CN1340711A - 一种检测探针的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测探针的核苷酸序列、制备方法及其在医学诊断和生命科学研究中的应用。检测探针由长短不同但具有互补序列的两条探针构成,长探针5’端连接荧光分子,3’端连接延伸阻断分子,短探针3’端连接淬灭分子。可以根据待检测的基因设计相应的探针,通过固相合成的方法制备探针。本发明的复合探针合成简单,荧光淬灭彻底,可广泛用于基因定性和定量分析,基因突变分析,基因杂交检测,基因分型等领域。
Description
本发明涉及一种生物技术检测工具，具体地说是一种检测探针及其使用方法和它在基因荧光定性、定量杂交分析、医学诊断等生命科学研究中的应用。
多聚酶链式反应(PCR)可以连续扩增特定的基因片断，产生放大效应，目前已经被广泛而成功地用于获取某一目的基因。PCR在基因诊断方面同样具有广阔的应用前景，但一些问题限制了它的实际使用，主要问题有两点，一是不能准确定量；二是因为过于灵敏，易发生交叉污染，产生假阳性。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直到最近荧光能量传递技术(fluorescende resonance energy transfer，简称FRET，下同)用于PCR定量后上述问题才得到较好的解决。
目前，实时PCR监测技术主要有四种。TaqMan技术是由PE公司开发的，该技术主要利用了Taq酶的5’外切酶活性。首先合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5’端标记一种荧光分子，3’标记另一种荧光分子，3’端荧光分子能够吸收5’端荧光分子发出的荧光。正常情况下该探针没有荧光，但当溶液中有PCR产物时，探针与PCR产物结合，激活Taq酶的5’外切酶活性，5’端切割下来的荧光分子与3’端荧光分子连接后，探针发出荧光。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的浓度[Livak KJ.Allelic discrimination using fluorogenic probesand the 5’nuclease assay.Genet Anal 1999 Feb；14(5-6)：143-9]。分子信标技术也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是，探针5’和3’末端可以分别形成一个8碱基左右的发卡结构。荧光分子和淬灭分子邻近时，不会产生荧光；而当溶液中有特异模板时，探针与模板杂交，探针的发卡结构破坏，产生荧光。荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此该技术也可用于PCR定量分析[Bialy H.Detecting drug-resistant tuberculosis：Beacons in thedark.Nat Biotechnol，1998，16：331.4.Piatek，AS，Tyagi S，Pol AC，et al.Molecular beacon sequence analysis for detecting dmg resistance inMycobacterium tuberculosis.Nat Biotechnol，1998，16：359-363]。Amplisensor是一种复合探针技术。它包括长度不同，但具有互补序列的两个探针，短探针上连接淬灭物，长探针上连接荧光物，长探针5’端多出的7个碱基GCGTCCC可以与PCR引物互补。PCR扩增前，两探针杂交在一起，溶液中没有荧光；PCR扩增时，在连接酶的作用下长探针与PCR引物连接，长探针一引物复合物中的代引物部分作为半套式引物参入模板，淬灭探针释放，破坏了FRET，从而产生荧光，荧光的强度与扩增时加入的模板量成正比[Chiang PW.Song WJ，Wu KY，et al.Use of a fiuorescent-PCR reaction to detect genomicsequence copy number and transcriptional abundance.Genome Res.1996，6(10)：1013-1026.]。LightCycler是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子，淬灭探针的3’端连接淬灭分子。由于设计的两个探针可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析[Sagner G，Goldstein C，Miltenburg RV.Detection of multiple reporter dyes in real-time，on-linePCR analysis with the LightCycler system.Roche MolecularBiochemicals BIOCHEMICA，1999，2：7-11]。上述FRET技术均存在一些缺陷，如淬灭不彻底，合成和标记复杂，成本高，非特异扩增不易区分等等。本发明人在综合现有技术优点的基础上，发明了一种新的FRET探针技术，该技术在很大程度上克服了现有技术的不足。
