CN105352933A - 一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法。采用金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料作为基底，将巯基化修饰的副溶血性弧菌适配体加入到上述制备所得的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料中孵育，从而将副溶血性弧菌适配体固定在基底上。将被测物与修饰有副溶血性弧菌适配体的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料混合，加入具有拉曼信号Cy3修饰的副溶血性弧菌适配体进行孵育，然后进行拉曼光谱检测。基于适配体与沙门氏菌的特异性结合，实现对食品中副溶血性弧菌的检测。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

Description

一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)系弧菌科弧菌属，革兰氏染色阴性，兼性厌氧菌，多为形态杆菌或稍弯曲弧菌。它是一种海洋嗜盐细菌，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品。人们在食用了生的或是未煮熟的感染了副溶血性弧菌的海产品后，可能出现腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛等胃肠炎反应。在美国、日本、东南亚等国家，发生副溶血性弧菌引起的食物中毒事件较多。在我国由副溶血性弧菌引起的食物中毒多发生在沿海地区，华东沿海水产品携带该菌率可高达60.4％。由副溶血性弧菌所引发的食物中毒，在细菌性食物中毒中占有重要地位，从而被公认为是一种世界范围内的重要的食源性病原菌。因此建立准确、灵敏、快速的副溶血性弧菌检测技术对于食品安全具有重要意义。

目前已知的副溶血性弧菌检测方法中，传统的微生物检验需要经历增菌培养、分离培养、生化试验、血清学试验和神奈川试验，虽然对实验设备要求不高，但操作复杂，既耗时又不灵敏，不能达到快速检测的要求；新发展起来的实时荧光定量PCR技术，虽然能缩短检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，且灵敏度仍然不高；免疫学方法如酶联免疫吸附分析法、酶联荧光分析法、时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)、化学发光免疫分析法等，具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。近些年来，由于寡核苷酸适配体(aptamer)较之抗体有诸多优点：成本低，稳定性好，易于修饰等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。再加上其在标记技术上和稳定性方面的优势，近10多年来，适配体被当做抗体的替代性分子广泛地应用于生命科学等各个领域的研究工作中，诸如对疾病的诊断与治疗等。

拉曼散射由于蕴含分子振转能级的丰富信息，已成为物质分析的有力工具，特别是表面增强拉曼散射(SERS)技术的出现，使其检测灵敏度获得了极大的提高。近年来，SERS光谱以其高分辨率、高灵敏度、溶液干扰性小、稳定性好等特点被广泛应用于物理、材料、表面科学、环境化学、生物化学、有机化学甚至生物学的分析和研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法。本发明采用金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料作为基底，将巯基化修饰的副溶血性弧菌适配体加入到上述制备所得的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料中孵育，从而将副溶血性弧菌适配体固定在基底上。将被测物与修饰有副溶血性弧菌适配体的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料混合，加入具有拉曼信号Cy3修饰的副溶血性弧菌适配体进行孵育，然后进行拉曼光谱扫描。基于适配体与沙门氏菌的特异性结合，实现对食品中副溶血性弧菌的检测。具体检测原理如图1所示。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

实现本发明的具体方法：

一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：

1)拉曼增强基底的合成：采用反相微乳法首先制备得到二氧化硅纳米颗粒并进行表面氨基化修饰，同时利用硼氢化钠还原氯金酸的方法制备得到纳米金种子，然后将一定量上述制备得到的二氧化硅纳米颗粒与金种子进行反应，合成金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料基底。

2)适配体的固定化：将一定量巯基化修饰的适配体加入到上述制备所得的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料中孵育，从而将适配体固定在基底上。

3)副溶血性弧菌的检测：将待测液与修饰有适配体的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料混合，加入一定量的具有拉曼信号Cy3修饰的适配体，然后进行拉曼光谱检测。

具体的：步骤1)所述拉曼增强基底的合成具体操作为，取1mL正硅酸四乙酯，加入到445mL乙醇，5mL水，2mL浓氨水中，40℃加热搅拌混匀；然后加入60μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃恒温搅拌反应3h，制备得到氨基化二氧化硅纳米颗粒。接着取3mL1％的HAuCl₄溶液，加入200mL4℃预冷的纯水，1mL0.2mol/L的K₂CO₃，9mL新鲜配制的0.5mg/mLNaBH₄溶液，持续搅拌5min，制备得到金种子。取223μL氨基化二氧化硅纳米颗粒逐滴加入到180mL的金种子溶液中，剧烈搅拌反应2h，得到二氧化硅-金种子。同时将50mgK₂CO₃溶于200mL的PBS缓冲液中，加入3mL1％的HAuCl₄溶液搅拌反应20min。取0.5mL上述制备得到的二氧化硅-金种子加入其中，并加入100μLH₂O₂(200μmol/L)，反应3min，最后制备得到二氧化硅-金壳，即金包覆二氧化硅的核壳型纳米颗粒。

