CN114054002A - 磁性纳米复合材料及其制备方法、应用 - Google Patents

磁性纳米复合材料及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种磁性纳米复合材料及其制备方法和应用，所述磁性纳米复合材料具有核壳结构，内核为Fe3O4，壳层为SiO2，在所述内核与壳层之间还有中间层；所述中间层来自聚合物；所述聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、聚多巴胺中的至少一种。本申请提供的磁性纳米复合材料可以实现快速提取样本DNA，并将提取的DNA应用于qPCR(实时荧光定量)检测技术。

Description

磁性纳米复合材料及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及一种磁性纳米复合材料及其制备方法、应用，属于磁性纳米材料技术领域。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常见于海水环境以及鱼、虾、蟹、贝等海产品中。人类如果误食了VP污染的食物会引起食物中毒，导致肠胃不适，上吐下泻，发热等症状，严重者还会危及生命；VP感染海洋生物后会使其出现弧菌病，给水产养殖业造成巨大经济损失，VP对人类的健康安全和财产安全造成了严重的损害和威胁。VP引起的食物中毒发病率高、分布范围广，是国内外极为重视的公共安全问题。在我国，副溶血性弧菌已被列为海产品安全卫生检测监控的主要项目，尤其是鱼虾类和贝壳类海产品。目前，企业、政府等对副溶血性弧菌的常见检测方法包括国家标准GB4789.7-2013规定的传统分离培养鉴定法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法。分离培养鉴定法是行业的“黄金标准”技术成熟、检测成本低，但是检测过程耗时长，完成一次检测需要7天左右。免疫学的分析方法是基于抗原抗体结合，辅以免疫反应放大实验，与分离培养鉴定方法相比提高了检测灵敏度，但仍然需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程。分子生物学的检测方法是通过对检测菌的基因序列进行扩增从而完成检测，与前面两种方法相比，该检测方法灵敏度高，特异性好，应用范围广。但是分子生物学的检测过程中样本DNA的提取过程较复杂，样本DNA提取的成功与否直接影响检测结果。因此，开发一种快速，简便的DNA提取方法是解决副溶血性弧菌的分子生物学检测的关键。
DNA的提取是许多现代生物分子研究的关键步骤，也是启动其他下游活动的第一步(如扩增、测序、杂交、克隆和生物检测)。传统的DNA提取方法基于离心，沉淀，色谱柱等方法，这些方法复杂、费时费力、需要接触有毒试剂，不利于副溶血性弧菌的快速检测。近年来，随着磁性纳米技术的发展，磁性纳米粒子(Magnetic nanoparticles,MNPs)被广泛应用于蛋白质、核酸、细菌、病毒的分离检测。通过磁性MNPs提取分离生物大分子有很多优点：(1)磁性纳米材料粒径小，比表面积大，吸附能力强；(2)在外加磁场条件下，能快速分离固体和液体，不影响生物活性；(3)易于分离操作，不需要大型昂贵的仪器。目前MNPs有很多种制备方法，包括碱性共沉淀法、溶胶-凝胶法、溶剂热法等。Esmael等人，采用共沉淀法制备超顺磁性Fe3O4，需加热80℃，反应时间长达20h。张敏制备了Fe3O4 MNPs，用于DNA吸附，反应温度200℃，反应时间长达48h，现有技术制备MNPs的方法操作步骤复杂，耗时长。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供了一种磁性纳米复合材料，该磁性纳米复合材料为以Fe3O4核为中心，化合物A为中间层，SiO2为壳层的核壳结构，制备方法简单、快速。
本申请通过磁性纳米复合材料快速提取样本DNA，并将提取的DNA应用于qPCR(实时荧光定量)检测技术。此外，还通过琼脂糖凝胶电泳实验和荧光吸收检测DNA提取效果。最终使用此材料对虾样本进行DNA提取，提取的DNA成功用于qPCR检测出副溶血性弧菌，2h即可完成检测，检测结果与实际结果一致。
