CN106755460B - 一种单碱基突变检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸短暂杂交与磁分离相结合的单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；B，将与捕获探针偶联的磁球配置成具有较高金属离子浓度的磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低浓度金属离子的溶液中；D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变；其中，所述捕获探针与目标基因的非突变部分完全互补；所述信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配。该检测方法快速，能用于低丰度突变检测。
Description
技术领域
本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种单碱基突变检测方法。
背景技术
基因突变，特别是单碱基突变检测技术对疾病的早期诊断和用药策略有着重要的意义。在精准医疗的背景下，基因突变检测已成为一项重要的临床检验指标。基因突变检测技术分为测序型技术和非测序型技术。随着二代测序技术(Next Generation Sequencing)的发展，测序的成本大幅下降，使得很多机构都能够为患者提供基因测序服务。但是二代测序技术需要的核酸浓度较高且分析时间长，而且受到测序深度和核酸聚合酶本身属性的限制，难以在临床样品中直接检出低频突变。
非测序型技术主要以核酸杂交探针为基础，其分析目标为已知突变基因的确认和含量测定。依赖于杂交探针的非测序型技术可以与纳米技术、微流控技术、荧光显微技术等相结合，形式灵活多样，易于发展成为临场检测方法(point of care，POC)。但是传统的杂交型探针在单碱基选择性上表现较差，这是由核酸杂交的热力学障碍导致，即在室温条件下，探针与野生型和单碱基突变型杂交反应的平衡常数接近。目前，人们已经尝试通过势能陷阱、核酸链交换、核酸酶辅助以及非天然碱基等手段提高单碱基选择性。在动态DNA纳米技术的研究领域，一种新型的核酸杂交模式-核酸短暂杂交近来受到关注。这种杂交模式是指双链核酸在其解链温度附近呈现杂交与解链的平衡，在这种状态下，它可以突破核酸稳定杂交的热力学瓶颈，对单碱基变化非常敏感，在超分辨成像和生化分析领域有较好的应用前景。在室温条件下，一般杂交的双链长度为9-12个碱基。在这种情况下，完全匹配的核酸双链与单碱基错配的核酸双链存在较大的杂交动力学差异，单碱基错配双链的解链动力学常数比完全匹配双链的高20-100倍。利用核酸短暂杂交发展了一种灵敏的单分子miRNA计数方法，在非信号放大的条件下，实现多种miRNA标志物的高灵敏检测。核酸短暂杂交为杂交型核酸探针的发展打开了一扇新的大门，在超高灵敏度基因突变检测方面有着巨大的应用潜力。
生物磁珠具有生物相容性好、提供简便的分离平台、成本低廉等特点，一直以来受到生物化学研究工作者的青睐，在生物分子分离富集、生化检测等领域得到了广泛的应用。通过对磁珠进行特异性的修饰，可以选择性的捕获溶液中的目标分子。例如在磁珠上修饰抗体，可以用于富集目标蛋白；在磁珠上修饰核酸适配体，可以富集肿瘤细胞以及小分子目标物。因此，利用磁珠的分离功能和核酸短暂杂交的特点，开发高灵敏度的基因突变检测方法具有较高的可行性。
综上所述，高灵敏度基因突变检测方法的开发对于临床诊断研究和基础研究都有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种单碱基突变检测方法，该方法可以快速准确地对单碱基突变基因序列进行检测，对突变序列具有高度的选择性，并且能用于低丰度突变的检测。
为此，本发明提供了一种核酸短暂杂交与磁分离相结合的单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：
A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；
B，将与捕获探针偶联的磁球配置成具有较高金属离子浓度的磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；
C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低浓度金属离子的溶液中；
D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变；
其中，所述捕获探针与目标基因的非突变部分完全互补；所述信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；
所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针、富含G序列的信号探针或等温指数扩增引物的信号探针。
根据本发明，当所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针时，检测上清液中的荧光值，若荧光值超过背景噪音的6倍，则待检样本中存在单碱基突变；
当所述信号探针的类型为富含G序列的信号探针时，在上清液中加入氯化血红素、H2O2和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐进行显色反应，若反应液呈现绿色，则待检样本中存在单碱基突变；
当所述信号探针的类型为等温指数扩增引物的信号探针时，利用上清液进行等温指数扩增反应，若扩增过程中出现扩增曲线，则待检样本中存在单碱基突变。
在本发明的一些实施例中，所述磁球溶液中的金属离子浓度为200-400mM；和/或所述低浓度金属离子的溶液中的金属离子浓度为0-10mM。
在本发明的另一些实施例中，所述的金属离子为Na和/或K。
在本发明的一些实施例中，所述信号探针与目标基因互补的碱基个数为9-12个。
