CN108426932A - 一种基于三链连环dna的电化学生物传感器及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器及制备方法，设计了内环探针和外环探针，当两个探针互补时，形成DNA小环；在适当的pH条件下，小环之间通过Hoogsteen键和Watson‑Crick键进行自组装，形成连环核酸链；再通过捕获探针、连接探针的帮助，将连环DNA长链连接在金电极上，六氨合钌通过静电作用吸附在DNA骨架上，通过检测六氨合钌的电化学信号，实现对miRNA的检测。该生物传感器在1fM到10nM内对靶标miRNA‑21准确检测，检测限为1.63fM。该生物传感器可直接检测没有预处理血清样品中的miRNA；可用于检测其他生物标志物，在临床诊断及预后方面有很好的应用前景。

Description

一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器及制备方法
技术领域
本发明属于电化学生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器及制备方法。
背景技术
微小RNA（miRNA）是一类小的内源性非编码RNA，其大约由22-25个核苷酸组成，能够通过翻译抑制，mRNA降解和蛋白质合成抑制等负调节基因表达。研究表明，miRNA在多种生物过程中起着重要的调节作用，如过敏性疾病，造血分化，心血管疾病和癌症。此外，已经证明，miRNA可被释放到体液内的循环中，可以以非常稳定的形式在血清或血浆中检测到。miRNA-21在宫颈癌，结肠癌，非小细胞肺癌，化脓性汗腺炎和卵巢癌中显着上调，因此开发一种简单可靠，灵敏检测miRNA的方法对临床癌症的诊断，治疗和预后非常有意义。
基于miRNA在疾病诊断和预后中的重要性，迫切需要找到灵敏可靠的检测miRNA的方法。为了实现对miRNA高灵敏检测，许多课题组已经做了大量的工作，包括基于微阵列的技术，荧光，Northern印迹和定量逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）等。尽管这些方法实现了对miRNA准确可靠的检测，但这些方法也有一定的缺陷，如重复性差，耗时，成本高且需要专业实验技能。电化学传感器因为其检测限低，特异性强，便携等特点，被广泛应用于各种生物标志物的检测，如用电化学传感器检测三磷酸腺苷，miRNA，双链DNA和肿瘤外泌体。
众所周知，pH在调节生命活动和许多生物进程（如细胞凋亡，酶催化和肿瘤生长）中起着至关重要的作用。 由于这些原因，开发pH敏感的传感器或纳米材料对于疾病诊断，预后和药物释放尤为重要。三链连环DNA是基于Watson-Crick和Hoogsteen碱基对形成的，除正常的嘌呤和嘧啶配对外，还包含碱基三联体C-G•C +和T-A•T。第三链中胞嘧啶N3的质子化需要酸环境，而T-A•T结构需要中性条件。当三联体DNA片段等量分布于TAT和CGC时，微酸性pH值是形成三链连环DNA的最佳条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于三链连环DNA的超灵敏检测miRNA的电化学生物传感器及制备方法和应用。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种基于三链连环DNA的超灵敏检测miRNA的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为2mm的金电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净；
（2）取10µL、1µM的捕获探针固定液滴加到电极表面，加盖，室温孵育180min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（3）取10µL、2mM的巯基己醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，加盖，室温孵育90min，封闭电极表面的非特异性活性位点，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（4）取10µL含目标探针miRNA-21的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得电极上，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（5）取10µL、1µM的连接探针缓冲液滴加到步骤（4）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（6）取10µL各含2µM的内环探针与外环探针的杂交缓冲液滴加到步骤（5）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（7）将含有50µM六氨合钌的电化学检测液通N2，15min；
（8）步骤（6）所得电极置于步骤（7）所得电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.2电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
步骤（1）的具体方法为：将直径为2mm的金电极在新鲜配制的Piranha溶液（浓H2SO4：30%H2O2=3:1 v : v）中浸泡20min，然后依次用1、0.3、0.5µm的Al2O3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，超纯水清洗，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，在0.95V出现一个尖锐的还原峰，在1.2~1.4V范围内出现三个小的，连续的氧化峰。
DNA的预处理：将装有DNA序列的ep管在离心机中5000rpm，离心5min，加入适量默克水，得到浓度为100µM的DNA溶液，然后用含有500mM NaCl，1mM EDTA的pH 7.4的10mMTris-HCl稀释至10µM，实验过程所有用到的DNA均按此进行预处理；
捕获探针固定液的制备：在9µL，含有500mM NaCl，1mM EDTA，10mM TCEP的pH 7.4 的10mM Tris-HCl缓冲液中加入1µL，10µM的捕获探针，95℃加热5min，然后置于暗处2h内冷却至室温，使捕获探针形成发夹结构；
巯基己醇溶液的制备：取适量巯基己醇加至超纯水中，制成2mM的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
杂交缓冲液的制备：在9µL，含有500mM NaCl，1mM EDTA，1mM MgCl2的pH 7.4 10mMTris-HCl的缓冲液中加入1µL待测浓度的目标探针，混匀；
连接探针缓冲液的制备：在9µL，含有500mM NaCl，1mM EDTA，1mM MgCl2的pH 7.4 10mMTris-HCl的缓冲液中加入1µL，10µM的连接探针，混匀；
IRP与ORP杂交缓冲液的制备：分别取5µL，4µM的IRP与ORP制成2µM的缓冲液，然后95℃加热5min，置于暗处冷却至室温，形成三链连环DNA连接的由许多小环组成的长核酸链；
电化学检测液的制备：pH 7.4的10mM Tris-HCl中含有50µM的六氨合钌，混匀，冰箱4℃保存，备用；
电化学工作站为CHI 660C，采用三电极系统，工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极；