本发明的目的在于提供一种新的复合基因探针。
本发明的另一目的在于提供所述复合探针的使用方法。
本发明的再一目的在于提供所述复合探针在基因荧光定性、定量杂交分析、医学诊断等生命科学研究领域中的应用。
本发明的基本原理如下：如图1所示，首先合成两个探针，荧光探针5’端连有报告基团R，3’端连有延伸阻断分子B，淬灭探针3’端连有淬灭基团Q，淬灭探针能与荧光探针5’端杂交。两探针结合时荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收，溶液中没有荧光产生；两探针分离时荧光探针发出的荧光不被被淬灭探针吸收，溶液中有荧光产生。基于这一构思，本发明人合成了复合探针，当PCR扩增反应液中没有模板时，复合探针特异结合，溶液没有荧光产生；当反应液中有模板时，在较高温度下荧光探针优先与模板结合，因而两探针分离产生荧光，荧光强度与溶液中模板数量成正比，据此可进行PCR定量测定。
本发明的目的是这样实现的：(1)制备复合基因探针，它由长短不同但具有互补序列的两条探针构成，长探针5’端连接荧光分子，3’端连接延伸阻断分子，短探针3’端连接淬灭分子，所述长探针可以与待检基因的部分序列杂交。复合探针中的长探针由20-40个核苷酸组成，短探针由5-25个核苷酸组成，优选组合中长探针由25-28个核苷酸组成，短探针由15-20个核苷酸组成。复合探针中长探针的Tm值应高于短探针2℃以上。探针上连接的荧光分子和淬灭分子数可以是1-5个，考虑到成本及合成方便性，最好是1个，荧光分子可以是荧光素、罗丹明等，淬灭分子可以是非荧光分子如对甲基红、QSY-T，也可以是荧光分子如罗丹明，为了减少荧光本底，最好选非荧光分子，特别是QSY-T，它比对甲基红淬灭效率更高，长探针上荧光分子发出的荧光波长必须能被短探针上淬灭分子吸收。长探针上的延伸阻断分子防止引物二聚体形成及非特异性荧光的产生，延伸阻断分子可以选用磷酸、甘油等，优选磷酸。
根据本发明的另一方面，本发明公开了复合探针在基因检测中的使用方法，它包括如下步骤：
(1)制备复合探针；
(2)根据待检基因的序列，设计并合成一对上、下游引物，引物Tm值应该比长探针低，引物不与探针发生重叠又邻近探针的两端，距离探针两端1-8个核苷酸为佳。
(4)pGEM-LTB/NS3，(5)pGEM-LTB/NS5a，(6)pGEM-LTB/NS5b，(7)pGEM-LTB/NS5a-NS5b，(8)pGEM-LTB/NS4-C，(9)pGEM-LTB/NS4-C-NS5a，(10)pGEM-LTB-NS4-C-NS5a-NS5b，(11)分子量标准
(3)将模板加入含有探针、引物、PCR缓冲液、镁或锰离子、dNTP的反应混合物中进行常规PCR，扩增25-60个循环。作为模板的核酸长度以60-500个碱基为宜，最好是70-120个碱基。在每个循环退火或延伸时读取荧光值。
(4)以模板起始浓度的对数对门槛荧光的循环数作回归分析，制作标准曲线，对待检测基因的浓度进行定量分析。门槛荧光是指两倍于本底荧光变异系数的被检基因的荧光强度。
根据本发明的再一方面，用本发明的复合探针依照上述步骤进行检测，可以广泛、方便地用于基因荧光定性、定量杂交分析、医学诊断等领域，尤其是在多基因同时检测及分型、多位点基因突变分析中更具优势。
与现有技术相比，所述的技术方法具有以下特点：(1)采用非荧光淬灭剂，本底低；(2)对扩增效率影响较小；(3)探针设计、合成、标记及纯化方便。总之，由于具有合成简便、荧光淬灭彻底及对扩增效率影响小等优点，该技术具有较大的推广应用价值。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
图1检测探针的PCR定量
图2检测探针的特异性的检测曲线
图3检测探针检测的敏感性检测
图4扩增产物长度对检测探针PCR的影响
实施例
为进一步说明复合基因探针技术及应用，参照下列实施例进行说明，这些实施例是为了解释而不以任何方式限制本发明。实施例一引物及探针的设计和合成1.引物与探针的设计
