及DNA H4的末端分别固定生物素分子，通过生物素-链霉亲和素亲和系统（BSA）制备DNA纳米四合体SANTs；该DNA纳米四合体SANTs是由四条发夹结构DNA H3或四条发夹结构DNA H4，与一个链霉亲和素分子组成，即H3-SANTs或H4-SANTs。
2.一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氧化铟锡场效应晶体管预处理：用氧等离子体预处理氧化铟锡场效应晶体管；
（2）将APTES溶液加入预处理过的氧化铟锡场效应晶体管中；利用APTES处理氧化铟锡场效应晶体管，使沟道上固定上一层氨基连接分子；
（3）将链霉亲和素溶液分别与发夹结构DNA H3溶液和发夹结构DNA H4溶液混合，室温条件下，反应得到H3-SANTs和H4-SANTs；
（4）将戊二醛与发夹结构DNA捕获探针DNA H1的混合液滴加在氧化铟锡场效应晶体管沟道上避光反应，使沟道上固定发夹结构DNA捕获探针H1溶液；
在固定有发夹结构DNA捕获探针H1的氧化铟锡场效应晶体管沟道上，滴加待测试样本、发夹结构置换探针DNA H2、H3-SANTs和H4-SANTs混合液，孵育反应；
（6）测试氧化铟锡场效应晶体管的I-V曲线。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述氧等离子体预处理条件为：氩气与氧气的比例为2:1-5:1，功率10W-50W，处理2-10min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述APTES溶液的浓度为0.1wt%-5wt%，溶剂为无水乙醇和醋酸的混合液，醋酸的含量为1vol%-10vol%，pH值为5-6；室温下反应2-6小时；反应结束后，用无水乙醇、去离子水清洗干净ITO FET；氮气吹干，110-120℃ 烘烤30-60分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述链霉亲和素溶液、发夹结构DNA H3溶液和发夹结构DNA H4溶液的浓度为20-50μmol/L；链霉亲和素（SA）溶液分别与发夹结构DNA H3溶液和发夹结构DNA H4以 1:4 的体积比例混合，室温条件下，反应 10-20分钟，得到H3-SANTs和H4-SANTs。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述混合液中戊二醛的浓度为1wt%-2wt%；发夹结构DNA捕获探针DNA H1的终浓度为1 μmol/L；湿盒中避光反应1-2小时；反应结束后，用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干待用。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述发夹结构置换探针DNAH2、H3-SANTs和H4-SANTs的DNA浓度均为1 μmol/L；孵育2小时后，用pH=7.4的1×PBS缓冲溶液清洗干净ITO FET，氮气吹干。
8.权利要求1所述一种基于DNA纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器在SARS-CoV-2核酸检测中的应用。
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