CN110672694B

CN110672694B - 一种基于dna nanotree检测尿嘧啶-dna糖基化酶活性的电化学方法

Info

Publication number: CN110672694B
Application number: CN201911010542.6A
Authority: CN
Inventors: 胡宇芳; 张青青; 胡丹丹; 詹甜玉; 王邃; 郭智勇
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2039-10-14
Also published as: CN110672694A

Abstract

本发明公开了一种基于DNA NANOTREE检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶活性的电化学方法，具体步骤如下：Au处理，再将H0修饰于Au上，随后利用UDG打开引发链的发卡结构，随着单链DNA1的引入，引发HCR扩增，继而利用TdT催化延长H1和H2的3’‑OH，在Pb²⁺的作用下形成G4结构，再将hemin插入G4结构中，在G4/hemin的生物催化作用下，3，3‑二氨基联苯胺(DAB)被过氧化氢(H₂O₂)氧化形成不导电的IP。结果，电极界面和氧化还原探针之间的电子转移受到很大阻碍，导致电化学阻抗信号的显著放大。在传感器制备过程中，改变UDG浓度及其抑制剂UGI浓度，探究所制备的一系列传感器对电化学阻抗信号的影响。优点是灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

Description

一种基于DNA NANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学方法

技术领域

本发明涉及一种电化学阻抗传感器及其检测方法，尤其是涉及一种基于DNANANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学方法，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

基因组的完整性和准确性对所有生物都至关重要。然而，日常生活中的许多环境因素都会对DNA造成不可逆转的损害，如辐射和有毒化学物质。一个常见的损伤脱氨的胞嘧啶可以引起dU的损害，错误掺入DNA复制过程中。如果不修复，可能会导致永久性基因突变。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是尿嘧啶诱导的病变中不可缺少的DNA损伤修复酶，可以翻转尿嘧啶通过催化尿嘧啶和脱氧核糖之间的N-糖苷键断裂，露出脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点而脱离DNA骨架。然后通过与其他修复酶偶联，可以实现DNA修复。然而，异常的UDG水平有时与许多疾病密切相关，如人体免疫缺陷，水华综合征，淋巴瘤和癌症。UDG已成为疾病的有希望的生物标志物和治疗靶点。因此，开发用于检测UDG活性的敏感方法对于基础生物学研究和药物发现都是非常必要的。

用于测定UDG活性的传统方法通常包括凝胶电泳和放射性标记。然而，这些方法具有许多缺点，包括长时间操作，需要复杂的仪器和多个分离步骤。为了克服这些限制，DNA纳米技术进入了科研工作者的视野。自DNA纳米技术这一概念提出后，以DNA为基元的DNA自组装就飞速发展，DNA具有链间杂交的可预测性，刚柔并济(刚性的DNA双链和柔性的DNA单链)，序列合成、修饰和复制简单，建模简单等优点，因此利用构建纳米结构具有诸多优势，迄今为止，科学家们已经可以构建出几乎任意形状的DNA纳米结构。最开始的DNA复杂结构的构建是基于交叉结构，再利用这些交叉结构的互补配对来构建更复杂的核酸复合结构。构建精美的DNA纳米结构用于UDG活性检测是一件十分有意义的工作。

本发明利用杂交链反应循环放大技术及脱氧核苷酸末端转移酶扩增技术形成了一种DNANANOTREE，并应用于UDG活性的信号放大分析检测。我们设计了四种DNA探针，包括含巯基的发卡DNA探针(H0，茎端杂交区含有4个尿嘧啶碱基，在UDG的作用下，尿嘧啶碱基能被识别切除)，能够和发卡H0茎环处互补杂交的直链DNA1(同时含有能够打开H1的引发链)，和杂交链反应的发夹DNA1(H1)和发夹DNA2(H2)探针。当UDG存在时，将H0中的尿嘧啶碱基切除，H0从发卡结构变成了直链DNA，此时H0可以和直链DNA1互补配对杂交，加入的H1和H2也被相继打开，从而引发HCR扩增反应。在dNTP(dATP∶dGTP＝4∶6)存在下，通过脱氧核苷酸末端转移酶的特异性催化，在H1和H2的3’-OH末端不断地添加dNTP，生成随机排布富G的长链DNA。在Pb²⁺作用下，这种富G的DNA链会从无规则的卷曲结构变成规则的G4结构。G4与血红素(hemin)作用能够形成一种有辣根过氧化物酶活性的DNA模拟酶。在G4/hemin的生物催化作用下，3，3-二氨基联苯胺(DAB)被过氧化氢(H₂O₂)氧化形成不导电的不溶性沉淀物(IP)，看起来就像DNANANOTREE，此时电极界面和氧化还原探针之间的电子转移受到很大阻碍，导致电化学阻抗信号的显着放大。目前，国内外尚没有这种基于DNA NANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学方法的报导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的一种基于DNANANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于DNA NANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学方法，具体步骤如下：