根据复合探针荧光定性定量分析原理，依照待检靶分子H-BV的DNA序列，设计了引物P1、P1’、P1”、P2、P2’、荧光探针F与淬灭探针q、q1、q2，引物及探针的位置参见图2，其序列见表1。
表1探针与引物序列及位置名称 序 列 长度 位置
(核苷酸) (碱基对)F 5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TGT TAG ACG A-B-3’ 28 2328-2357q 5’-GTA GTT TCC GGA AGT-Dabcy1-3’ 15 2328-2342q1 5’-ACA ACA GTA GTT TCC GGA AGT-Dabcy1-3’ 21 2328-2348q2 5’-TCG TCT AAC AAC AGT AGT TTC-Dabcy1-3’ 21 2335-2355P1 5’-GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT C-3’ 22 2269-2290P1’ 5’-AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATC TT-3’ 23 2298-2321P1” 5’-GTC CTA CTG TTC AAG CCT CCA AGC TG-3’ 26 1856-1881P2’ 5’-CG AGA TTG AGA TCT TCT GCG ACG CGG-3’ 26 2418-2443P2 5’-TTC TTC TTC TAG GGG ACC TGC CT-3’ 23 2364-23861.1引物：
上游引物共有三条，P1有22个核苷酸，与复合探针相距37个核苷酸；P1’有23个核苷酸，与复合探针相距6个核苷酸；P2”有26个核苷酸，与复合探针相距446个核苷酸。
下游引物共两条，P2有26个核苷酸，与复合探针相距6个核苷酸；P2’有26个核苷酸，与复合探针相距61个核苷酸。1.2荧光探针
荧光探针与靶序列负链互补，由28个核苷酸组成，其5’端带一荧光素分子，3’端带一延伸阻断分子磷酸。1.3淬灭探针：
淬灭探针与荧光探针5’端互补，其3’端连接一个淬灭分子对甲基红。共设计了三条淬灭探针，q含有15个核苷酸，q1及q2均含有21个核苷酸，q1与q2在位置上相距6个核苷酸，而q1比q长6个核苷酸。2.引物与探针的合成
合成原料：四种碱基、甲基红CPG、磷酸CPG、荧光素亚磷酰胺购自美国Glen Research公司。引物与探针均采用PE公司产391A型DNA合成仪自动合成。探针的修饰在合成过程中自动完成。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后经Micro Pure II反相纯化柱(Solid Phase Sciences)纯化，探针进一步用高效薄层色谱板(Silica gel-60 GF 254 10×20cm，E.MERK公司)纯化。最后，用紫外分光光度仪(Beckman Du640)定量。实施例二复合探针PCR检测的通用步骤。
PCR反应混合物含10×PCR缓冲液2微升，dNTPs 0.2毫摩尔/升，MgCl3毫摩尔/升。反应体系20微升，含有PCR反应混合物15微升，上、下游引物各0.1微克，Taq DNA多聚酶(Promega公司)0.5U，荧光探针(荧光强度为4000-5000发光单位)0.04微克，淬灭探针0.04微克，荧光探针与淬灭探针的摩尔比为1∶2。标准品以10倍系列稀释，终浓度在102纳克/微升-10-3纳克/微升之间，取1微升作为模板。用特制的96孔板(Techne HI TEMP 96)，在英国Techne公司Genius PCR扩增仪上进行扩增，反应条件为94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，40秒。每5个循环延伸完毕后，取出反应板，用芬兰Wallac VICTOM 1420多标记检测仪，测定荧光强度。以循环数对荧光强度作图进行复合探针性质分析。用起始模板浓度的对数对产生门槛荧光的循环次数进行回归分析制定标准曲线，即可用于对未知样品的核酸浓度进行定量分析。
实施例三
取HBV质粒DNA为模板，以10倍系列稀释成102纳克/微升-10-3纳克/微升的浓度梯度，取1微升作为模板，以F与q1为复合探针，按实施例二操作，进行PCR扩增。如图3所示，可见荧光响应与反应体系中加入的起始模板量相关，而且各模板量标准反应孔荧光强度随循环数增加的改变符合PCR扩增规律，即在一定的循环数之间荧光强度呈现指数样改变，在高循环数时则趋于平台样变化。实施例四 复合探针的特异性
