CN106501235A - 基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法。采用氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金(GO/Fe3O4@Au)复合纳米粒子作为活性增强基底，将巯基化修饰的副溶血性弧菌适配体加入到上述制备所得的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子中孵育，从而将副溶血性弧菌适配体固定在基底上。将被测物与修饰有副溶血性弧菌适配体的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子混合，再加入另一条具有拉曼信号TAMRA修饰的副溶血性弧菌适配体进行孵育，然后进行拉曼光谱检测。基于适配体与副溶血性弧菌的特异性结合，实现对食品中副溶血性弧菌的检测。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

Description

基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼 效应的副溶血性弧菌检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法，属于食品安全检测领域。
背景技术
副溶血性弧菌是一种嗜盐、革兰氏阴性杆状细菌，广泛分布在海洋环境和多种海洋产品中。食用了生的或是未煮熟的感染了副溶血性弧菌的海产品会引发突发性食物中毒，出现腹痛、腹泻、头痛、恶心、呕吐等症状，重症患者还可能出现脱水、休克、甚至死亡。该病原菌是在中国、日本等许多亚洲国家引发食源性疾病的主要原因之一。我国食源性疾病监测网数据显示，副溶血性弧菌食物中毒高居沿海沿江省份微生物食源性疾病首位。因此建立一种快速、准确、便捷的检测方法，对于从源头预防副溶血性弧菌的污染，预防中毒事故的发生具有重要意义。
检测副溶血性弧菌的方法主要包括传统的平板计数法、分子生物学法、免疫学方法等。平板计数法检验程序较繁琐，在检测时间、灵敏度与特异性等方面存在缺陷。新发展起来的实时荧光定量PCR技术，虽然能缩短检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，且灵敏度仍然不高；免疫学方法如酶联免疫吸附分析法、电化学免疫分析法、酶联荧光分析法等，具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的成本高，周期长，且稳定性不佳。近些年来，寡核苷酸适配体(aptamer)因其为体外制备获得，周期短成本低，且稳定性好，易于修饰，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注，广泛应用于生命科学等各个领域的研究工作中。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种可以高效检测低浓度分子的方法，具有选择性好和灵敏度高的优点，被广泛应用于物理、材料、表面科学、环境化学、生物化学、有机化学甚至生物学的分析和研究。表面增强拉曼散射的高灵敏性依赖于其增强基底的高活性和高普适性，目前应用最为广泛的增强基底多为贵金属类和碳基材料类，通过表面等离子体共振，形成“热点”效应以达到增强信号的效果。
发明内容
本发明目的在于克服上述不足之处，提供一种基于适配体识别和氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金(GO/Fe3O4@Au)复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法。本发明采用GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子作为基底，将巯基化修饰的副溶血性弧菌适配体加入到上述制备所得的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子中孵育，从而将副溶血性弧菌适配体固定在基底上。将被测物与修饰有副溶血性弧菌适配体的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子混合，再加入另一条具有拉曼信号TAMRA修饰的副溶血性弧菌适配体进行孵育，然后进行拉曼光谱扫描。基于适配体与副溶血性弧菌的特异性结合，实现对食品中副溶血性弧菌的检测。具体检测原理如图1所示。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。
实现本发明的具体方法：
基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法，包括以下步骤：
1)拉曼增强基底的合成：采用水热法首先制备得到Fe3O4纳米颗粒并进行表面氨基化修饰，同时利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备得到纳米金粒子，然后将一定量上述制备得到的Fe3O4纳米颗粒与金纳米颗粒进行反应，合成Fe3O4@Au纳米材料，接着将一定量上述制备得到的Fe3O4@Au纳米材料与一定量氧化石墨烯混合反应，最终制得GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子。
2)适配体的固定化：将一定量巯基化修饰的适配体加入到上述制备所得的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子中孵育，从而将适配体固定在基底上。
