CN114703256B - 检测植物Pb2+的DNAzyme荧光传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器。所述传感器是由四条碱基互补配对的DNA链组成的DNA四面体，其中一条链或者四条链上带有DNAzyme，DNAzyme链与带有单RNA位点的底物链互补配对；所述底物链的5’端设有荧光素基团，3’端设有或者不设有淬灭基团，所述带有DNAzyme的DNA链3’端设有淬灭基团。该生物传感器能够检测植物提取物中的Pb²⁺，具有高度灵敏度和选择性，可通过快速检测植物体内Pb²⁺水平来识别和跟踪Pb²⁺污染区域。

Description

检测植物Pb2+的DNAzyme荧光传感器

技术领域

本发明属于生物检测传感器技术领域，具体涉及一种检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器。

背景技术

铅离子(Pb²⁺)是一种威胁人类健康的普遍存在的污染物。当重金属铅被排放到土壤环境中，在土壤中生长的植物会吸收铅，从而影响植物健康；铅污染植物后，通过食物链进入人体，从而影响人体健康。当人食用了铅污染的植物，铅就会进入人体内影响人的健康。过量的铅会对人的肾脏、胃肠道、血液系统、心血管系统、生殖系统和神经系统造成伤害，容易造成肾衰竭、食欲不振、高血压、心脏病、抑郁症、贫血和骨质疏松等病症。

对于Pb²⁺的检测方法，传统上主要依赖于一些复杂的分析检测技术，如原子吸收光谱(AAS)，原子发射光谱(AES)，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)，毛细管电泳(CE)、X射线荧光光谱(XFS)和伏安法等。尽管这些技术可以精确测定样品中的铅浓度，但目前主要用于实验室分析，且大部分的传统检测方法均受到一些限制。例如，ICP-MS的方法检出限低，线性范围广，但是对检测技术人员要求较高，而设备运行成本也相当高。AAS的铅检测方法获得的数据准确，但是需要的样品量较多，分析时间较长，而且样品制备处理步骤繁琐。XFS受组件性能的限制检出限较高，数据处理与校正数学模型多采用经验系数，适用范围不够广泛。伏安法的电化学铅检测方法受到准确度低、特异性低、检测范围窄的限制等等。这些限制使得这些方法用于现场检测的难度非常大。因此研发满足特异性高、灵敏便捷、样品制备简单的Pb²⁺检测方法就显得非常迫切。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器。

一种检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器，所述传感器是由四条碱基互补配对的DNA链组成的DNA四面体，其中一条链或者四条链上带有DNAzyme，DNAzyme链与带有单RNA位点的底物链互补配对。

所述底物链的5’端设有荧光素基团，3’端设有或者不设有淬灭基团。

优选的，所述荧光素基团为Alexa488基团。

所述带有DNAzyme的DNA链3’端设有淬灭基团。

所述四条碱基的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1-4所示。

所述底物链的序列为：GGAATCACTrAGGCACTCAGG。

所述DNAzyme的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：5所示。

所述DNA四面体与底物链摩尔比例为2:1，检测反应体系pH为6.5。

所述检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器在检测植物提取物或植物体内Pb²⁺浓度中的应用。

本发明的有益效果：本发明通过融合DNAzyme和DNA四面体纳米结构，开发了一系列的Pb²⁺荧光生物传感器，并证明了这些生物传感器对植物提取物中Pb²⁺的检测能力。发明人在DNA四面体的A探针上设计融合一条DNAzyme链，在与DNAzyme链互补配对的底物链中心设计了一个核糖核苷酸(rA)，在传感器与Pb²⁺结合时底物链被“切割”，造成底物链断裂，释放出游离的标记有荧光基团的底物链，从而产生荧光信号。对该生物传感器进行了设计优化，通过将四条DNAzyme融合到DNA四面体中并使用量子产率显著高于FAM的Alexa488作为荧光基团，进一步提高了生物传感器的灵敏度，改进的生物传感器能够检测植物提取物中的Pb²⁺。因此，本发明研发的Pb²⁺生物传感器在通过快速检测植物体内Pb²⁺水平来识别和跟踪污染区域方面具有巨大的潜力。本发明的传感器的最低检测限可达到4.24nM，灵敏度远高于一般的Pb²⁺检测方法，改良后的Pb²⁺生物传感器可以将土壤中生长的Pb²⁺污染植物区分出来，简单的样品制备步骤也为在土壤生长的含Pb²⁺植物中Pb²⁺的检测提供快速简便的方法。本发明为为实现植物细胞内Pb²⁺的原位检测奠定基础，由于DNA四面体作为一种新兴的纳米材料，可以进入植物体内。本研究实现了将DNA四面体和DNAzyme组合的荧光传感器传递进入植物体细胞内。这也是首次将荧光标记的Pb²⁺传感器在植物细胞内可视化，该方法为实现植物细胞内Pb²⁺的原位检测提供了技术支撑。