在本发明的另一些实施例中，所述捕获探针的长度为20-25个碱基。
根据本发明，在捕获探针上标记生物素，在磁球表面包覆亲和素，通过生物素-亲和素的相互作用，将捕获探针偶联于磁球上。
在本发明的一些实施例中，所述磁球的平均直径为2μm。
在本发明的另一些实施例中，所述核酸杂交的温度为20-27℃，时间为10-20min。
根据本发明，所述方法对单碱基突变的检测限为0.1％。
本发明的有益效果为：本发明所述方法可以快速准确地对单碱基突变基因序列进行检测，且对单碱基突变基因序列具有高度的选择性，可用于低丰度突变检测。同时，所述方法还具有荧光、显色和等温扩增信号等多个检测窗口，可以适用于多种检测环境；且检测成本低廉、易于制备，操作简便，重复性高，易于推广到非专业人员操作。
附图说明
下面将结合附图来说明本发明。
图1为与目标基因互补的碱基个数为10的信号探针在不同浓度的NaCl存在时的单碱基突变区分因子的示意图。
图2为不同丰度的单碱基突变基因与检测荧光值的关系示意图。
图3为本发明采用荧光标记的信号探针进行单碱基突变检测的原理示意图；其中，图中附图标记的含义如下：1目标基因的突变型基因；2目标基因的野生型基因；3生物素化捕获探针；4亲和素包覆的磁球；5荧光标记的信号探针。
图4为实施例1中显色反应实验结果示意图。
图5为实施例1中等温扩增实验结果示意图。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。
本发明涉及一种单碱基突变检测方法，具体为一种采用核酸短暂杂交与磁分离相结合的单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：
A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；
所述捕获探针为单链寡核酸序列，一般为20-25个碱基，能与目标基因的非突变部分完全互补，用于捕获体系中的目标基因序列；室温下，所述捕获探针与目标基因的突变型基因和野生型基因均能形成稳定杂交；将捕获探针用生物素标记后，其能通过生物素-亲和素(例如，链霉亲和素)相互作用偶联在亲和素包覆的磁球(平均直径2微米)上；
所述信号探针为一段带有标记的核苷酸序列，与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；一般，信号探针与目标基因互补的碱基个数为9-12个；
根据信号探针所带的标记不同，所述信号探针的类型包括荧光标记的信号探针、富含G序列的信号探针或等温指数扩增引物的信号探针；
本发明所述用语“荧光标记的信号探针”是指在信号探针的端部连接一荧光素，所述的荧光素可以为FAM荧光素、VIC荧光素等。
本发明所述用语“富含G序列的信号探针”是指在信号探针的端部连接一段富含鸟嘌呤(G)序列的信号探针，富含鸟嘌呤(G)序列的DNA能通过Hoogsteen氢键，形成G-四联体(DNA的一种二级结构)，G-四联体可以与氯化血红素(hemin)结合，形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶。这种模拟酶可以催化H2O2与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)的反应，生成的产物具有特征的绿色并在410nm处有特征吸收；所述富含鸟嘌呤(G)的序列仅用来形成G-四联体结构，不与目标基因序列形成任何互补；
本发明所述用语“等温指数扩增引物的信号探针”，是指短信号探针的端部连接一段可以用于等温指数扩增反应(IEXPAR)扩增的序列，这段序列仅用来作为等温扩增的模板，不与目标序列形成任何互补。
所述等温指数扩增反应(Isothermal exponential amplification reaction，IEXPAR)是Galas等建立的一种新型的核酸扩增技术。IEXPAR可以在等温条件下，利用聚合酶和切刻酶的协同作用，在短时间内对目标核酸分子扩增106-109倍，该技术具有简便、快速的显著优点。
B，将与捕获探针偶联的磁球配置成磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；
磁球溶液中具有较高的金属离子浓度，一般为200-400mM，图1为与目标基因互补的碱基个数为10的信号探针在不同浓度的NaCl存在时的单碱基突变区分因子。从图1可以看出，当NaCl的浓度在200-400mM时，信号探针的单碱基突变区分因子较好，这是由于金属离子(例如Na、K、Mg和Ca等)的存在可以减弱核酸双链杂交时的静电排斥，从而促进双链的形成；
本发明所述用语“区分因子”为发生单碱基突变的突变型与野生型所产生的信号之比。
信号探针可以在金属离子的驱动下与目标基因的突变型基因形成较为稳定的双链，而与野生型基因形成不稳定的双链；由于探针碱基数少，即使在较高的盐浓度下，其与目标基因序列之间的杂交也属于短暂杂交；核酸短暂杂交的热力学和动力学对于互补碱基数和错配碱基非常敏感，因此在突变型基因存在时，磁球能够结合更多的信号探针，而野生型只能结合非常少的信号探针。
C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低浓度金属离子的溶液中；此时结合在突变型基因上的信号探针与其发生解离，游离在水溶液中。
D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变。
根据本发明，当所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针时，检测上清液中的荧光值，若荧光值超过背景噪音的6倍，则待检样本中存在单碱基突变；不同丰度的单碱基突变基因与检测荧光值的关系如图2所示；检测过程的原理示意图如图3所示。
当所述信号探针的类型为富含G序列的信号探针时，在上清液中加入氯化血红素、H2O2和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐进行显色反应，生成的产物具有特征的绿色，并在410nm处有特征吸收；若显色反应后的反应液呈现绿色，则待检样本中存在单碱基突变。