步骤2)所述的适配体固定化操作为，取金包覆二氧化硅核壳型纳米颗粒1mL，加入50μL适配体(10μmol/L)，室温孵育16小时。

步骤3)所述的检测，不同浓度的副溶血性弧菌样品与适配体修饰的金包覆二氧化硅核壳型纳米材料于37℃孵育45min，然后加入Cy3修饰的适配体继续孵育45min。之后于3000r/min离心5min，并清洗两次。样品重悬与缓冲液中上拉曼光谱仪检测。

本发明的优点在于：

1.本发明方法以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。

2.本发明以金包覆二氧化硅的核壳型纳米复合材料作为拉曼增强基底，具有贵金属的光谱特性，且试样制备快速，成本低等优点。

3.本发明中提供的检测方法与现有副溶血性弧菌的检测方法相比，具有灵敏度高的特点，其检测限可达到15cfu/mL。

附图说明

图1基于适配体识别表面增强拉曼检测副溶血性弧菌的示意图

图2金包覆二氧化硅核壳型纳米材料的透射电子显微镜图(TEM)

图3不同浓度的副溶血性弧菌引起的表面增强拉曼光谱图(A)，相对拉曼强度与副溶血性弧菌浓度的线性关系图(B)

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

1)拉曼增强基底的合成

首先制备氨基化二氧化硅纳米颗粒：取45mL乙醇，5mL水，2mL浓氨水于100mL圆底烧瓶中，40℃加热搅拌混匀。接着逐滴加入1mL正硅酸四乙酯继续搅拌4h，制备得到二氧化硅纳米颗粒。加入60μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃恒温搅拌反应3h。反应结束后以转速10,000rpm离心20min。弃去上清，加入适量无水乙醇，超声分散洗涤。即制备得到氨基化二氧化硅纳米颗粒。

接着制备金种子：首先向200mL4℃预冷的纯水中加入3mL1％的HAuCl₄溶液并搅拌，待分散均匀后加入1mL0.2mol/L的K₂CO₃水溶液，9mL新鲜配制的0.5mg/mLNaBH₄溶液，溶液由亮黄色变为棕褐色再变为酒红色。继续搅拌5min，得到直径为2nm-5nm的金种子，将其置于4℃冰箱保存备用。

最后制备金包覆二氧化硅的核壳型纳米颗粒：取223μL氨基化二氧化硅纳米颗粒逐滴加入到180mL的金种子溶液中，剧烈搅拌反应2h，使得金种子附着在二氧化硅表面，得到二氧化硅-金种子。同时将50mgK₂CO₃溶于200mL的PBS缓冲液中，加入3mL1％的HAuCl₄溶液搅拌反应20min。取0.5mL上述制备得到的二氧化硅-金种子加入其中，并加入100μLH₂O₂(200μmol/L)，反应3min，最后制备得到二氧化硅-金壳，即拉曼增强基底-金包覆二氧化硅的核壳型纳米颗粒。图2为金包覆二氧化硅的核壳型纳米颗粒的透射电子显微镜图(TEM)。

2)适配体的固定化

取金包覆二氧化硅核壳型纳米颗粒1mL，加50μL适配体(10μmol/L)，使适配体最终浓度为500nmol/L，于室温孵育16h。然后加入0.1mol/LNaCl陈化24h，最后以12000r/min离心15min，弃上清，并用PBS缓冲液清洗2次，重悬于1mLPBS缓冲液中备用。

3)缓冲液中副溶血性弧菌的检测

以平板计数法得到浓度为1.5×10⁷cfu/mL的副溶血性弧菌菌液，再将该菌液梯度稀释至1.5×10⁶cfu/mL，1.5×10⁵cfu/mL，1.5×10⁴cfu/mL，1.5×10³cfu/mL，1.5×10²cfu/mL；以步骤2)合成的适配体修饰的金包覆二氧化硅的复合材料作为拉曼增强试剂与捕获探针，取该复合物160μL与20μL的待测样品混合于37℃孵育45min。然后加入16μL(10μmol/L)修饰有ROX信号分子的适配体，于37℃孵育45min。之后于3000r/min离心5min，并清洗两次。样品重悬与缓冲液中上拉曼光谱仪检测。图3A所示为浓度范围在15～1.5×10⁵cfu/mL副溶血性弧菌引起的拉曼光谱图。由图可见，随着副溶血性弧菌浓度的增加，拉曼强度也相应增高。以1590cm^-1为定量特征峰，图3B所示为副溶血性弧菌线性曲线图。副溶血性弧菌在15～1.5×10⁵cfu/mL浓度范围内，与1590cm^-1处相对拉曼强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝68.6x-13.062(R＝0.9936)，最低检出限为15cfu/mL。

