CN110274941B - 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents
利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110274941B CN110274941B CN201910647121.8A CN201910647121A CN110274941B CN 110274941 B CN110274941 B CN 110274941B CN 201910647121 A CN201910647121 A CN 201910647121A CN 110274941 B CN110274941 B CN 110274941B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- probe
- solution
- sequence
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法,利用了DNA与RNA碱基互补配对原则,首先,设计了具有发夹结构的功能探针,当目标物(待测样品microRNA)存在时,特异性核酸内切酶(DSN酶)切割DNA‑RNA杂交体的DNA部分得到8‑17DNAzyme。然后,8‑17DNAzyme能特异性识别固定在电极表面的H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点进行切割。最后,电极表面被DNAzyme特异性切割后与电极表面相连的DNA序列依次与序列Link1、Link2、H3和H4自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。所建立的方法灵敏度高,可用于复杂体系的microRNA的直接检测。
Description
技术领域
本发明涉及电化学检测技术领域,具体提供了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法。
背景技术
microRNA是一种小的非蛋白编码RNA分子,通过与靶mRNA中的合成序列结合,从而抑制转录后基因表达。microRNA在许多生物学过程中发挥着重要的作用,并与各种疾病,尤其是癌症相关。microRNA被认为是癌症诊断、预后和治疗监测的潜在生物标志物。因此,开发灵敏度高、选择性好的检测策略是生物医学研究的迫切需求,尤其是对癌症的早期诊断和药物新靶点的发现有重要意义。
目前,microRNA的传统检测方法主要有三种,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、诺瑟杂交(Northern blot)和高通量测序。qRT-PCR方法基于基因扩增阳离子技术,具有较高的检测灵敏度,但由于抑制剂、热误差和标本间交叉污染等直接影响检测结果的准确性,限制了qRT-PCR的进一步应用。而northern blotting和高通量测序,则需要进行一系列复杂的操作,耗时长,且检测灵敏度较低。
本发明公开了一种超灵敏的检测方法,利用双特异性核酸内切酶及和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法,并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用双特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法,并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测方法。所述方法是通过便捷,灵敏的信号放大策略,利用特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme的特异性切割后进行DNA自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。所建立的方法具有高的灵敏度,可用于复杂体系的microRNA的直接检测。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
包括以下步骤:首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1;双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分,H1探针被切割得到8-17DNAzyme序列,而microRNA被释放出来继续与未反应的H1探针杂交循环切割,实现第一次目标循环;然后将发夹探针H2固定在金电极上;当金属离子存在时,前述8-17DNAzyme会特异性识别H2 序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割,H2探针被切断成两部分,一部分与电极相连,一部分为游离的碱基序列,同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大;电极表面的H2被DNAzyme切断后,依然有部分碱基序列固定在电极表面上,这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装,形成一条dsDNA链;最后,六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上,通过检测六氨合钌的电化学信号,实现对microRNA的超灵敏检测。
具体步骤为:
(1)针对目标microRNA设计功能探针H1,所述探针为发夹结构的DNA探针,序列结构为从5'端到3'端依次为颈部1、环部1、环部2、环部3、颈部2序列。所述的第一部分为自由序列颈部1和环部1序列,所述的第二部分环部2为能特异性识别目标microRNA并与之杂交的序列,所述第三组成部分环部3和颈部2碱基序列为8-17DNAzyme,能在金属Mg2+离子存在时,特异性识别固定在电极表面的捕获探针H2(该发夹探针5'端修饰巯基)并切割序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点。
(2)双特异性核酸内切酶(DSN酶)特异性切割:将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min(其中DSN缓冲液包含:0.2U DSN,50 mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1 mM DTT,pH 8.0),使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分,得到8-17DNAzyme序列,并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割,实现目标循环放大。
(3)电极预处理:将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液(98%硫酸和30%双氧水按3:1的体积混合)浸泡,然后依次用0.3μm和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨,然后用超纯水冲洗干净,分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min,然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中,在-0.35-1.6V电位下扫描,直到在0.95V左右出现一个尖锐的还原峰,在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰,用超纯水冲洗电极,氮气吹干,备用。