传统的磁性四氧化三铁的制备需要在碱性条件下加热，且制备时间需要数个小时。本申请提供的磁性四氧化三铁的制备方法，将反应时间缩短到了10分钟，且简化了传统磁性材料制备方法，提高了DNA的提取效率，进而加快了副溶血性弧菌的检测速度，为副溶血性弧菌的快速检测提供新的思路。
根据本申请的第一方面，提供了一种磁性纳米复合材料，所述磁性纳米复合材料具有核壳结构，内核为Fe3O4，壳层为SiO2，在所述内核与壳层之间还有中间层；
所述中间层来自聚合物；
所述聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚多巴胺中的至少一种。
可选地，所述磁性纳米复合材料的粒径为50～200nm。
可选地，所述磁性纳米复合材料的粒径上限独立地选自200nm、150nm、100nm、80nm，下限独立地选自50nm、150nm、100nm、80nm。
可选地，粒径分布在80～150nm范围内的所述磁性纳米复合材料的体积含量为70～85％。
根据本申请的第二方面，提供了一种上述磁性纳米复合材料的制备方法，所述方法至少包括：
(1)获得含有Fe3O4的分散液；
(2)将含有所述分散液和化合物A的原料，反应I，得到中间产物；
(3)将含有中间产物、碱源I、硅源的原料，反应II，即可得到所述磁性纳米复合材料。
可选地，Fe3O4、聚合物和硅源的质量比为1:4～8：10～40。
可选地，Fe3O4、聚合物和硅源的质量比为1：4～6：10～40。
可选地，在所述步骤(1)中，所述含有Fe3O4的分散液的获得至少包括以下步骤：
将含有Fe2+源、Fe3+源、碱源II、水和醇类化合物的物料，反应III，再加入柠檬酸钠，即可得到所述含有Fe3O4的分散液；
优选地，所述反应III的条件为：反应温度为20～30℃；反应时间为5～30min；
可选地，所述反应III的时间上限独立地选自30min、25min、20min、15min、10min，下限独立地选自5min、25min、20min、15min、10min。
可选地，所述Fe2+源、Fe3+源、水和醇类化合物的比例为0.5～1.5mmol：1.5～3.5mmol：5～15mL：5～15mL；
可选地，所述Fe2+源、Fe3+源、水和醇类化合物的比例为0.7～0.9mmol：1.5～1.7mmol：8～12mL：8～12mL；
可选地，所述碱源II和Fe2+源的体积摩尔比为1～2L/mol；
可选地，所述碱源II和Fe2+源的体积摩尔比上限独立地选自2L/mol、1.5L/mol，下限独立地选自1L/mol、1.5L/mol。
优选地，所述碱源II选自氨水、氢氧化钠中的至少一种。
可选地，所述含有Fe3O4的分散液的获得至少包括以下步骤：
将含有Fe2+源、Fe3+源、水和醇类化合物的溶液，除去氧气，加入碱源II，反应，将产物分散于柠檬酸钠溶液中，即可得到目标产物，最终将产物分散于水中，即为所述含有Fe3O4的分散液。
可选地，所述碱源II选自氨水、氢氧化钠中的至少一种。
可选地，所述步骤(2)在摇床上进行。
可选地，所述中间产物为含有去离子水的分散液。
可选地，所述步骤(2)至少包括：在所述分散液中加入聚合物，室温下在摇床中进行反应，结束后使用水洗涤，将产物溶于去离子水中，即可得到所述中间产物。
可选地，所述中间产物的浓度为5～20mg/mL。
可选地，所述中间产物的浓度上限独立地选自20mg/mL、18mg/mL、16mg/mL、14mg/mL、12mg/mL、10mg/mL、8mg/mL，下限独立地选自5mg/mL、18mg/mL、16mg/mL、14mg/mL、12mg/mL、10mg/mL、8mg/mL。
本申请中通过加入聚合物，使得到的磁性纳米复合材料中，在Fe3O4核和SiO2壳之间多了来自聚合物的薄层，可以增强Fe3O4核和SiO2壳的粘结性，同时也有助于改善Fe3O4核的分散性。
可选地，在所述步骤(2)中，所述反应I的条件为：反应温度为20～30℃；反应时间为12～20h。
可选地，所述反应I的时间上限独立地选自20h、18h、15h、13h，下限独立地选自12h、18h、15h、13h。
可选地，在所述步骤(3)中，所述碱源I选自氨水、氢氧化钠中的至少一种；