附图说明

图1为Pb²⁺生物传感器设计示意图；

图中，a，b为DNAzyme结合到四面体DNA纳米结构的A链上，在Pb²⁺结合后，底物链在核糖核苷酸位点(rA)处被DNAzyme切割，FAM荧光基团被释放；Pb-SUB-1仅在其5'末端用FAM进行了修饰，而Pb SUB-2在其5'和3'末端分别用FAM和BHQ1进行了修饰；c显示DNAzyme和底物链的序列。

图2为DNAzyme链与底物链的比例优化。

图3为反应体系pH的优化。

图4为V1生物传感器的Pb²⁺梯度光谱图。生物传感器在0-1000nM Pb²⁺的荧光光谱。

图5为V1生物传感器的Pb²⁺梯度线性关系图，显示Pb²⁺浓度和荧光信号之间相关性的图。

图6为V1传感器的金属离子特异性。

图7为优化后传感器的设计。

图8为Pb²⁺生物传感器的优化前后比较。

图9为V3生物传感器的Pb²⁺梯度光谱图。

图10为V3生物传感器的Pb²⁺梯度线性关系图，显示Pb²⁺浓度和荧光信号之间相关性的图。

图11为烟草提取物与反应体系的比例条件探索。

图12为烟草提取物与传感器的孵育时间条件探索。

图13为V3传感器检测在不同的含Pb²⁺培养基上生长的烟草Pb²⁺含量的荧光信号对比。图14为V3传感器检测在不同的含Pb²⁺土壤上生长的烟草Pb²⁺含量的荧光信号对比。

图15为不同Pb²⁺含量的土壤上生长的烟草进行荧光共聚显微镜观察。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下述实施例所用实验材料及仪器：寡核苷酸均由TaKaRa生物技术合成和纯化，核苷酸的溶解和稀释都用Milli-Q水(18MΩcm电阻率)配制。PBS缓冲液来自Coolaber(中国，pH 7.2-7.4)，Pb(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、Cd(NO₃)₂、Co(NO₃)₂、Fe(NO₃)₂、Cu(NO₃)₂、Ca(NO₃)₂由上海市计量测试技术研究院(SIMT,Shanghai,China,1g/L)提供。HEPES缓冲液来自TIANDZ(中国，1M,pH 6.5)。KCl来自AMRESCO-VWR(美国)。所有的溶液都用milli-Q水(18MΩcm电阻率)配制。日立F-7000荧光分光光度计，比色皿为日立原装四通低散射微量样品池(650-0171)。Zeiss倒置共聚焦显微镜(LSM 880)。

实施例1 DNA生物传感器的设计

发明人设计基于DNA四面体和DNAzyme的Pb²⁺生物传感器(图1)。Pb²⁺传感器的“底座”是由四条碱基互补配对的DNA链组成的DNA四面体，其中一条长链上带有DNAzyme，DNAzyme链与带有单RNA位点(rA)的底物链(Pb-SUB)互补配对。无Pb²⁺存在时，底物链的FAM(羧基荧光素)被底物链3'端和其互补配对的DNAzyme链3'端的BHQ1(Dark Quencher，黑洞淬灭基团)淬灭，不发荧光。当Pb²⁺存在时，底物链被切割，FAM激发荧光。本发明设计了图1中a和b两种Pb²⁺生物传感器，a与b设计差别在于底物链不同，Pb-SUB-1与Pb-SUB-2区别在于底物链在3'末端是否有BHQ1淬灭基团。

DNA生物传感器序列如表1所示。A-ENZ、B、C、D是组装四面体的四条链。Pb-SUB链是DNAzyme的Pb²⁺特异性底物链，rA代表一种腺苷核糖核苷酸。A-ENZ，B，C，D组装成四面体，记为TSP1，TSP1+Pb-sub-2(FAM)记为V1。

表1 DNA生物传感器序列

将表1中的所有DNA链溶于milli-Q水中，用Nanodrop 2000定量为50μM分装存于-20℃冰箱。取定量为50μM的A-ENZ、B、C、D四条链各10μL，加入60μL的1×PBS buffer(pH7.2-7.4)，使用BIO-RAD T100 PCR仪加热至95℃10min，然后冷却至4℃10min，组装成5μM的四面体100μL。