3)副溶血性弧菌的检测：将待测液与修饰有适配体的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子混合，再加入一定量的另一条具有拉曼信号TAMRA修饰的适配体，然后进行拉曼光谱检测。
具体的：步骤1)所述拉曼增强基底的合成具体操作为，称取0.9g氯化铁溶解到28mL乙二醇中，加入2.4g乙酸钠，0.696g十二烷基磺酸钠，搅拌30min后，置于反应釜中200℃反应8h得到Fe3O4纳米颗粒；取30mg上述Fe3O4纳米颗粒加入1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，20mL乙醇，室温搅拌反应6h，制备得到氨基化Fe3O4纳米颗粒。同时取49mL超纯水和0.5mL氯金酸溶液(1％)煮沸10min，然后加入0.5mL柠檬酸钠(5％)继续煮沸搅拌10min，制备得到纳米金颗粒。取1mL氨基化Fe3O4纳米颗粒，10mL纳米金溶液，混合室温搅拌反应3h，得到Fe3O4@Au纳米粒子。取1mL上述制备得到的Fe3O4@Au纳米粒子加入1mL GO(1mg/mL)和10mL超纯水，室温搅拌6h，最后制备得到GO/Fe3O4@Au纳米粒子。
步骤2)所述的适配体固定化操作为，取GO/Fe3O4@Au纳米粒子1mL，加入25μL适配体(10μmol/L)，室温孵育16小时。
步骤3)所述的检测，不同浓度的副溶血性弧菌样品与适配体修饰的GO/Fe3O4@Au纳米粒子于37℃孵育45min，然后加入另一条TAMRA修饰的适配体继续孵育45min。之后于3000r/min离心5min，并清洗两次。样品重悬于缓冲液中上拉曼光谱仪检测。
本发明的优点在于：
1.本发明方法以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。
2.本发明以GO/Fe3O4@Au纳米粒子作为拉曼增强基底，具有高表面增强拉曼活性，且试样制备快速，成本低等优点。
3.本发明中提供的检测方法与现有副溶血性弧菌的检测方法相比，具有灵敏度高的特点，其检测限可达到14cfu/mL。
附图说明
图1基于适配体识别和GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子增强拉曼效应检测副溶血性弧菌的示意图
图2 GO/Fe3O4@Au复合纳米材料的透射电子显微镜图
图3不同浓度的副溶血性弧菌引起的表面增强拉曼光谱图(A)，相对拉曼强度与副溶血性弧菌浓度的线性关系图(B)
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
1)拉曼增强基底的合成
首先制备氨基化Fe3O4纳米颗粒：称取0.9g氯化铁溶解到28mL乙二醇中，加入2.4g乙酸钠，0.696g十二烷基磺酸钠，室温搅拌30min，然后转移至反应釜中置于200℃反应8h，自然冷却后取出，用乙醇清洗3次，置于50℃烘箱干燥10h。取30mg研磨好的Fe3O4颗粒溶解于20mL乙醇中，接着逐滴加入1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌6h，磁分离弃去上清，加入适量无水乙醇，超声分散洗涤。即制备得到氨基化Fe3O4纳米颗粒。
然后制备纳米金颗粒：首先取49mL超纯水加入0.5mL 1％的氯金酸溶液并搅拌煮沸10min，接着加入0.5mL 5％的柠檬酸钠溶液，于煮沸状态下继续搅拌10min，溶液由无色变为酒红色。移去热源继续搅拌15min，得到直径为～15nm的纳米金颗粒，将其置于4℃冰箱保存备用。
接着制备Fe3O4@Au纳米粒子：取1mL氨基化Fe3O4纳米颗粒，加入10mL纳米金溶液和1mL超纯水，混合均匀后于室温搅拌反应3h，磁分离去除未连接的纳米金颗粒，用乙醇清洗3次，得到Fe3O4@Au纳米粒子。
最后制备GO/Fe3O4@Au复合纳米颗粒：取1mL Fe3O4@Au纳米粒子，1mL GO(1mg/mL)，加入到10mL超纯水中，室温剧烈搅拌反应6h，磁分离去除未反应的GO，最终制得GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子，即拉曼增强基底-GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子。图2为GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子的透射电子显微镜图。
2)适配体的固定化
取GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子1mL，加25μL适配体(10μmol/L)，使适配体最终浓度为250nmol/L，于室温孵育16h。然后加入0.1mol/L NaCl陈化24h，磁分离富集，弃上清，并用PBS缓冲液清洗2次，重悬于1mL PBS缓冲液中备用。
3)缓冲液中副溶血性弧菌的检测
以平板计数法得到浓度为1.4×107cfu/mL的副溶血性弧菌菌液，再将该菌液梯度稀释至1.4×106cfu/mL，1.4×105cfu/mL，1.4×104cfu/mL，1.4×103cfu/mL，1.4×102cfu/mL，1.4×10cfu/mL；以步骤2)合成的适配体修饰的GO/Fe3O4@Au纳米粒子作为拉曼增强试剂与捕获探针，取该复合物200μL，30μL的待测样品和24μL(10μmol/L)修饰有TAMRA信号分子的适配体混合并用缓冲液补足体系至300μL，37℃孵育45min。之后磁分离去除未结合的细菌，并清洗两次。样品重悬于50μL缓冲液中上拉曼光谱仪检测。图3A所示为浓度范围在1.4×102～1.4×106cfu/mL副溶血性弧菌引起的拉曼光谱图。由图可见，随着副溶血性弧菌浓度的增加，拉曼强度也相应增高。以1330cm-1为定量特征峰，图3B所示为副溶血性弧菌线性曲线图。副溶血性弧菌在1.4×102～1.4×106cfu/mL浓度范围内，与1330cm-1处相对拉曼强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝671.4x-884.8(R＝0.9964)，最低检出限为1.4cfu/mL。