在目标基因序列浓度较低的情况下，在第二次磁分离后，获得的上清液中的探针浓度也较低，普通的荧光和显色方法难以检测到，此时采用的信号探针的类型为等温指数扩增引物的信号探针。
当所述信号探针的类型为等温指数扩增引物的信号探针时，利用上清液进行等温指数扩增反应，若扩增过程中出现扩增曲线，则待检样本中存在单碱基突变。
根据本发明，所述低浓度金属离子的溶液中的金属离子浓度为0-10mM；在本发明的一些实施例中，所述低浓度金属离子的溶液优选为纯水溶液，即所述低浓度金属离子的溶液中不含有金属离子。
根据本发明，所述磁球溶液及低浓度金属离子的溶液中的金属离子为Na、K等一价金属离子中的一种或多种。
根据本发明，所述核酸杂交的温度为20-27℃，时间为10-20min。
根据本发明，所述方法对单碱基突变的检测限为0.1％。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：DNA中单碱基A>G突变的检测
使用与目标基因有10个碱基互补的信号探针对目标单链DNA中的A>G基因突变进行检测。
具体步骤：
(1)磁球偶联生物素化捕获探针
①将表面包覆亲和素的磁球的溶液置于漩涡仪涡旋振荡30s，使表面包覆亲和素的磁球充分混匀。移液枪吸取100μl的磁球溶液到1.5ml离心管中。将离心管置于磁性分离器上，静置2min，吸去上清液。
②取下离心管，加入1ml缓冲液I(10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mMEDTA，1M NaCl，0.1％Tween-20)，涡旋混匀，磁性分离，去除上清。重复此操作一次。
③加入500μl含有1.6μΜ生物素化捕获探针的缓冲液I，使磁球浓度为2mg/ml，涡旋混匀。将离心管置于水平摇床，在室温下以80rpm的速度旋转混合30min(期间每隔5min涡旋混匀一次，确保磁球悬浮)。
④反应完成后，磁性分离，收集上清于新的1.5ml EP管，测OD260处值。
⑤用适量缓冲液I清洗三次，磁性分离，去除上清，加入1ml PBS(pH＝7.4)溶液，重悬磁球，获得偶联捕获探针的磁球，置于4℃冰箱备用。
⑥通过测定反应前后核酸的浓度，计算结合到磁球上核酸的量。
(2)核酸杂交
①上述偶联捕获探针的磁球磁性分离，去除上清，用适量缓冲液(pH＝7.5)清洗，磁性分离。
②加入50μl含有突变型/野生型基因序列、信号探针和含有400mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)；室温下，置于水平摇床，80rpm下杂交10min，期间每隔5min涡旋一次，确保磁球悬浮，然后进行磁性分离。
③将磁球重悬于纯水溶液，磁性分离，保留上清。
④根据所使用的信号探针类型分析③步中上清液的信号。
a.若采用的是荧光标记的信号探针，则在荧光酶标仪(多功能酶标仪EnVisionPerkinElmer，英国)上直接分别测定野生型组和突变型组的荧光强度。
b.若采用富含G序列的信号探针，则进行显色反应实验。取③步中上清液46μl加入新的离心管，再加入4μl 62.5mΜHemin，37℃孵育1h；孵育完成后，再向上述溶液中分别加入143μl 50mM HEPES缓冲液(pH＝5.2)，2μl 4mM ABTS，5μl 4mM H2O2，室温反应10min，观察野生型组和突变型组的溶液颜色。
c.若采用等温指数扩增的引物的信号探针，则取2μl③步中上清液加入到含有1×SYBY Green I、0.05U/μl Vent(exo-)DNA聚合酶、0.3U/μl Nt.BstNBI限制性内切酶、0.02μΜ扩增模板、250μΜdNTPs的缓冲液中(22mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mM NaCl，10mMKCl，3.5mM MgSO4，0.1％Triton X-100，pH 8.3)的溶液，在55℃下，反应2h，并在荧光酶标仪(多功能酶标仪EnVision PerkinElmer，英国)上检测其荧光变化曲线。
实施例中所采用的核酸的序列如表1所示：
表1：实施例中所采用的核酸的序列
注：FAM表示荧光素，P表示磷酸标记
(3)检测结果：
a.在荧光测定实验中，突变型组和野生型组的检测荧光值分别为7734和785，突变组的荧光值显著高于野生型组的荧光值。
b.显色反应实验结果如图4所示，突变型组呈现特征深绿色，而野生型组没有呈现该颜色。
C.在等温扩增实验中，突变型组在1h内荧光信号得到增强，展现出特征的扩增曲线；而野生型组的荧光信号没有增强，如图5所示。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京化工大学
<120> 一种核酸短暂杂交与磁分离相结合的单碱基突变检测方法
<130> 2016
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 生物素化捕获探针
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atccttatca atattgatcg 40
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<212> DNA
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acggatcgca tcaacttacg caattgcgta cgatcaatat tgataaggat 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 目标基因的突变型基因
<400> 3
acggatcgca tcgacttacg caattgcgta cgatcaatat tgataaggat 50
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aagtcgatgc 10