(4)捕获探针H2的固定:在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP的pH 8.0、10mM Tris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液,得到捕获探针H2固定液。将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面,室温孵育120min,H2可通过S-Au键固定在电极表面,再用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干。
(5)电极表面空白位点封闭:将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤(4)所得电极表面,室温孵育120min,封闭电极表面的非特异性活性位点,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干。
(6)8-17DNAzyme的切割循环:将步骤(2)微量离心管中的溶液滴加于步骤(5)处理好的电极表面,孵育90min,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗,氮气吹干。步骤(2)反应得到的8-17DNAzyme序列可以在金属Mg2+离子存在时,特异性识别固定在电极表面的H2探针形成杂交体,切割H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点, H2探针被切断成两部分,一部分与电极相连,一部分为游离的碱基序列,不再与8-17DNAzyme结合,游离的8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面H2探针,实现第二次循环放大。
(7)DNA自组装电化学生物传感器的构建:电极表面的H2被DNAzyme切断后,依然有部分碱基序列固定在电极表面上,这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装,形成一条dsDNA链。具体操作是将步骤(6)得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后,依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液,10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液,10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液,分别反应90min、90min和120min,超纯水冲洗,氮气吹干。
(8)电化学检测microRNA信号:将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气,步骤(7)所得电极置于电化学工作检测液中,电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描。
DNA预处理:所有探针在使用前要经过预处理。处理方法为将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000rpm,离心5min,加入适量默克水,得到DNA浓度为100μM的溶液,再用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至10μM。具有发夹结构的DNA均在95℃加热5min,然后插入冰中半小时,使探针形成发夹结构。
双功能探针H1溶液的制备:5μL 10μM的H1探针溶液溶于5μL 的含200mM NaCl的pH8.0 100 mM Tris-HCl缓冲液。疏基己醇溶液的制备:取疏基己醇加至超纯水中,制成2mM的疏基己醇封闭剂,冰箱4℃保存,备用。
杂交探针缓冲液的制备:将0.5μL 10μM、的H3探针溶液和0.5μL 10μM的H4探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。
连接探针Link1缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link1探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2的pH 8. 0 10mM Tris-HCl缓冲液。
连接探针Link2缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link2探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。
DSN缓冲液:0.2U DSN (DSN酶溶于50% DSN storage buffer和50%甘油 )、50 mMTris-HCl,10mM MgCl2,1 mM DTT,pH 8.0。
电化学检测液的制备:pH 8.0的10mM Tris-HCl中含有10μM六氨合钌,混匀,冰箱4℃保存,备用。
电化学工作站为CHI660C,采用三电极系统,工作电极是金电极,对电极是铂丝电极,参比电极是银/氯化银电极。冲洗电极所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
本发明所用试剂均市售可得。
本发明适用于肿瘤细胞中microRNA-141的检测。
本发明的优点在于:
本发明提供的一种利用双特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme切割循环的DNA自组装电化学生物传感器制备方法,巧妙设计实验方案,将生物信号转化为电化学信号,实现对目标物检测信号的多次放大,microRNA的检测限低至1fmol,实现了对肿瘤标志物microRNA-141的高灵敏检测。该检测方法具有高度的选择性,具有广阔的应用前景,具有高度特异性。
附图说明
图1.为本发明的构建流程示意图。
图2.为实施例中不同浓度目标物的电流响应。
图3.为实施例中不同浓度目标物的电流响应标准曲线图。
图4.为分析方法的特异性(a)空白、 (b) microRNA-200a、 (c) microRNA-429、(d)单碱基错配的microRNA -141和(e) microRNA-141的选择性。
具体实施方式
实施例1、检测待测样品中是否含有microRNA-141
图1为本发明的构建流程示意图
下面实施例采用microRNA-141为待测microRNA,microRNA-141的核苷酸序列为UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG。
一、待测样品
本发明的实施例采用的是浓度为1fM至10pM的一系列溶液作为待测样本,本发明的待测样本也可以来源于血浆或血清,具体方法如下:
所有电化学检测均在 CHI660C 电化学工作站上进行。三电极系统包括:完成 DNA自组装的金电极(工作电极),铂丝电极(对电极),银-氯化银(Ag/AgCl)参比电极。电化学检测在六氨合钌(RuHex)溶液中进行。先将 RuHex 溶液通氮除氧 15 min,再将完成组装的电极浸泡其中2 min,使溶液中带正电的 RuHex通过静电作用吸附到带负电荷的 DNA 磷酸骨架上。然后用方波伏安法进行扫描,扫描电位范围-0.6 ~ 0 V,脉冲幅度 0.05 V,脉冲宽度0.05 s。
二、一种利用双特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme切割循环的DNA自组装电化学生物传感器制备检测microRNA-141的方法
(1)针对目标microRNA设计双功能探针H1,所述探针为发夹结构的DNA探针;设计固定在电极表面的探针H2,该发夹探针5'端修饰巯基;