所述硅源选自正硅酸乙酯。
可选地，在所述步骤(3)中，所述反应II的条件为：反应温度为20～30℃；反应时间为1.5～6.5h。
可选地，所述反应II的时间上限独立地选自6.5h、4.5h、2.5h，下限独立地选自1.5h、4.5h、2.5h。
优选地，所述反应II在超声波设备中进行。
本申请中的反应II在超声波设备中进行，液体内部产生的强超声波引发出高能量气泡，气泡爆炸时，在微小的空间内瞬间产生巨大能量。本方法相比于传统的加热搅拌，操作更便捷，更安全。
可选地，所述步骤(3)至少包括以下步骤：
将含有中间产物、碱源I、硅源、水和醇类化合物的原料，反应II，得到溶液A，调节所述溶液A的pH至7.5～8.5，离心，得到的沉淀即为所述磁性纳米复合材料。
可选地，所述醇类化合物选自乙醇、甲醇中的至少一种。
可选地，所述中间产物、碱源I和硅源的比例为40～60mg:0.3～1.5mL:0.3～2mL。
优选地，所述中间产物、碱源I和硅源的比例为45～55mg:0.8～1.2mL:0.8～1.5mL。
可选地，所述调节所述溶液A的pH至7.5～8.5包括：通过pH调节物调节所述溶液A的pH至7.5～8.5。
本申请中，磁性纳米复合材料吸附DNA主要是因为二氧化硅的生物相容性良好，在一定条件下能特异的吸附DNA，所以硅源的含量是也是磁珠吸附量的重要参数。
所述pH调节物选自稀释后的盐酸、硫酸、氨水、氢氧化钠中的至少一种。
根据本申请的第三方面，还提供了一种DNA的提取方法，使用磁性纳米复合材料提取样品中的DNA，得到含有所述DNA的溶液；
所述磁性纳米复合材料选自上述磁性纳米复合材料、根据上述方法制备得到的磁性纳米复合材料中的任一种。
可选地，所述方法至少包括：
(1)将含有样品、裂解液和RNA酶的原料，65～75℃加热5～15min，离心，得到上清液；
(2)向所述上清液中加入溶液B，磁性分离，得到吸附样品DNA的磁性纳米复合材料，其中所述溶液B包括所述磁性纳米复合材料、结合液和醇类化合物，所述溶液B的pH为5～11；
(3)使用去蛋白液和漂洗液洗涤所述吸附样品DNA的磁性纳米复合材料，之后加入洗脱液，60～70℃孵育2～6min；磁性分离，得到含有待提取样品DNA的上清液。
本申请中，溶液B的pH会很大程度上影响制备得到的纳米复合材料表面的电荷分布情况，可以影响复合材料磁珠对DNA的静电吸附作用，必须严格控制溶液B的pH。
优选地，所述溶液B中的醇类化合物选自异丙醇。
优选地，调节溶液B pH的调节物选自盐酸和氢氧化钠。
可选地，所述盐酸和氢氧化钠的质量分数均为10％；
根据上述水产品DNA的提取方法提取得到的DNA作为检测水产品中副溶血弧菌的检测对象。
根据本申请的最后一方面，还提供了一种上述提取方法在检测副溶血弧菌中的应用。
可选地，所述方法至少包括：
(1)将含有DNA聚合酶、缓冲溶液、荧光染料的混合物和引物、含有待提取样品DNA的上清液混合，得到反应溶液；
(2)将所述反应溶液置于PCR扩增仪上进行检测。
可选地，所述混合物、引物、含有待提取样品DNA的上清液的体积比为10～25:0.5～5:5～15。
可选地，将所述反应溶液置于Real time PCR仪上进行检测，相对荧光强度增强，表明水产品中含有副溶血弧菌；相对荧光强度不变，表明水产品中不含有副溶血弧菌。
本申请能产生的有益效果包括：
(1)本申请制备得到的磁性纳米复合材料呈球形且分布均匀，无团聚现象，该材料可用于DNA的高效提取；
(2)本申请提取的DNA可成功用于qPCR检测出副溶血性弧菌，检测速率快；
(3)本申请可以为磁性材料以及磁性复合材料提供一种操作简单，绿色环保的制备方法。
附图说明
图1为磁性纳米复合材料的表征图：(a)Fe3O4和磁性纳米复合材料的傅里叶红外光谱图；(b)Fe3O4和磁性纳米复合材料的粒径图；(c)磁性纳米复合材料的X射线衍射图谱；(d)磁性纳米复合材料的透射电镜图；
图2为PH＝5时不同正硅酸乙酯(TEOS)含量的磁性纳米复合材料提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图(e是0ml,a-d分别为0.5,1,1.5,2mlTEOS)；