(1)Au：将裸金电极在抛光布(含粒径为0.05μm的Al₂O₃悬浮液)上抛光，然后在水中超声2～8min处理，再用蒸馏水缓缓冲洗三次，获得Au。

(2)Electrode 1：

①将H0(0.5～7.5μL，0.01～0.5μM)滴到电极表面，组装过夜，蒸馏水缓缓冲洗。接着把电极浸泡在巯基己醇(MCH)(0.1～2mM)水溶液中组装用来封闭金电极表面未组装的区域，以减少其他生物分子的非特异性吸附，蒸馏水缓缓冲洗；②配制2.5μL UDG反应体系(UDG反应缓冲液，0.01～0.5μM DNA1以及0～10U/mL UDG，28～40℃孵育0.2～1.5h)，然后将该反应液修饰于上述①电极上，28～40℃孵育10～60min，蒸馏水缓缓冲洗；③配制HCR反应液：0.1～2μL 10×Tris反应缓冲液，发夹探针H1(0.1～2μL，0.01～0.5μM)，发夹探针H2(0.1～2μL，0.01～0.5μM)，将上述反应液滴涂到②电极上在28～40℃下反应0.2～1.5h，蒸馏水缓缓冲洗；④配制2.5μL TdT反应液(TdT缓冲液，dATP(0.1～1μL，1～20mM)，dGTP(0.1～1.5μL，1～20mM)，TdT(0.1～2.5μL，1～20U/mL)，滴涂至③电极表面，在28～40℃下放置0.2～1.5h，蒸馏水缓缓冲洗电极。

(3)Electrode 2：

在Electrode 1表面滴加Pb²⁺(0.5～5μL，1～1000nM)，室温下静置10～45min，蒸馏水缓缓冲洗。再滴加hemin(0.5～7.5μL，0.1～1.8μM)，室温下孵育10～45min，蒸馏水缓缓冲洗；之后将DAB(1～5μL，0.5～10mM)和H₂O₂(1～5μL，1～20mM)滴至电极表面表面，在28～40℃下放置0.1～1h，用于EIS检测。

所述的10×Tris反应缓冲液由以下溶液配制：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，500mM氯化镁(MgCl₂)，pH 8.0。

所述的电化学参数条件如下：交流阻抗法，振幅：5mV，频率范围：10⁵至10^-2Hz，溶液：0.1M KCl+5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-。

发明原理：利用上述一种基于DNANANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学方法，设计四种DNA探针，包括含巯基的发卡DNA探针(H0，茎端杂交区含有4个尿嘧啶碱基，在UDG的作用下，尿嘧啶碱基能被识别切除)，能够和发卡H0茎环处互补杂交的直链DNA1(同时含有能够打开H1的引发链)，和杂交链反应的发夹DNA1(H1)和发夹DNA2(H2)探针。当UDG存在时，将H0中的尿嘧啶碱基切除，H0从发卡结构变成了直链DNA，此时H0可以和直链DNA1互补配对杂交，加入的H1和H2也被相继打开，从而引发HCR扩增反应。在dNTP(dATP∶dGTP＝4∶6)存在下，通过脱氧核苷酸末端转移酶的特异性催化，在H1和H2的3’-OH末端不断地添加dNTP，生成随机排布富G的长链DNA。在Pb²⁺作用下，这种富G的DNA链会从无规则的卷曲结构变成规则的G4结构。G4与血红素(hemin)作用能够形成一种有辣根过氧化物酶活性的DNA模拟酶。在G4/hemin的生物催化作用下，3，3-二氨基联苯胺(DAB)被过氧化氢(H₂O₂)氧化形成不导电的不溶性沉淀物(IP)，显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电化学阻抗越大。实验结果表明，阻抗大小与目标物浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：