(2)双特异性核酸内切酶(DSN酶)特异性切割:将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min;使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分,得到8-17DNAzyme序列,并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割,实现目标循环放大;其中DSN缓冲液包含:0.2U DSN,50 mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1 mM DTT,pH 8.0;
(3)电极预处理:将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液浸泡,然后依次用0.3μm和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨,然后用超纯水冲洗干净,分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min,然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中,在-0.35-1.6V电位下扫描,直到在0.95V出现一个尖锐的还原峰,在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰,用超纯水冲洗电极,氮气吹干,备用;食人鱼溶液为98%硫酸和30%双氧水按3:1的体积混合;
(4)捕获探针H2的固定:在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP、pH 8.0的10mM Tris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液,得到捕获探针H2固定液;将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面,室温孵育120min,H2可通过S-Au键固定在电极表面,再用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;
(5)电极表面空白位点封闭:将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤(4)所得电极表面,室温孵育120min,封闭电极表面的非特异性活性位点,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;
(6)8-17DNAzyme的切割循环:将步骤(2)微量离心管中的溶液滴加于步骤(5)处理好的电极表面,孵育90min,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗,氮气吹干;
(7)DNA自组装电化学生物传感器的构建:将步骤(6)得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后,依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液,10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液,10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液,分别反应90min、90min和120min,超纯水冲洗,氮气吹干;
(8)电化学检测microRNA信号:将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气,再将步骤(7)所得电极置于电化学检测液中,电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描检测。
DNA预处理:所有探针在使用前要经过预处理。处理方法为:将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000rpm,离心5min,加入适量默克水,得到DNA浓度为100μM的溶液,再用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至10μM。具有发夹结构的DNA均在95℃加热5min,然后插入冰中半小时,使探针形成发夹结构。
双功能探针H1溶液的制备:5μL 10μM的H1探针溶液溶于5μL 的含200mM NaCl的pH8.0 100 mM Tris-HCl缓冲液。
捕获探针H2固定液的制备:将含有1μL10μM的H2探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM EDTA、10mM TCEP的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。
疏基己醇溶液的制备:取疏基己醇加至超纯水中,制成2mM的疏基己醇封闭剂,冰箱4℃保存,备用。
杂交探针缓冲液的制备:将0.5μL 10μM的H3探针溶液和0.5μL 10μM的H4探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。
连接探针Link1缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link1探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2的pH 8. 0 10mM Tris-HCl缓冲液。
连接探针Link2缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link2探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。
DSN缓冲液:0.2U DSN (DSN酶溶于50% DSN storage buffer和50%甘油 )、50 mMTris-HCl,10mM MgCl2,1 mM DTT,pH 8.0。
所述探针H1序列为:CACCCACTACCCATCTTTACCAGACAGTGTTACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTG;
所述探针H2为:SHCH2CH2CH2CH2CH2CH2TTTTTCCACCACATTCAAATTCACCAACTATrAGGAAGAGATGTTACGAGGCGGTGGTGG;
所述Link1序列为:CCA ACTAAC CCCATATAGTTGGTGAAT;
所述Link2序列为:ATGGGGTTAGTT GGATCGCCT CATACTGTCTCAAGG ACCACCGCAT;
所述H3序列为:TCTCAAGGACCACCGCAT CTCTAC ATGCGGTGGTCCTTGAGA CAGTATGAGGCG A;
所述H4序列为:GTAGAG ATGCGGTGGTCCTTGAGA TCGCCT CATACTGTCTCAAGGACCACCGCAT。
电化学检测液的制备:pH 8.0的10mM Tris-HCl中含有10μM的六氨合钌,混匀,冰箱4℃保存,备用。
电化学工作站为CHI660C,采用三电极系统,工作电极是金电极,对电极是铂丝电极,参比电极是银/氯化银电极。冲洗电极所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
检测结果如图2所示,在1fM到10pM范围内,随着目标物浓度的增大,电化学信号增强,电流响应值增大。图3为本实施例的电流响应标准曲线。