图3为PH＝8时不同TEOS含量的磁性纳米复合材料提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图(e是0ml,a-d分别为0.5,1,1.5,2mlTEOS)；
图4PH＝11时不同TEOS含量的磁性纳米复合材料提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图(e是0ml,a-d分别为0.5,1,1.5,2mlTEOS)；
图5PH＝5和PH＝8时不同TEOS含量的磁性纳米复合材料对DNA提取效率的比较；
图6磁性纳米复合材料与商品化试剂盒对DNA吸附效率的比较；
图7实时PCR检测对虾中的副溶血性弧菌：a,b,c,d是不同对虾的样品。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
三氯化铁六水合物(分析纯)，氯化亚铁(Ⅱ)四水合物(分析纯)，正硅酸乙酯(分析纯)，氯化钠(分析纯)国药上海沪试；氨水(分析纯)，柠檬酸钠二水合物(分析纯)，无水乙醇(药用级99.5％)上海麦克林公司；盐酸(分析纯)北京化工厂；
本申请的实施例中使用的仪器及型号如下：
傅里叶变换红外分光光度计日本Shimadzu公司；
HT7700透射电子显微镜日本Hitachi公司；
SU8220扫描电子显微镜日本Hitachi公司；
MS-200多管漩涡混匀仪杭州瑞诚仪器有限公司；
PL2002分析天平、S220 pH计上海梅特勒-托利多仪器有限公司；
4-20R台式高速冷冻离心机湖南恒诺仪器设备有限公司；
N-EVAP 112水浴氮吹仪美国OA公司；
SB-5200DTN超声机宁波新芝生物科技公司；
Milli-Q超纯水机美国Millipore公司；
Qubit4 Fluorometer荧光分析仪新加坡赛默飞有限公司；
044BR7592-电泳仪美国BIO-RAD公司；
化学发光凝胶成像系统0I-600MF Touch广州光仪生物科技有限公司；
THZ-82N台式恒温振荡器上海跃进医疗器械有限公司。
本申请实施例中的参考文献【1】、【2】、【3】、【4】如下：
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实施例1磁性纳米复合材料的制备
首先，在离心管45ml处(50ml，Corning)开孔，氮吹针孔向下插入孔隙。称取FeCl3·6H2O 0.448g和FeCl2·4H2O 0.163g，溶于10mL去离子水和10mL乙醇(1比1)的溶液，完全溶解后转移至离心管中。将氮吹管插入液面以下，保持充氮20分钟，清除系统中的氧气。除氧结束后，立即向体系中加入1毫升氨水碱性环境，拔掉氮吹管并拧紧瓶盖，将离心管放入多管涡旋振荡器中10min。此时，氮吹针持续通氮，保持体系中的氮气含量。反应结束后，将产物转移至完整的离心管中，以10000r/min的速度离心5min，将产物均匀分散于1％柠檬酸钠溶液中，再用去离子水洗涤3-5次，除去不完全反应物，最后将产物分散于去离子水中。随后在110mg MNPS中加入550mg聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)，PVP的加入可以增强材料的粘结性，同时可以改善材料的分散性。将MNPS与PVP在室温摇床中进行反应，MNPS和PVP的质量比为1：5，反应时间为15h。反应结束后以去离子水洗涤材料，溶于去离子水，最终原料分散液中MNPs的浓度为10mg/ml。
在50ml离心管中加入32ml乙醇，8ml去离子水，5ml(10mg/ml)磁性四氧化三铁，随后加入1ml氨水。将体系混匀，放入超声机超声震荡，此时缓慢加入1ml正硅酸乙酯。超声机中加入冰袋，保持反应在室温中进行，并且每20min更换一次冰袋，反应时间为3个小时。反应结束后使用10％的稀盐酸调节PH至8终止反应，并观察到有沉淀产生，此时将体系以10000r/min的速度离心5min，去掉上清液，用去离子水和乙醇进行洗涤3-5次，并分散于去离子水、乙醇、甲醇中，即可得到磁性纳米复合材料A。
实施例2磁性纳米复合材料B
本实施例中添加正硅酸乙酯的含量为0.5mL，其他反应步骤和条件同实施例1。
实施例3磁性纳米复合材料C