实施例2
1)拉曼增强基底的合成
首先制备氨基化Fe3O4纳米颗粒：称取0.9g氯化铁溶解到28mL乙二醇中，加入2.4g乙酸钠，0.696g十二烷基磺酸钠，室温搅拌30min，然后转移至反应釜中置于200℃反应8h，自然冷却后取出，用乙醇清洗3次，置于50℃烘箱干燥10h。取30mg研磨好的Fe3O4颗粒溶解于20mL乙醇中，接着逐滴加入1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌6h，磁分离弃去上清，加入适量无水乙醇，超声分散洗涤。即制备得到氨基化Fe3O4纳米颗粒。
然后制备纳米金颗粒：首先取49mL超纯水加入0.5mL 1％的氯金酸溶液并搅拌煮沸10min，接着加入0.5mL 5％的柠檬酸钠溶液，于煮沸状态下继续搅拌10min，溶液由无色变为酒红色。移去热源继续搅拌15min，得到直径为～15nm的纳米金颗粒，将其置于4℃冰箱保存备用。
接着制备Fe3O4@Au纳米粒子：取1mL氨基化Fe3O4纳米颗粒，加入10mL纳米金溶液和1mL超纯水，混合均匀后于室温搅拌反应3h，磁分离去除未连接的纳米金颗粒，用乙醇清洗3次，得到Fe3O4@Au纳米粒子。
最后制备GO/Fe3O4@Au复合纳米颗粒：取1mL Fe3O4@Au纳米粒子，1mL GO(1mg/mL)，加入到10mL超纯水中，室温剧烈搅拌反应6h，磁分离去除未反应的GO，最终制得GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子，即拉曼增强基底-GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子。
2)适配体的固定化
取GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子1mL，加25μL适配体(10μmol/L)，使适配体最终浓度为250nmol/L，于室温孵育16h。然后加入0.1mol/L NaCl陈化24h，磁分离富集，弃上清，并用PBS缓冲液清洗2次，重悬于1mL PBS缓冲液中备用。
3)三文鱼肉中副溶血性弧菌的检测
25g冷冻的三文鱼肉绞碎，与225mL含3％NaCl(w/v)的碱性蛋白胨混合均质10min，然后过滤去除大颗粒和悬浮物，取上清作为实际样品。配制不同浓度的副溶血性弧菌加入待测溶液中。用本发明方法进行检测，并计算回收率，结果如表1所示。
表1本发明方法检测三文鱼中副溶血性弧菌的结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
序列表
〈110〉 江南大学
〈120〉 基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法
〈130〉
〈160〉 1
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 1
tctaaaaatg ggcaaagaaa cagtgactcg ttgagatact 40

Claims (4)

1.基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法。其特征在于：采用氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金(GO/Fe3O4@Au)复合纳米粒子作为活性增强基底，将巯基化修饰的副溶血性弧菌适配体加入到上述制备所得的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子中孵育，从而将副溶血性弧菌适配体固定在基底上。将被测物与修饰有副溶血性弧菌适配体的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子混合，再加入另一条具有拉曼信号TAMRA修饰的副溶血性弧菌适配体进行孵育，然后进行拉曼光谱检测。在一定浓度范围内，副溶血性弧菌的数量与拉曼信号强度呈正相关，以达到对副溶血性弧菌定量检测的目的。
2.如权利要求1所述的基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于：GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子与副溶血性弧菌的适配体通过化学键合的方法偶联，形成适配体修饰的GO/Fe3O4@Au复合纳米粒子。
3.如权利要求1所述的基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于：巯基化修饰的副溶血性弧菌适配体序列为5’-SH-TCT AAA AAT GGG CAA AGA AAC AGT GAC TCG TTG AGA TAC T-3’，具有拉曼信号TAMRA修饰的副溶血性弧菌适配体序列为5’-TAMRA-TCT AAA AAT GGG CAA AGA AAC AGT GACTCG TTG AGA TAC T-3’。
4.如权利要求1所述的基于氧化石墨烯/四氧化三铁/胶体金复合纳米粒子增强拉曼效应的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于：在一定浓度范围内，副溶血性弧菌的数量与拉曼光谱信号强度呈正相关，对照1330cm-1的发光峰信号强度建立标准曲线。
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