实施例2
为了评估本发明方法的特异性,用相同的实施例1实验步骤对几条不同序列的microRNA(包含(a)空白 (b) microRNA-200a(序列UAACACUGUCUGGUAACGAUGU), (c)microRNA-429(序列UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU),(d)单碱基错配microRNA-141(序列UAACACUGUCUCGUAAAGAUGG), (e) microRNA-141。microRNA-141的浓度为10pM 进行检测。
检测结果如图4所示, 10pM microRNA-141(e)产生的电化学信号明显高于其他样品。该结果表明,此方法具有很高的序列特异性,有望用于识别不同的microRNA序列。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacccactac ccatctttac cagacagtgt tacatctctt ctccgagccg gtcgaaatag 60
tgggtg 66
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttccacc acattcaaat tcaccaacta traggaagag atgttacgag gcggtggtgg 60
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaactaacc ccatatagtt ggtgaat 27
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggggttag ttggatcgcc tcatactgtc tcaaggacca ccgcat 46
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctcaaggac caccgcatct ctacatgcgg tggtccttga gacagtatga ggcga 55
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtagagatgc ggtggtcctt gagatcgcct catactgtct caaggaccac cgcat 55
Claims (5)
1. 一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1;双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分, H1探针被切割得到游离的8-17DNAzyme序列,而microRNA被释放出来继续与未反应H1探针杂交循环切割,实现第一次目标循环;然后将发夹探针H2固定在金电极上;当金属离子存在时,前述8-17DNAzyme会特异性识别H2 序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割,H2探针被切断成两部分,一部分与电极相连,一部分为游离的碱基序列,同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大;电极表面的H2被DNAzyme切断后,依然有部分碱基序列固定在电极表面上,这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装,形成一条dsDNA链;最后,六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上,通过检测六氨合钌的电化学信号,实现对microRNA的超灵敏检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)针对目标microRNA设计双功能探针H1,所述探针为发夹结构的DNA探针;设计固定在电极表面的探针H2,该发夹探针5'端修饰巯基;
(2)DSN酶特异性切割:将6μL含有不同浓度microRNA的DSN酶缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min;使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分,得到8-17DNAzyme序列,并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割,实现目标循环放大;其中DSN酶缓冲液包含:0.2U DSN酶,50 mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1 mM DTT,pH 8.0;
(3)电极预处理:将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液浸泡,然后依次用0.3μm和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨,然后用超纯水冲洗干净,分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min,然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中,在-0.35-1.6V电位下扫描,直到在0.95V出现一个尖锐的还原峰,在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰,用超纯水冲洗电极,氮气吹干,备用;食人鱼溶液为98%硫酸和30%双氧水按3:1的体积混合;
(4)捕获探针H2的固定:在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP、pH 8.0的10mMTris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液,得到捕获探针H2固定液;将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面,室温孵育120min,H2通过S-Au键固定在电极表面,再用10mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;
(5)电极表面空白位点封闭:将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤(4)所得电极表面,室温孵育120min,封闭电极表面的非特异性活性位点,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;
(6)8-17DNAzyme的切割循环:将步骤(2)微量离心管中的溶液滴加于步骤(5)处理好的电极表面,孵育90min,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗,氮气吹干;
(7)DNA自组装电化学生物传感器的构建:将步骤(6)得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后,依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液,10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液,10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液,分别反应90min、90min和120min,超纯水冲洗,氮气吹干;