本实施例中添加正硅酸乙酯的含量为1.5mL，其他反应步骤和条件同实施例1。
实施例4磁性纳米复合材料D
本实施例中添加正硅酸乙酯的含量为2mL，其他反应步骤和条件同实施例1。
实施例5磁性纳米复合材料的表征
对实施例1至实施例4中制备得到的磁性纳米复合材料使用Ht7700透射电子显微镜进行了透射电子显微镜成像，并使用X射线衍射仪D/max-2400、马尔文zeta电位仪和红外光谱仪对磁性纳米颗粒进行了分析。以实施例1为典型代表，结果如图1所示。
磁性纳米复合材料的透射电镜图像结果显示，SiO2成功包覆在了Fe3O4表面，磁性纳米复合材料粒径分布在80-120nm，材料呈球形且分布均匀。
磁性纳米复合材料红外测试结果如图(1a)，Fe3O4的峰值出现较强的振动峰在572.83cm-1此处对应的是Fe3O4四面体的Fe-O键的吸收峰；在1100cm-1处对应的是Si-OH的特征峰；PVP在1660cm-1处的强吸收峰为吡咯烷酮环中C＝O的伸缩振动吸收；1400cm-1左右的峰是亚甲基的弯曲振动；说明二氧化硅和PVP已经成功的包覆到了磁性纳米四氧化三铁上。
磁性纳米复合材料粒径测试结果如图(1b)，裸四氧化三铁的粒径集中在60-120nm之间，在80nm处的峰值最高且峰形尖锐，说明Fe3O4在80nm时含量最高，且均一性好。磁性纳米复合材料的粒径集中在80-150nm之间，在130nm处的峰形尖锐，说明磁性纳米复合材料在130nm时含量最高，且均一性好。在粒径结果上可以明显看到Fe3O4和磁性纳米复合材料的峰之间发生了50nm的偏移，同时说明了在Fe3O4表面生长了二氧化硅层。
磁性纳米复合材料的XRD谱图如图(1c)所示，在2θ为30.4°、35.5°、43.3°、57.4°和62.8°处分别有5个特征衍射峰，分别为Fe3O4尖晶石结构的晶面的衍射峰，2θ为23.6°处的宽峰是二氧化硅的特征峰[25]，说明磁性颗粒样品的表面成功包覆了SiO2。通过电子透射显微镜进一步观察磁性纳米复合材料的形貌和结构信息。如图(1d)可见，磁性纳米粒子为球形。我们可以看到二氧化硅层明显的生长现象，四氧化三铁外包覆了二氧化硅层，中间实心结构为四氧化三铁，铁核外为二氧化硅层。磁性纳米复合材料颗粒分散性良好，粒径分布在80-120nm之间，磁珠分布均匀，无团聚现象。
实施例6
DNA的提取与洗脱
将研磨好的待提取样品粉末(虾样品100mg)转移到预先装有400ul的裂解液和RNA酶的离心管中，迅速混匀并将离心管70℃水浴加热10min。加热结束后，进行离心，并转移300μl上清液到新的离心管中。向离心管中加入混合溶液(包括300ul结合液，300μl异丙醇和30μl磁性纳米复合材料(以下称为磁珠))，振荡混匀，将离心管放置于磁力架中静置，并吸出液体。随后使用500μl去蛋白液和600μl漂洗液，先后洗涤磁珠两次。洗涤结束后向体系中加入100μl洗脱液震荡混匀，置于65℃孵育3min。将离心管放置于磁力架中，磁珠完全吸附后，上清液即DNA溶液；
其中混合溶液的pH为5，使用的磁珠为实施例1中的磁性纳米材料。
实施例7
本实施例中使用的磁珠为实施例2中的磁性纳米材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例8
本实施例中使用的磁珠为实施例3中的磁性纳米材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例9
本实施例中使用的磁珠为实施例4中的磁性纳米材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例10
本实施例中混合溶液的pH为8，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例11
本实施例中混合溶液的pH为8，使用的磁珠为实施例2中的磁性纳米复合材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例12
本实施例中混合溶液的pH为8，使用的磁珠为实施例3中的磁性纳米复合材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例13