实施例2

1)拉曼增强基底的合成

首先制备氨基化二氧化硅纳米颗粒：取45mL乙醇，5mL水，2mL浓氨水于100mL圆底烧瓶中，40℃加热搅拌混匀。接着逐滴加入1mL正硅酸四乙酯继续搅拌4h，制备得到二氧化硅纳米颗粒。加入60μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃恒温搅拌反应3h。反应结束后以转速10,000rpm离心20min。弃去上清，加入适量无水乙醇，超声分散洗涤。即制备得到氨基化二氧化硅纳米颗粒。

接着制备金种子：首先向200mL4℃预冷的纯水中加入3mL1％的HAuCl₄溶液并搅拌，待分散均匀后加入1mL0.2mol/L的K₂CO₃水溶液，9mL新鲜配制的0.5mg/mLNaBH₄溶液，溶液由亮黄色变为棕褐色再变为酒红色。继续搅拌5min，得到直径为2nm-5nm的金种子，将其置于4℃冰箱保存备用。

最后制备金包覆二氧化硅的核壳型纳米颗粒：取223μL氨基化二氧化硅纳米颗粒逐滴加入到180mL的金种子溶液中，剧烈搅拌反应2h，使得金种子附着在二氧化硅表面，得到二氧化硅-金种子。同时将50mgK₂CO₃溶于200mL的PBS缓冲液中，加入3mL1％的HAuCl₄溶液搅拌反应20min。取0.5mL上述制备得到的二氧化硅-金种子加入其中，并加入100μLH₂O₂(200μmol/L)，反应3min，最后制备得到二氧化硅-金壳，即拉曼增强基底-金包覆二氧化硅的核壳型纳米颗粒。图2为金包覆二氧化硅的核壳型纳米颗粒的透射电子显微镜图(TEM)。

2)适配体的固定化

取金包覆二氧化硅核壳型纳米颗粒1mL，加50μL适配体(10μmol/L)，使适配体最终浓度为500nM，于室温孵育16h。然后加入0.1mol/LNaCl陈化24h，最后以12000r/min离心15min，弃上清，并用PBS缓冲液清洗2次，重悬于1mLPBS缓冲液中备用。

3)虾肉中副溶血性弧菌的检测

25g冷冻的新鲜虾肉绞碎，与225mL含3％NaCl(w/v)的碱性蛋白胨混合均质10min，然后过滤去除大颗粒和悬浮物，取上清作为实际样品。配制不同浓度的副溶血性弧菌加入待测溶液中。用本发明方法进行检测，并计算回收率，结果如表1所示。

表1本发明方法检测虾肉中副溶血性弧菌的结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法。其特征在于：采用金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料作为基底，将巯基化修饰的副溶血性弧菌适配体加入到上述制备所得的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料中孵育，从而将副溶血性弧菌适配体固定在基底上。将被测物与修饰有副溶血性弧菌适配体的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料混合，加入具有拉曼信号Cy3修饰的副溶血性弧菌适配体进行孵育，然后进行拉曼光谱检测。在一定浓度范围内，副溶血性弧菌的数量与拉曼信号强度呈正相关，以达到对沙门氏菌定量检测的目的。

2.如权利要求1所述的一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法，其特征在于：采用反相微乳法首先制备得到二氧化硅纳米颗粒并进行表面氨基化修饰，同时利用硼氢化钠还原氯金酸的方法制备得到纳米金种子，然后将一定量上述制备得到的二氧化硅纳米颗粒与金种子进行反应，制备金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料基底。

3.如权利要求1所述的一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法，其特征在于：巯基化修饰的副溶血性弧菌菌适配体序列为5’-SH-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3’，具有拉曼信号Cy3修饰的副溶血性弧菌适配体序列为5’-Cy3-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3’。

4.如权利要求1所述的一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法，其特征在于：在一定浓度范围内，副溶血性弧菌的数量与拉曼光谱信号强度呈正相关，对照1590cm^-1的发光峰信号强度建立标准曲线。