(1)高灵敏度。实验得出传感器的电化学阻抗响应对UDG活性对数值的线性相关方程为y＝9366lgC_UDG+38860，R²＝0.9924，线性范围为0.0001～4U/mL，检测限为0.00003U/mL，由此说明传感器对UDG可实现高灵敏检测。

(2)结果准确。回收率均在90％～110％之间。

(3)抑制剂。利用该电化学阻抗传感器实现对UDG抑制剂(UGI)的检测，可以得出传感器的电化学阻抗响应与抑制剂的相关关系。

(4)选择性好。其他常见相关酶对本检测体系均无干扰。

(5)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。

综上所述，本发明制备一种基于DNANANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学方法，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度UDG的检测及其抑制剂的筛选，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明传感器的可行性实验图；

图2为本发明传感器对有无UDG的电化学响应；

图3为本发明传感器对不同浓度UDG的电化学响应对UDG浓度的对数校准曲线图；

图4为不同浓度UGI对UDG活性的抑制作用；

图5为本发明传感器的选择性实验图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1传感器的制备

(1)Au：将裸金电极在抛光布(含粒径为0.05μm的Al₂O₃悬浮液)上抛光，然后在水中超声5min处理，再用蒸馏水缓缓冲洗三次，获得Au。

(2)Electrode 1：

①将H0(5μL，0.05μM)滴到电极表面，组装过夜，蒸馏水缓缓冲洗。接着把电极浸泡在巯基己醇(MCH)(1mM)水溶液中组装用来封闭金电极表面未组装的区域，以减少其他生物分子的非特异性吸附，蒸馏水缓缓冲洗；②配制2.5μL UDG反应体系(UDG反应缓冲液，0.05μM DNA1以及1U/mL UDG，37℃孵育1h)，然后将该反应液修饰于上述①电极上，37℃孵育30min，蒸馏水缓缓冲洗；③配制HCR反应液：1μL 10×Tris反应缓冲液，发夹探针H1(1μL，0.25μM)，发夹探针H2(1μL，0.25μM)，将上述反应液滴涂到②电极上在37℃下反应1h，蒸馏水缓缓冲洗；④配制2.5μL TdT反应液(TdT缓冲液，dATP(0.4μL，10mM)，dGTP(0.6μL，10mM)，TdT(0.5μL，10U/mL)，滴涂至③电极表面，在37℃下放置30h，蒸馏水缓缓冲洗电极。

(3)Electrode 2：

在Electrode 1表面滴加Pb²⁺(2.5μL，100nM)，室温下静置30min，蒸馏水缓缓冲洗。再滴加hemin(2.5μL，1μM)，室温下孵育30min，蒸馏水缓缓冲洗；之后将DAB(2.5μL，2mM)和H₂O₂(2.5μL，2mM)滴至电极表面表面，在30℃下放置0.5h，用于EIS检测。

检测上述制备的传感器的交流阻抗响应，结果如图1，Electrode 2的阻抗值相对于Electrode 1和Au大大增强，说明传感器制备成功。

实施例2 UDG活性检测

制备传感器过程中，为了研究传感器是否能够应用于对UDG活性检测，研究了在传感器制备过程中，加入UDG和不加UDG所制备传感器的电化学阻抗响应，结果如图2，证明传感器可用于对UDG活性检测。

随后，在传感器制备过程中，加入不同浓度的UDG(0、0.0001、0.0004、0.001、0.004、0.01、0.04、0.1、0.4、1、4、10U/mL)，检测所制备的传感器的电化学阻抗响应，结果如图3，在0.0001～4U/mL之间，交流阻抗强度与UDG浓度的对数之间呈现良好的线性关系，线性方程为y＝9366lgC_UDG+38860，R²＝0.9924，检测限为0.00003U/mL，由此说明传感器对UDG可实现高灵敏检测。

实施例3 UDG抑制剂UGI的检测

为了证明所建立的方法能用于UDG抑制剂的筛选，选取UGI模型，图4描述的是传感器在加入不同UGI浓度(0、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.5、1、1.5、2U/mL)下的交流阻抗响应曲线。如图所示，随着UGI浓度的增加，电化学信号逐渐减弱，当UGI浓度(1U/mL)与UDG(1U/mL)浓度相当时，电化学阻抗信号达到平台，这说明UDG活性被UGI有效抑制。通过上述实验结果，可以推测我们建立的分析方法具有用于UDG抑制剂筛选的潜在应用价值。