(8)电化学检测microRNA信号:将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气,再将步骤(7)所得电极置于电化学检测液中,电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描检测。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述探针H1序列为:CACCCACTACCCATCTTTACCAGACAGTGTTACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTG;
所述探针H2为:SHCH2CH2CH2CH2CH2CH2TTTTTCCACCACATTCAAATTCACCAACTATrAGGAAGAGATGTTACGAGGCGGTGGTGG;
所述Link1序列为:CCA ACTAAC CCCATATAGTTGGTGAAT;
所述Link2序列为:ATGGGGTTAGTT GGATCGCCT CATACTGTCTCAAGG ACCACCGCAT;
所述H3序列为:TCTCAAGGACCACCGCAT CTCTAC ATGCGGTGGTCCTTGAGA CAGTATGAG GCGA;
所述H4序列为:GTAGAG ATGCGGTGGTCCTTGAGA TCGCCT CATACTG TCTCAAGGACCACCGCAT。
4.如权利要求1或2所述方法制备获得电化学生物传感器。
5.如权利要求4所述电化学生物传感器用于microRNA的检测。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910647121.8A CN110274941B (zh) | 2019-07-17 | 2019-07-17 | 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910647121.8A CN110274941B (zh) | 2019-07-17 | 2019-07-17 | 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110274941A CN110274941A (zh) | 2019-09-24 |
CN110274941B true CN110274941B (zh) | 2020-07-07 |
Family
ID=67964621
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910647121.8A Active CN110274941B (zh) | 2019-07-17 | 2019-07-17 | 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110274941B (zh) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110591904A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-20 | 福州大学 | 一种用于miRNA检测的装置 |
CN110951842A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-04-03 | 浙江大学 | 基于电化学检测人血清中miR-100的探针及方法 |
CN110982878B (zh) * | 2019-11-29 | 2023-06-13 | 华南师范大学 | CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用 |
CN113061649B (zh) * | 2021-04-02 | 2022-07-08 | 福州大学 | 检测microRNA的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法 |
CN113237936B (zh) * | 2021-05-08 | 2023-05-05 | 贵州省人民医院 | 基于邻位触及催化发卡探针自组装和金属有机框架的靶序列lncARSR电化学检测方法 |
CN113897418B (zh) * | 2021-06-28 | 2023-08-22 | 华中科技大学 | 检测dna点突变的探针、试剂盒及应用 |
CN113960142B (zh) * | 2021-10-25 | 2023-11-10 | 福州大学 | 一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法 |
CN114216947B (zh) * | 2021-12-16 | 2023-11-10 | 福州大学 | 一种基于dna纳米四合体的氧化铟锡场效应晶体管生物传感器及其应用 |
CN116732211B (zh) * | 2023-08-09 | 2023-10-27 | 湖南工程学院 | 基于8-17脱氧核酶与CRISPR-Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108426932A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-08-21 | 福州大学 | 一种基于三链连环dna的电化学生物传感器及制备方法 |
CN108519417A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-11 | 湖南文理学院 | 一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途 |
-
2019
- 2019-07-17 CN CN201910647121.8A patent/CN110274941B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108519417A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-11 | 湖南文理学院 | 一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途 |
CN108426932A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-08-21 | 福州大学 | 一种基于三链连环dna的电化学生物传感器及制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
An ultrasensitive label-free electrochemical biosensor for microRNA-21 detection based on a 2′-O-methyl modified DNAzyme and duplex-specific nuclease assisted target recycling;Xi Zhang et al.;《Chemical Communications》;20140826;第50卷(第82期);全文 * |
Branched Hybridization Chain Reaction Circuit for Ultrasensitive Localizable Imaging of mRNA in Living Cells;Lan Liu et al.;《Anal. Chem.》;20180104;第90卷(第3期);全文 * |
DNA生物传感器研究进展;陈宪 等;《福州大学学报(自然科学版)》;20121009;第40卷(第5期);全文 * |