冲洗电极所用缓冲液为pH 7.4 10mM的Tris-HCl缓冲液。
该传感器组装中由表1所示的CP、LP、IRP、ORP 4条ssDNA单链和一条RNA单链通过自组装形成。
表1. 该传感器所用DNA和RNA序列
所述的制备方法制备的一种基于三链连环DNA的超灵敏检测miRNA的电化学生物传感器，用于miRNA-21的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，所准备电极为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银为参比电极，在8ml、10mM 的pH 5.0~9.0的Tris-HCl缓冲液中进行测试；
（2）用差分脉冲伏安法对miRNA-21进行检测，电压范围-0.6-0.2V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.5s。
本发明所用试剂均市售可得；
本发明适用于所有肿瘤细胞中miRNA-21表达上调的检测。
本发明的有益成果：
（1）构建了基于三链连环DNA的信号放大型超灵敏检测方法，产生强电化学信号，构建过程简单快速，无需标记且不需要任何酶参与。
（2）该生物传感器属于信号增强型传感器，整个过程不会有电化学信号产生，在最后一步，电活性物质与连环DNA结合，产生强烈电信号，背景信号低，减少了假阳性的概率。
（3）该生物传感器具有高度的通用性，可延伸于检测其他类型的DNA或RNA生物标志物，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的构建流程示意图。
图2为传感器在不同pH环境中的DPV响应。
图3A为实施例1中不同浓度目标物的电流响应。
图3B为实施例1中不同浓度目标物的电流响应标准曲线图。
图4A为本方法检测6例卵巢癌患者和6例正常人血清样本中miRNA-21的结果。
图4B为本方法检测6例卵巢癌患者和6例正常人血清样本的平均miRNA-21量。
具体实施方式：
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1，基于三链连环DNA的超灵敏电化学生物传感器用于测定溶液中不同浓度的目标物miRNA-21，得到传感器的电流响应标准工作曲线。
（1）将直径为2mm的金电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净；
（2）取10µL，1µM的捕获探针固定液滴加到电极表面，加盖，室温孵育180min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（3）取10µL，2mM的巯基己醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，加盖，室温孵育90min，封闭电极表面的非特异性活性位点，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（4）取10µL含不同浓度目标探针miRNA-21（浓度分别为：0M、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM）的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得电极上，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干;
（5）取10µL，1µM的连接探针缓冲液滴加到步骤(4)所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（6）取10µL 含有内环探针与外环探针各2µM的杂交缓冲液滴加到步骤（5）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（7）将含有50µM六氨合钌的电化学检测液通N2，15min；
（8）步骤6所得电极置于步骤7所得电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.2电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
（9）测定结果如图3A所示，在1fM-10nM范围内，随着目标物浓度的增大，电化学信号增强，电流响应值增大。图3B为本实施例的电流响应标准工作曲线。
步骤（1）的具体方法为：将直径为2mm的金电极在新鲜配制的Piranha溶液（浓H2SO4：30%H2O2=3:1 v : v）中浸泡20min，然后依次用1、0.3、0.5µm的Al2O3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，超纯水清洗，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，在0.95V出现一个尖锐的还原峰，在1.2~1.4V范围内出现三个小的，连续的氧化峰。
DNA的预处理：将装有DNA序列的ep管在离心机中5000rpm，离心5min，加入适量默克水，得到浓度为100µM的DNA溶液，然后用含有500mM NaCl，1mM EDTA的pH 7.4的10mMTris-HCl稀释至10µM，实验过程所有用到的DNA和RNA均按此进行预处理；
捕获探针CP固定液的制备：在9µL，含有500mM NaCl，1mM EDTA，10mM TCEP的pH 7.4 的10mM Tris-HCl缓冲液中加入1µL，10µM的捕获探针，95℃加热5min，然后置于暗处2h内冷却至室温，使捕获探针形成发夹结构；
巯基己醇溶液的制备：取适量巯基己醇加至超纯水中，制成2mM的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
杂交缓冲液的制备：在9µL，含有500mM NaCl，1mM EDTA，1mM MgCl2的pH 7.4 10mMTris-HCl的缓冲液中加入1µL待测浓度的目标物miRNA-21（TP），混匀；
连接探针LP缓冲液的制备：在9µL，含有500mM NaCl，1mM EDTA，1mM MgCl2的pH 7.410mM Tris-HCl的缓冲液中加入1µL，10µM的连接探针，混匀；
IRP与ORP杂交缓冲液的制备：分别取5µL，4µM的IRP与ORP制成2µM的缓冲液，然后95℃加热5min，置于暗处冷却至室温，形成三链连环DNA连接的由许多小环组成的长核酸链；
电化学检测液的制备：pH 7.4的10mM Tris-HCl中含有50µM的六氨合钌，混匀，冰箱4℃保存，备用；
电化学工作站为CHI 660C，采用三电极系统，工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极；
冲洗电极所用缓冲液为pH 7.4 10mM的Tris-HCl缓冲液。
该传感器组装中由表1所示的CP、LP、IRP、ORP 4条ssDNA单链和一条RNA单链通过自组装形成。
表1. 该传感器所用DNA和RNA序列
实施例2，基于三链连环DNA的超灵敏电化学生物传感器应用于实际血清样品中的miRNA-21含量检测
（1）按本发明所述制备方法构建电化学生物传感器，使用电化学工作站三电极体系进行测试，银/氯化银为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的传感器为工作电极，在8ml、10mM的pH 6的电化学检测液（内含血清样品，血清样品与10mM电化学检测液体积比为1:1）中进行测试；