实施例4特异性检测

选择性中UDG及其他酶的浓度均为1U/mL，所用到的其他酶的缩写如下：乙酰转移酶(HAT)、胆碱氧化酶(ChOx)、尿酸酶(Uricase)、胆固醇氧化酶(Cho)、蛋白激酶(PK)。

按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，用其他相同浓度的酶代替UDG，制备得到传感器。结果如图5所示，与UDG对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于UDG的检测有很好的选择性。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims

1.一种基于DNANANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学阻抗传感器，其特征在于，传感器的制备具体步骤如下：

(1)Au电极：将裸金电极在抛光布上抛光，然后在水中超声2～8min处理，再用蒸馏水缓缓冲洗三次，获得Au电极；

其中所述抛光布为含粒径为0.05μm的Al₂O₃悬浮液；

(2)Electrode 1：

①将含巯基的发卡DNA探针H₀滴到Au电极表面，组装过夜，蒸馏水缓缓冲洗；接着把电极浸泡在巯基己醇MCH水溶液中组装用来封闭金电极表面未组装的区域，以减少其他生物分子的非特异性吸附，蒸馏水缓缓冲洗；②配制2.5μL尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG反应体系，然后将该反应液修饰到步骤①所获得的电极上，28～40℃孵育10～60min，蒸馏水缓缓冲洗；③配制HCR反应液：0.1～2μL 10×Tris反应缓冲液、发夹DNA探针H₁、发夹DNA探针H₂；将上述反应液滴涂到步骤②所获得的电极上在28～40℃下反应0.2～1.5h，蒸馏水缓缓冲洗；④配制2.5μL TdT反应液，滴涂至步骤③所获得的电极表面，在28～40℃下放置0.2～1.5h，蒸馏水缓缓冲洗电极；

其中，所述含巯基的发卡DNA探针H₀用量为0.5～7.5μL，浓度为0.01～0.5μM；

所述含巯基的发卡DNA探针H₀为茎端杂交区含有4个尿嘧啶碱基，在尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG的作用下，尿嘧啶碱基能被识别切除；

所述巯基己醇MCH水溶液浓度为0.1～2mM；

所述尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG反应体系构成如下：尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG反应缓冲液，0.01～0.5μM DNA1以及0～10U/mL尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG，28～40℃孵育0.2～1.5h；

所述发夹DNA探针H₁用量为0.1～2μL，浓度为0.01～0.5μM；

所述发夹DNA探针H₂用量为0.1～2μL，浓度为0.01～0.5μM；

所述TdT反应液构成如下：TdT缓冲液，dATP：0.1～1μL，1～20mM；dGTP：0.1～1.5μL，1～20mM，TdT：0.1～2.5μL，1～20U/mL；

(3)Electrode 2：

在Electrode 1表面滴加Pb²⁺，室温下静置10～45min，蒸馏水缓缓冲洗；再滴加血红素，室温下孵育10～45min，蒸馏水缓缓冲洗；之后将3，3-二氨基联苯胺和H₂O₂滴至电极表面，在28～40℃下放置0.1～1h，用于EIS检测，即制备获得所述基于DNANANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学阻抗传感器；

其中，所述Pb²⁺用量为0.5～5μL，浓度为1～1000nM；

所述血红素用量为0.5～7.5μL，浓度为0.1～1.8μM；

所述3，3-二氨基联苯胺用量为1～5μL，浓度为0.5～10mM；

所述H₂O₂用量为1～5μL，1～20mM。

2.根据权利要求1所述的电化学阻抗传感器，其特征在于，所述的10×Tris反应缓冲液由以下溶液配制：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、500mM氯化镁，pH 8.0。

3.根据权利要求1或2所述的基于DNA NANOTREE检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的电化学阻抗传感器的应用，其特征在于，应用于尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG的活性检测。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方法如下：在传感器制备过程中，加入不同浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶UDG，检测所制备的传感器的电化学阻抗响应，在0.0001～4U/mL之间，交流阻抗强度与UDG浓度的对数之间呈现良好的线性关系，检测限为0.00003U/mL。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，电化学参数条件如下：交流阻抗法，振幅：5mV，频率范围：10⁵至10^-2Hz，溶液：0.1M KCl+5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-。