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taagtcgatg c 11
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<212> DNA
<213> 12-nt荧光标记的核酸探针
<400> 6
taagtcgatg cg 12
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<213> 富含G序列的核酸探针
<400> 7
aagtcgatgc aaagggtagg gcgggttggg a 31
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<212> DNA
<213> 等温指数扩增引物的核酸探针
<400> 8
aagtcgatgc cagctggagc 20
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 等温扩增模板
<400> 9
gctccagctg gcatcgactt aacagactca gctccagctg gcatcgactt a 51
Claims (8)
1.一种非疾病诊断目的的单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：
A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；
B，将与捕获探针偶联的磁球配置成具有较高金属离子浓度的磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；
C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低浓度金属离子的溶液中；
D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变；
其中，所述捕获探针与目标基因的非突变部分完全互补；所述信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；
所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针、富含G序列的信号探针或等温指数扩增引物的信号探针；
所述磁球溶液中的金属离子浓度为200-400mM；所述低浓度金属离子的溶液中的金属离子浓度为0-10mM；
所述信号探针与目标基因互补的碱基个数为9-12个；
所述核酸杂交的温度为20-27℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针时，检测上清液中的荧光值，若荧光值超过背景噪音的6倍，则待检样本中存在单碱基突变；
当所述信号探针的类型为富含G序列的信号探针时，在上清液中加入氯化血红素、H2O2和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐进行显色反应，若反应液呈现绿色，则待检样本中存在单碱基突变；
当所述信号探针的类型为等温指数扩增引物的信号探针时，利用上清液进行等温指数扩增反应，若扩增过程中出现扩增曲线，则待检样本中存在单碱基突变。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的金属离子为Na和/或K。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获探针的长度为20-25个碱基。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在捕获探针上标记生物素，在磁球表面包覆亲和素，通过生物素-亲和素的相互作用，将捕获探针偶联于磁球上。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述磁球的平均直径为2μm。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸杂交的时间为10-20min。
8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法对单碱基突变的检测限为0.1％。
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| CN101283107A (zh) * | 2005-10-14 | 2008-10-08 | 瑞宝基因有限公司 | 核酸等温扩增方法和使用核酸和信号探针同时等温扩增的核酸检测方法 |
-
2017
- 2017-01-10 CN CN201710014617.2A patent/CN106755460B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1340711A (zh) * | 2000-08-30 | 2002-03-20 | 肖云宁 | 一种检测探针的制备方法及用途 |
| CN101283107A (zh) * | 2005-10-14 | 2008-10-08 | 瑞宝基因有限公司 | 核酸等温扩增方法和使用核酸和信号探针同时等温扩增的核酸检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids;Alexander Johnson-Buck等;《nature biotechnology》;20150622;第1-4页 * |
| 磁珠分离DNA技术检测HIV-1逆转录酶基因;程绍辉等;《中国生物工程杂志》;20081231;第105-109页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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