（2）用差分脉冲伏安法对上述电化学检测液进行检测，电势范围-0.6~0.2，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.5s；
（3）测定结果如图4所示，患病者血清中miRNA-21的表达明显高于正常人，卵巢癌患者中miRNA-21的表达量约是正常人血清中miRNA-21的2.2倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器及制备方法
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggccgtcaac atcagtctga taagctaaac atgatgacgg cc 42
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagagagaga gagagagagg ccgtcatcat 30
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctctctctc tgcatgcatg catgcactct ctctctctct ctctctacgt acgtacgtac 60
gttctctctc tc 72
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgcatgcatg catgcagaga gagagagaga gagagaacgt acgtacgtac gt 52

Claims (7)

1.一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
（1）将直径为2mm的金电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净；
（2）取10µL、1µM的捕获探针固定液滴加到电极表面，加盖，室温孵育180min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（3）取10µL、2mM的巯基己醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，加盖，室温孵育90min，封闭电极表面的非特异性活性位点，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（4）取10µL目标探针miRNA-21的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得电极上，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（5）取10µL、1µM的连接探针缓冲液滴加到步骤（4）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（6）取10µL各含2uM的内环探针与外环探针的杂交缓冲液滴加到步骤（5）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，N2吹干；
（7）将含有50µM六氨合钌的电化学检测液通N2，15min；
（8）步骤（6）所得电极置于步骤（7）所得电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.2电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
2.根据权利要求1所述的一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体方法为：
将直径为2mm的金电极在新鲜配制的Piranha溶液中浸泡20min，然后依次用1、0.3、0.5µm的Al2O3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，超纯水清洗，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35~1.6V电位下扫描，在0.95V出现一个尖锐的还原峰，在1.2~1.4V范围内出现三个小的，连续的氧化峰，即完成金电极的处理。
3.根据权利要求1所述的一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：
（1）捕获探针固定液的制备：在9µL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP的pH7.410mM Tris-HCl缓冲液中加入1µL、10µM的捕获探针，95℃加热5min，然后置于暗处2h内冷却至室温，使捕获探针形成发夹结构；
（2）巯基己醇溶液的制备：取巯基己醇加至超纯水中，制成2mM的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
（3）杂交缓冲液的制备：在9µL，含有500mM NaCl、1mM EDTA、1mM MgCl2的pH 7.4 10mMTris-HCl的缓冲液中加入1µL待测浓度的目标探针，混匀；
（4）连接探针缓冲液的制备：在9µL，含有500mM NaCl，1mM EDTA，1mM MgCl2的pH 7.410mM Tris-HCl的缓冲液中加入1µL，10µM的连接探针，混匀；
（5）内环探针与外环探针的杂交缓冲液的制备：分别取5µL、4µM的内环探针与外环探针制成2µM的杂交缓冲液，然后95℃加热5min，置于暗处冷却至室温，形成由许多小环组成的三链连环DNA长核酸链；
（6）电化学检测液的制备：pH 7.4的10mM Tris-HCl中含有50µM六氨合钌，混匀，冰箱4℃保存，备用。
4.根据权利要求1所述的一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的捕获探针序DNA序列为：SHCH2CH2CH2CH2CH2CH2-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC；
连接探针DNA序列为：GAGAGAGAGAGAGAGAGAGGCCGTCATCAT；
内环探针IRP的DNA序列为：TCTCTCTCTCTGCATGCATGCATGCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACGTACGTACGTACGTTCTCTCTCTC；
外环探针ORP的DNA序列为：TGCATGCATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACGTACGTACGTACGT。
5.根据权利要求1所述的一种基于三链连环DNA的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：DNA的预处理：将装有DNA序列的ep管在离心机中5000rpm，离心5min，加入默克水，得到浓度为100µM的DNA溶液，然后用含有500mM NaCl，1mM EDTA的pH 7.4的10mM Tris-HCl稀释至10µM，过程所有用到的DNA均按此进行预处理。
6.如权利要求1所述方法制备获得的电化学生物传感器。
7.如权利要求6所述电化学生物传感器用于miRNA-21的检测。
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