以F与q1为复合探针，依次设置模板浓度为102、100、10-2纳克的标准孔，再设置无模板孔，无荧光探针孔，无淬灭探针孔和无复合探针孔作为对照，按照实施例二的操作步骤进行复合探针检测。实验结果如图4所示，随着PCR循环数的增加，各标准孔荧光强度呈现出与模板起始浓度相关的荧光响应，而在无模板孔、无荧光探针孔、无淬灭探针孔及无复合探针孔中，荧光强度不因为循环数的增加而变化，由此证明复合探针具有良好的特异性。实施例五复合探针的定量范围与灵敏度
以F与q1为复合探针。将模板由浓度102纳克/微升，10倍系列稀释至10-7纳克/微升，取1ul按实施例二操作进行PCR扩增，检测复合探针的定量范围与灵敏度。如图5所示，模板量在102纳克与10-4纳克之间的反应孔随循环数改变可见相应的荧光响应，表明应用复合探针可对含量在102-10-4纳克范围内的样品进行准确的定量分析，该复合探针可检测到含量低至10-4纳克/微升的靶分子。实施例六影响复合探针定量的因素1.扩增片段长度的影响
以F与q1为复合探针，用不同引物配对，按实施例二进行PCR扩增。以P1-P2配对，如图6A所示，扩增产物长度为119bp；P1”-P2’配对，如图6B所示，扩增产物长度为89bp；P1’-P2配对，如图6C所示，扩增产物长度为588bp。扩增产物长度为119bp时，各标准量反应孔随循环数改变呈现相应的荧光响应。而扩增产物长度为89bp及587bp时，仅高模板量的反应孔出现荧光响应，且荧光强度低。上述结果表明，PCR产物长度对复合探针的定量分析具有明显的影响，扩增产物太长或太短，均不利于复合探针的定量分析。2.淬灭探针长度及位置的影响。
以引物P1-P2配对，分别采用淬灭探针q与荧光探针F(图7A)、q1与F(图7B)、q2与F(图7C)构成复合探针，按实施例二操作，进行PCR扩增。结果表明，淬灭探针长度在15-21个核苷酸之间，与荧光分子位置相距6个核苷酸时，对复合探针的定量分析无明显的影响。实施例七HBV DNA定量分析
2例HBVDNA阳性血清和2例HBVDNA阴性血清样品，分别取40ul加HBV裂解液10ul，混匀，置98℃煮沸15分钟，14000rpm离心10分钟，取2ul作为模板。以F与q1为复合探针。按实施例二操作，进行PCR扩增。图8为已知含量(102-10-4纳克)的标准反应孔产生的门槛荧光循环数CT对起始模板量对数作图的标准曲线，通过待检血清的CT值，根据标准曲线得到待检血清的HBV DNA血清含量，2份HBV阴性血清未见荧光响应，2份HBV DNA阳性血清的CT值分别为9和14，其血清HBV DNA含量分别为8.75微克/毫升和0.85微克/毫升。
Claims (8)
1.一种复合基因探针，它由长短不同但具有互补序列的两条探针构成，长探针5’端连接荧光分子，3’端连接延伸阻断分子，短探针3’端连接淬灭分子，所述长探针可以与待检测基因的部分序列杂交。
2.根据权利要1所述的复合探针，其中所述长探针由20-40个核苷酸组成，所述短探针由5-25个核苷酸组成。
3.根据权利要求2所述的复合探针，其中所述的长探针由25-28个核苷酸组成，所述的短探针由15-20个核苷酸组成。
4.根据权利要求2所述的复合探针，其中所述长探针上连接的延伸阻断分子可以是磷酸或甘油，所述短探针上连接的淬灭分子可以是甲基红、QSY-T或罗丹明。
5.根据权利要求1-4任一项所述的复合探针，其中探针上连接的荧光分子和淬灭分子的数量为1-5个。
6.根据权利要求1所述的复合探针在基因检测中的使用方法，它包括如下步骤：
(1)制备复合探针；
(2)合成上、下游引物；
(3)PCR扩增，每个循环退火或延伸时读取荧光值；
(4)以模板起始浓度的对数对门槛荧光的循环数作回归分析，制
作标准曲线，对待检测基因的浓度进行定量分析。
7.根据权利要求1所述的复合探针在基因荧光定性、定量杂交分析、医学诊断中的用途。
8.根据权利要求14所述的用途，尤其是复合探针在多基因检测及分型、多位点基因突变分析中的应用。
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| CN106755460A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-05-31 | 北京化工大学 | 一种单碱基突变检测方法 |
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| CN106755460A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-05-31 | 北京化工大学 | 一种单碱基突变检测方法 |
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