实施例2四面体与底物链的比例优化

在Pb²⁺传感器中，底物链与DNAzyme链之间形成分子间二倍体结构，底物链与DNAzyme链之间的比例会对Pb²⁺和DNAzyme的反应产生影响，发明人对不同的四面体与底物链比值进行优化，用PBS组装合成5μM的四面体：A-ENZ，B，C，D组装成四面体，记为TSP1，用HEPES溶液稀释Pb-SUB-2(FAM)和Pb(NO₃)₂溶液至5μM，设置总体系为300μL。设置DNA四面体TSP1的终浓度为0.3μM，Pb-SUB-2(FAM)终浓度分别设置为0.05、0.1、0.15、0.2、0.3μM，即四面体与底物链的摩尔比分别为：6:1，3:1，2:1，1.5:1，1:1，Pb²⁺实验浓度设为0和50nM，共设置五组(10个)处理，每个处理设置3个重复。五组试验处理除底物链添加量不同，其他条件完全相同。

将以上混合液置于37℃金属浴孵育2h。将孵育后的反应液吸取一定体积，置于比色皿中，在预热后的荧光光度计波长510nm到600nm处进行荧光波长测量。

试验结果表明，在DNAzyme链与底物链的摩尔比为2:1时，获得最高信噪比，即四面体：底物链比例条件为2:1(图2)。

实施例3反应体系pH的优化

反应体系的pH对Pb²⁺生物传感器也会造成一定的影响，而且由于最终目标是实现植物体的Pb²⁺检测，植物体pH为6.0-7.5。因此需要对Pb²⁺生物传感器反应体系pH进行条件优化。发明人通过对反应缓冲液HEPES溶液的不同pH值设置来探索Pb²⁺生物传感器的最佳工作条件，设置了6.0，6.5，7.0，7.5四组pH，信噪比F/F₀为Pb²⁺浓度为50μM的荧光值与Pb²⁺浓度为0的荧光值的比值。

试验结果表明，在pH为6.5时，获得最高信噪比(图3)。因此，反应缓冲液pH值为6.5时拥有最高信号强度。

实施例4 V1生物传感器的Pb²⁺梯度

在确定底物链的设计为Pb-SUB-2(FAM)，DNAzyme链：底物链比例条件为2:1，反应体系的pH设置为6.5的条件下，发明人对该V1传感器(四面体TSP1+Pb-SUB-2(FAM))进行了Pb²⁺梯度试验。将Pb²⁺浓度范围设置为0到1000nM，将测试荧光范围设置为510-650nm。

试验结果表明，随着Pb²⁺浓度的增加，荧光光谱显著上升，而且在大约520nm处有最大荧光值(图4)。接下来，发明人将520nm处的最大荧光值进行汇总处理。结果显示在0-50nM范围内，V1传感器的荧光信号与Pb²⁺浓度呈良好的线性关系。在50-1000nM范围，随着Pb²⁺浓度增加，荧光值增大，且逐渐呈现饱和状态(图5)。

实施例5金属离子特异性

为了研究V1传感器对Pb²⁺的特异性，使用V1生物传感器检测其他二价金属离子，例如Mg²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和Ca²⁺。信噪比F/F₀为Pb²⁺浓度为1μM的荧光值与Pb²⁺浓度为0的荧光值的比值。

试验结果表明，该传感器在Pb²⁺存在的情况下显示出显著的荧光增强，但在其他离子存在的情况下则没有明显荧光增强反应(图6)。这个研究结果表明基于荧光的Pb²⁺生物传感器对Pb²⁺具有高度特异性。

实施例6 Pb²⁺生物传感器的优化

在进行了传感器的体外条件优化后，发明人对该传感器进行了设计方面的改良(如图7)。由原来一个DNA四面体结合一个DNAzyme优化为一个DNA四面体结合四个DNAzyme，且继续在这个基础上对底物链(Pb-SUB)进行优化，将底物链5’端的FAM基团优化为AlexaFluor 488。Pb²⁺传感器的“底座”是由四条碱基互补配对的DNA链组成的DNA四面体，四条长链上各带有一个DNAzyme，DNAzyme链与带有单RNA位点(rA)的底物链(Pb-SUB)互补配对。无Pb²⁺存在时，底物链的FAM/Alex488荧光基团被底物链3'端和与其互补配对的DNAzyme链3'端的BHQ1淬灭，不发荧光。当Pb²⁺存在时，底物链rA碱基位点被切割造成底物链断裂，5’端的FAM/Alex 488被激发荧光。

改良后的DNA四面体序列如表2所示，A-ENZ、B-ENZ、C-ENZ、D-ENZ四条DNA链上均携带DNAzyme，四条链共同组成DNA四面体。底物链为Pb-SUB-2(Alex488)，与A-ENZ、B-ENZ、C-ENZ、D-ENZ四条链上的DNAzyme部分互补配对。Pb-SUB-2(Alex488)链5'端被AlexaFluor488修饰，3'端被BHQ1修饰。

表2优化后Pb²⁺生物传感器的序列设计

实施例7优化前后生物传感器的比较

在设计好优化后的四面体和底物链后，发明人需要对这几种组合的传感器进行体外实验比较。首先用PBS组装合成两种5μM的四面体：A-ENZ，B，C，D组装成的四面体命名为TSP1。A-ENZ，B-ENZ，C-ENZ，D-ENZ组装的四面体命名为TSP2。然后用HEPES溶液稀释Pb-SUB-2(FAM)和Pb-SUB-2(Alex488)至5μM，配置50μM的Pb(NO₃)₂溶液。为了方便阐述，发明人把TSP1+Pb-sub-2(FAM)命名为V1，TSP2+Pb-sub-2(FAM)命名为V2，TSP2+Pb-sub-2(Alex488)命名为V3。发明人对这三种传感器进行了体外对比试验。根据之前优化的实验条件，设置反应体系终浓度：DNA四面体0.3μM，底物链0.15μM，反应液pH为6.5，Pb²⁺浓度为0和1μM，共设置三组(6个)处理，每个处理设置3个重复。6个试验处理除传感器的组合不同，其他条件完全相同。

试验结果表明，V2传感器信噪比优于V1，表明有四条DNAzyme链的四面体设计优于只有一条DNAzyme链的四面体的设计(图8)。在优化了四面体的DNAzyme链数量后，发明人对底物链的荧光基团也进行了优化。由于Alexa488比FAM具有更好的光稳定性和量子产量，发明人还将Alexa488取代FAM来进一步改进生物传感器(命名为V3 Pb²⁺生物传感器)。最终信噪比F/F₀结果表明V3＞V2＞V1，且V3的荧光信噪比与V1和V2呈极显著差异，说明优化四面体和底物链后的Pb²⁺生物传感器显著提高了信噪比。

实施例8优化后V3 Pb²⁺生物传感器的Pb²⁺梯度

在优化改良传感器后，为了表征灵敏度和线性关系，发明人对优化后的V3传感器进行Pb²⁺梯度实验。发明人通过测量在波长为510-650nm范围内，Pb²⁺浓度在0到500nM范围内的一系列的荧光值来测试V3生物传感器的Pb²⁺梯度。试验结果表明，随着Pb²⁺浓度的增加，荧光光谱显著上升，而且大约在波长520nm处有最大荧光值(图9)。发明人进一步将520nm处的最大荧光值进行汇总处理，结果表明，当Pb²⁺浓度在0-500nM范围内，V3传感器的荧光信号与Pb²⁺浓度呈良好的线性关系(图10)。

经过计算处理，V3生物传感器的拟合方程为y＝0.74+0.073x，其检测限(LOD)为4.24nM(3σ)，定量限(LOQ)为5.96nM(10σ)，表明该生物传感器具有很高的灵敏度。在线性范围方面，V1传感器的线性范围为0-50nM，而V3传感器的线性范围为0-500nM。与V1传感器相比，V3生物传感器的Pb²⁺线性检测范围更大。这些结果表明，V3生物传感器在信噪比和检测范围方面都优于以前的版本。

实施例9 Pb²⁺传感器与植物提取物的兼容性

在优化了生物传感器的体外反应条件后，进一步将传感器应用于植物上。由于植物提取物含有盐、DNA酶和RNA酶等成分，可能会干扰Pb²⁺生物传感器的功能，因此需要探索传感器对植物提取液的兼容性条件。发明人在植物半体外条件下(含有植物提取液的体外条件)，通过在正常烟草(不含Pb²⁺)提取液体系中添加外源Pb(NO₃)₂对改良前荧光传感器进行了半体外实验条件摸索。

发明人通过在反应体系里添加不同数量的植物提取物，观察V1生物传感器的耐受量。在实验过程中，首先用水基方法提取到烟草提取液，设置孵育的总反应体积为300μL，通过添加不同体积的的烟草提取液，来探索传感器的耐受性。在300μL反应体系里分别添加100μL、50μL和10μL的烟草提取液，即烟草提取液体积/反应体积为1:3，1:6和1:30。发明人发现在1:6，1:30的比例条件下，在添加外源Pb(NO₃)₂时荧光信号值和背景荧光值几乎接近，而且背景荧光值(F₀)很高，F/F₀接近于1。这说明烟草提取物中的某些成分和Pb²⁺生物传感器发生了反应，导致在没有添加外源Pb(NO₃)₂和添加Pb(NO₃)₂差别不大。在继续降低提取物体积，烟草提取物体积与反应体系体积之比为1:30时，能看到明显的差别信号，而且与体积比为1:6和1:3的信噪比呈显著性差异，这说明利用V1 Pb²⁺生物传感器检测植物提取物中的Pb²⁺是可行的(图11)。

对烟草提取物与传感器的孵育时间条件探索：考虑到植物提取物中存在的DNA酶和RNA酶可能会降解生物传感器并降低信噪比，通过优化反应时间或许可以降低这种干扰，于是对V1传感器进行孵育时间条件探索。发明人通过优化反应时间来进一步提高信噪比。发明人对孵育时间设置了0.5h、1h、1.5h和2h，在这四个时间点进行荧光测量，进行信噪比的计算整理。结果表明，当反应时间从0.5h延长到1h时，信号增加，但当反应时间进一步延长时信号下降，说明1h是半体外实验的最佳孵育时间(图12)。

在不同Pb²⁺含量的培养基上生长的烟草荧光检测：分别在含有0(对照)和1.5mg/mLPb²⁺的1/2MS培养基上培育本氏烟草。在先前优化条件即提取液/反应体系为1:30，孵育时间为1h的基础上，对两组烟草提取液进行荧光值测量。结果显示，在含Pb²⁺培养基上生长的烟草制备的提取物中Pb²⁺荧光信号显著高于对照(0mg/mL Pb²⁺)培养基上生长的烟草制备的提取物(图13)，这表明V3生物传感器可以分辨出受Pb²⁺污染的植物。结果表明，优化的V3生物传感器可以通过简单的样品制备有效地检测溶液和植物中的Pb²⁺。

在不同Pb²⁺含量的土壤上生长的烟草荧光检测：为了观察土壤环境下，V3传感器的适用性，发明人对土培烟草进行了施加和不施加Pb²⁺的处理，进而比对烟草提取液荧光信号。对施Pb²⁺处理组，每天施加1ml 100μg/mL Pb(NO₃)₂母液，连续添加10天。除施Pb²⁺外，其他管理方式相同。同样，在先前优化条件的基础上，对两组烟草进行荧光值测量。结果显示，在含Pb²⁺培养基上生长的烟草制备的提取物中的Pb²⁺荧光信号显著高于在对照(不含Pb)培养基上生长的烟草制备的提取物(图14)。结果表明，V3 Pb²⁺生物传感器可以将土壤上生长的Pb²⁺污染植物区分出来，而简单的样品制备也为土壤生长的Pb²⁺污染植物中Pb²⁺检测提供了简便易行、高效快捷的方法。

发明人对不同Pb²⁺含量的土壤上生长的烟草进行荧光共聚显微镜观察。对不同处理的烟草叶片注射浓度为3μM的TSP2和2μM Pb-SUB-2(Alex488)的传感器，避光环境下培养烟草1h后，在共聚焦显微镜下对不同处理的本氏烟草叶片进行荧光观察。发明人可以观察到，Pb²⁺生物传感器可以进入植物细胞内，发明人将图片经过ImageJ的Calibration Bar分析，得出在Pb²⁺处理土壤上生长的本氏烟草具有更强的荧光(图15)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 检测植物Pb2+的DNAzyme荧光传感器

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatatcctg agtgctccga gccggtcgaa gtgattcc 38

Claims (7)

1.一种检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器，其特征在于，所述传感器是由四条碱基互补配对的DNA链组成的DNA四面体，其中一条链或者四条链上带有DNAzyme，DNAzyme链与带有单RNA位点的底物链互补配对；所述四条碱基互补配对的DNA链的的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示；所述DNAzyme的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：5所示；所述底物链的序列为：GGAATCACTrAGGCACTCAGG。

2.根据权利要求1所述检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器，其特征在于，所述底物链的5’端设有荧光素基团，3’端设有或者不设有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器，其特征在于，所述荧光素基团为Alexa488基团。

4.根据权利要求1所述检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器，其特征在于，所述带有DNAzyme的DNA链3’端设有淬灭基团。

5.根据权利要求1所述检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器，其特征在于，所述四条碱基的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1-4所示。

6.根据权利要求1所述检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器，其特征在于，所述DNA四面体与底物链摩尔比例为2:1，检测反应体系pH为6.5。

7.权利要求1-6任一所述检测植物Pb²⁺的DNAzyme荧光传感器在检测植物提取物或植物体内Pb²⁺浓度中的应用。