Electrochemical DNA sensing strategy based on strengthening electronic conduction and a signal amplifier carrier of nanoAu/MCN composited nanomaterials for sensitive lead detection;Guangming Zeng et al.;《Environmental Science: Nano》;20161109;第3卷(第6期);全文 * |
Sensitive and Convenient Detection of microRNAs Based on Cascade Amplification by Catalytic DNAzymes;Dr. Tian Tian et al.;《Chem. Eur. J.》;20121207;第19卷(第1期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110274941A (zh) | 2019-09-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110274941B (zh) | 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法 | |
Zhang et al. | A ratiometric electrochemical biosensor for the exosomal microRNAs detection based on bipedal DNA walkers propelled by locked nucleic acid modified toehold mediate strand displacement reaction | |
Dai et al. | Recent advances on electrochemical biosensing strategies toward universal point‐of‐care systems | |
Ji et al. | Binding-induced DNA walker for signal amplification in highly selective electrochemical detection of protein | |
Miao et al. | Ultrasensitive detection of microRNA through rolling circle amplification on a DNA tetrahedron decorated electrode | |
WO2022095373A1 (zh) | 一种检测miRNA的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系 | |
Ge et al. | Electro-grafted electrode with graphene-oxide-like DNA affinity for ratiometric homogeneous electrochemical biosensing of microRNA | |
Zhang et al. | An ultrasensitive label-free electrochemical biosensor for microRNA-21 detection based on a 2′-O-methyl modified DNAzyme and duplex-specific nuclease assisted target recycling | |
WO2016062101A1 (zh) | 检测ndm-1的修饰电极及其制备方法和应用 | |
CN110106232B (zh) | 基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法 | |
CN111440851B (zh) | 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用 | |
CN106755460B (zh) | 一种单碱基突变检测方法 | |
Miao et al. | Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA | |
Deng et al. | Target-triggered cascade signal amplification for sensitive electrochemical detection of SARS-CoV-2 with clinical application | |
Xie et al. | A novel electrochemical aptasensor for highly sensitive detection of thrombin based on the autonomous assembly of hemin/G-quadruplex horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme nanowires | |
Yang et al. | Ultrasensitive electrochemical detection of miRNA based on DNA strand displacement polymerization and Ca 2+-dependent DNAzyme cleavage | |
Zhang et al. | A novel electrochemical biosensor for exosomal microRNA-181 detection based on a catalytic hairpin assembly circuit | |
CN108588203B (zh) | 一种基于dna酶的荧光检测试剂盒及其在核酸检测中的应用 | |
Li et al. | An electrochemical microRNA biosensor based on protein p19 combining an acridone derivate as indicator and DNA concatamers for signal amplification | |
Ciui et al. | Bioelectrochemistry for miRNA detection | |
CN113686934A (zh) | 一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用 | |
Kashefi-Kheyrabadi et al. | Ultrasensitive and amplification-free detection of SARS-CoV-2 RNA using an electrochemical biosensor powered by CRISPR/Cas13a | |
CN117368284A (zh) | 一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备方法与应用 | |
CN110672694B (zh) | 一种基于dna nanotree检测尿嘧啶-dna糖基化酶活性的电化学方法 | |
Wu et al. | A simple electrochemical biosensor for rapid detection of microRNA based on base stacking technology and enzyme amplification |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |