CN107703115A - 一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法 - Google Patents

Abstract

一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，属于生物检测领域。本发明借助于Pb²⁺的存在可以加速硫代硫酸钠和2‑巯基乙醇对纳米金浸出的原理，将不同浓度的Pb²⁺加入到含有硫代硫酸钠和2‑巯基乙醇存在的Ag@Au复合纳米粒子中，使得Ag@Au纳米粒子的金壳浸出从而导致金壳厚度发生改变，加入信标分子后，产生不同的拉曼信号强度。根据Pb²⁺浓度和SERS信号强度之间的对应关系，可以实现Pb²⁺的定量检测。本发明方法检测速度快、检测成本低，并且具有超高的灵敏度和良好的特异性，可以满足实际样品中Pb²⁺的检测需求。

Description

一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法。

背景技术

重金属离子的污染是指由重金属或其化合物所造成的环境污染，重金属离子的污染很难在环境中被微生物降解，在人和动植物中富集，从而对环境和人类健康造成极大的危害。铅是一种可在人体和动物组织中富集的有毒重金属，主要来源于蓄电池、冶炼、五金、电镀、化妆品等行业，铅通过皮肤、消化道、呼吸道等方式进入体内与多种器官发生亲和作用，从而造成人体的神经机能失调、肾损伤、免疫系统损伤等，儿童、老人、免疫低的人群是最易受害的群体。铅对水生生物的安全浓度为0.16mg/mL，人体内正常的铅含量为0.1mg/mL。因此，铅对环境以及对人类的影响不可忽视，对铅含量的检测显得尤为重要。

目前传统的Pb²⁺检测方法包括火焰原子吸收光谱法、阳极溶出伏安法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、X射线荧光光谱法等。虽然这些方法可以实现Pb²⁺的检测，但是检测设备昂贵，样本前处理复杂耗时，因此有必要进一步开发新的适于普遍应用的Pb²⁺检测方法，以满足Pb²⁺的快速、简单、超灵敏的检测需求。

近年来，随着激光技术、纳米科技和计算机技术的迅猛发展，表面增强拉曼光谱(SERS)已经在界面和表面科学、材料分析、生物、医学、食品安全、环境监测和国家安全等领域得到了广泛应用。SERS是指当一些分子或官能团被吸附到某些金属或半导体的特殊表面，其拉曼散射信号强度会大幅增加的一种奇特的光谱现象。随后，人们在金属和半导体的纳米级粗糙表面、纳米粒子和纳米线的表面也观察到了SERS现象，SERS具有极高的表面检测灵敏度,甚至可以达到单分子检测水平，从而使得利用SERS测定低浓度的样品成为了可能。金属纳米粒子特殊的形貌特征、表面结构及电子组态决定着其诸多性能，是人们一直关注的焦点。Ag纳米粒子表面的SERS增强要比Au纳米粒子高，而Au纳米粒子因相对于Ag具有更好的稳定性和生物兼容性而备受青睐，而核壳纳米粒子通常具有其单组分纳米粒子所没有的独特性质。有研究报道，将Au包裹在Ag纳米粒子的表面形成的Ag@Au复合纳米粒子结构，不仅可以增强Ag的SERS信号强度，同时Au壳增强了纳米粒子的生物兼容性，从而扩大了Ag@Au的复合纳米粒子的应用范围，其中SERS效应的强弱与纳米粒子的Au壳厚度密切相关。

发明内容

要解决的技术问题：传统的Pb²⁺仪器检测方法所需设备昂贵，样本前处理复杂耗时，并且需要专业的操作人员进行操作，不适于普遍应用，仅适于中心实验室分析。而基于功能性DNAzyme识别Pb²⁺的检测方法需要合成DNA分子，并修饰到载体表面，从而使得检测成本和检测时间都有所提高。

技术方案：本发明公开了一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，包括如下步骤：

（1）Ag纳米粒子的合成

称取85mg AgNO₃置于500mL锥形瓶中，然后加入250mL的超纯水，将AgNO₃配置成2mM的浓度，在加热搅拌器上将AgNO₃溶液搅拌加热至沸腾后，迅速加入3~10mL质量分数为l％的柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌40min，关闭加热开关，继续搅拌直到溶液冷却至室温，反应后产生的黄色溶液即为Ag纳米粒子。

（2）Ag@Au纳米粒子的合成

取步骤（1）制备的Ag纳米粒子50mL，在剧烈搅拌的状态下，同时滴加2mL 8mM的盐酸羟胺和质量分数为0.1%的氯金酸溶液2~10mL，继续搅拌反应30min，从而得到Ag@Au纳米粒子。

（3）Pb²⁺的检测以及SERS光谱的测定

将步骤（2）制备的Ag@Au纳米粒子在6000r/min的条件下离心10min，用反应缓冲液将纳米粒子重悬并稀释3倍，将其分装到250μL PCR管中100μL/每管，再向每管中分别加入5μL浓度为0ng/mL、0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL的Pb²⁺，在室温条件下孵育1~3h，然后在6000r/min的转速下离心5min，弃掉上清，将纳米粒子用100μL超纯水进行重悬，然后在每管中加入信标分子均使得其终浓度为2~10μM，室温孵育40min后，再进行离心处理以去除多余的信标分子，用100μL超纯水重悬后用拉曼光谱仪测定每管中的SERS信号强度。

本发明所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法的步骤（1）中l％的柠檬酸钠水溶液加入的体积为6mL。

本发明所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法的步骤（2）中0.1%的氯金酸溶液的加入体积为5mL。

本发明所所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法的步骤（2）中反应缓冲液的组成为：20mM的甘氨酸，0.5M的Na₂S₂O₃，0.3M的2-巯基乙醇，并将溶液用NaOH调整到pH10.0。

本发明所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法的步骤（2）中信标分子为4-硝基苯硫醇。

本发明所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法的步骤（2）中加入4-硝基苯硫醇的终浓度为5μM。

有益效果：本发明借助于Pb²⁺的存在可以加速硫代硫酸钠和2-巯基乙醇对纳米金浸出的原理，将不同浓度的Pb²⁺加入到含有硫代硫酸钠和2-巯基乙醇存在的Ag@Au复合纳米粒子中，使得Ag@Au纳米粒子的金壳浸出从而导致金壳厚度发生改变，由于不同厚度的Ag@Au复合纳米粒子对信标分子的SERS增强效果不同，加入信标分子后，产生不同的拉曼信号强度。Pb²⁺的浓度越高，Ag@Au复合纳米粒子的Au壳厚度越小，SERS信号强度越小，根据Pb²⁺浓度和SERS信号强度之间的对应关系，可以实现Pb²⁺的定量检测。

附图说明

图1 Pb²⁺检测的SERS光谱图。

图2 Pb²⁺检测的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法，包括如下具体步骤：

（1）Ag纳米粒子的合成

称取85mg AgNO₃置于500mL锥形瓶中，然后加入250mL的超纯水，将AgNO₃配置成2mM的浓度，在加热搅拌器上将AgNO₃溶液搅拌加热至沸腾后，迅速加入6mL质量分数为l％的柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌40min，关闭加热开关，继续搅拌直到溶液冷却至室温，反应后产生的黄色溶液即为Ag纳米粒子。

（2）Ag@Au纳米粒子的合成

取步骤（1）制备的Ag纳米粒子50mL，在剧烈搅拌的状态下，同时滴加2mL 8mM的盐酸羟胺和质量分数为0.1%的氯金酸溶液5mL，继续搅拌反应30min，从而得到Ag@Au纳米粒子。

（3）Pb²⁺的检测以及灵敏度的分析

将步骤（2）制备的Ag@Au纳米粒子在6000r/min的条件下离心10min，用反应缓冲液将纳米粒子重悬并稀释3倍（反应缓冲液的组成为：20mM的甘氨酸，0.5M的Na₂S₂O₃，0.3M的2-巯基乙醇，并将溶液用NaOH调整到pH10.0），将其分装到250μL PCR管中100μL/每管，再向每管中分别加入5μL浓度为0ng/mL、0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL的Pb²⁺，在室温条件下孵育1~3h，然后在6000r/min的转速下离心5min，弃掉上清，将纳米粒子用100μL超纯水进行重悬，然后在每管中加入信标分子4-硝基苯硫醇均使得其终浓度为5μM，室温孵育40min后，再进行离心处理以去除多余的信标分子，用100μL超纯水重悬后用拉曼光谱仪测定每管中的SERS信号强度。根据Pb²⁺浓度和SERS信号强度之间的对应关系得出，在0.005~1ng/mL的浓度范围内，线性关系良好，并通过计算得出Pb²⁺的检测限为2.6pg/mL。

（4）特异性分析

选取四种其他的重金属（Hg²⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Fe²⁺）作为目标分子，验证此方法的特异性。在0.01ng/mL的添加浓度下，SERS信号的强度与加入重金属离子前的SERS信号强度没有变化，说明这几种重金属离子不能使得纳米金浸出，Ag@Au纳米粒子的结构没有发生改变，SERS信号强度不会发生变化，不能实现这几种重金属离子的检测，而对Pb²⁺的检测具有良好的特异性。

（5）添加回收实验

以阴性饮用水为样本添加不同含量的Pb²⁺，通过此方法测定添加回收结果，在0.02ng/mL、0.06ng/mL、0.08g/mL、0.2ng/mL、0.4g/mL的添加浓度下，测得添加回收结果为95.2 ~97.5%，添加回收结果良好，因此此方法适用于水样本中Pb²⁺的检测。

Claims (6)

1.一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）Ag纳米粒子的合成

称取85mg AgNO₃置于500mL锥形瓶中，然后加入250mL的超纯水，将AgNO₃配置成2mM的浓度，在加热搅拌器上将AgNO₃溶液搅拌加热至沸腾后，迅速加入3~10mL质量分数为l％的柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌40min，关闭加热开关，继续搅拌直到溶液冷却至室温，反应后产生的黄色溶液即为Ag纳米粒子；

（2）Ag@Au纳米粒子的合成

取步骤（1）制备的Ag纳米粒子50mL，在剧烈搅拌的状态下，同时滴加2mL 8mM的盐酸羟胺和质量分数为0.1%的氯金酸溶液2~10mL，继续搅拌反应30min，从而得到Ag@Au纳米粒子；

（3）Pb²⁺的检测以及SERS光谱的测定

将步骤（2）制备的Ag@Au纳米粒子在6000r/min的条件下离心10min，用反应缓冲液将纳米粒子重悬并稀释3倍，将其分装到250μL PCR管中100μL/每管，再向每管中分别加入5μL浓度为0ng/mL、0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL的Pb²⁺，在室温条件下孵育1~3h，然后在6000r/min的转速下离心5min，弃掉上清，将纳米粒子用100μL超纯水进行重悬，然后在每管中加入信标分子均使得其终浓度为2~10μM，室温孵育40min后，再进行离心处理以去除多余的信标分子，用100μL超纯水重悬后用拉曼光谱仪测定每管中的SERS信号强度。

2.根据权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，其特征在于所述的步骤（1）中l％的柠檬酸钠水溶液加入的体积为6mL。

3.根据权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，其特征在于所述的步骤（2）中0.1%的氯金酸溶液的加入体积为5mL。

4.根据权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，其特征在于所述的步骤（2）中反应缓冲液的组成为：20mM的甘氨酸，0.5M的Na₂S₂O₃，0.3M的2-巯基乙醇，并将溶液用NaOH调整到pH10.0。

5.根据权利要求1所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，其特征在于所述的步骤（2）中信标分子为4-硝基苯硫醇。

6.根据权利要求5所述的一种基于Ag@Au纳米粒子检测铅离子的SERS方法，其特征在于所述的步骤（2）中加入4-硝基苯硫醇的终浓度为5μM。