本实施例中混合溶液的pH为8，使用的磁珠为实施例4中的磁性纳米复合材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例14
本实施例中混合溶液的pH为11，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例15
本实施例中混合溶液的pH为11，使用的磁珠为实施例2中的磁性纳米复合材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例16
本实施例中混合溶液的pH为11，使用的磁珠为实施例3中的磁性纳米复合材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例17
本实施例中混合溶液的pH为11，使用的磁珠为实施例4中的磁性纳米复合材料，其他提取步骤和条件同实施例6。
实施例18
电泳验证实验
接下来使用电泳仪(BIO-RAD)和照胶仪(0I-600MF Touch)对提取的DNA进行电泳验证实验。电泳实验中使用的染料为蓝色loading buffer 6×，染料与DNA的比例为1：5，Maker长度为15kbp，我们通过条带亮度和位置来判断DNA提取效果。
DNA提取率的计算
在优化磁珠制备条件时，我们使用不同磁珠，同时提取相同的目标DNA，其他实验条件均相同。
提取率＝[(A1-A2)/A1]×100
式中：A1为待提取的DNA浓度；A2提取后所得DNA浓度。
其中DNA浓度的测定方法如下：
本申请中使用赛默飞Qubit4荧光分析仪来测定DNA浓度。首先配制浓度测试体系，Qubit buffer与染料的比例为200:1配制Mix溶液。然后将待测DNA加入浓度测试体系中，Mix溶液与DNA的比例为199:1，将浓度测试体系放入Qubit分析仪中读出DNA浓度。
实施例19
图2-4是不同TEOS添加量的纳米磁珠和体系不同PH下提取DNA的凝胶电泳图，loading buffer 6×染料与DNA的上样量分别的1微升和5微升。
如图4所示，PH＝11时，条带都比较暗淡，所有磁珠对DNA的提取率都很差。这一结果也证明了磁珠提取DNA是通过静电吸引的原理实现的。PH＝11时磁珠和DNA均带负电，磁珠几乎不能吸附DNA，PH＝5和PH＝8时，磁珠展示了对DNA比较好的提取能力。PH＝5和PH＝8时，除裸Fe3O4，其他磁珠的条带亮度和位置都很清晰。由于肉眼无法比较结果，所以我们使用Qubit4荧光分析仪对DNA的提取率进一步做定量研究。如图5所示，在两种PH下随着TEOS的量增加，DNA的提取率先升高再下降，在TEOS为1ml时提取率达到峰值。PH＝5时，DNA的提取率在80％左右，高于PH＝8时磁珠对DNA的提取率量。综上各个条件的对比，体系最佳的条件为PH＝5，TEOS含量为1ml。
实施例20
接下来将本申请中实施例3使用磁性纳米复合材料对DNA的提取效率与其他研究组DNA的提取方法进行对比，结果如表1所示，
Figure BDA0002615602960000141
表1总结了本研究与其他研究组DNA提取的方法及提取率的对比，我们SiO2和化合物A改性的磁性纳米四氧化三铁展现了良好的提取效果。Hb-Fe3O4-NH2材料的制备过程较繁琐，反应总时长达26小时并且需要40℃、50℃、80℃三次加热，DNA吸附过程需要15分钟，时间较长；IL-Fe3O4的制备过程同样复杂，反应过程需要加热，吸附时间长达30分钟；碳管材料虽然制备过程简单，但吸附时间长达1小时且不易洗脱；本申请中材料制备的反应时间仅为3小时10分钟且所有均可在室温进行，30秒即可完成吸附，5秒即可完成固液分离；Tang等人研制的纸基传感器，可以实现DNA的快速提取，但提过程中易对DNA造成污染，另外此技术较难推广且无法完成大批量的检测工作。本研究克服了上述困难，研制了一种Fe3O4@SiO2的快速制备方案，材料制备过程简单、DNA提取过程快且提取效率高。
实施例21
通过琼脂糖凝胶电泳法将本研究中磁珠提取DNA的能力与三种商品化试剂盒提取DNA的能力对比。本研究中的磁珠与商品化的试剂盒提取相同的DNA，将提取的DNA进行电泳实验，每种提取方式进行两次实验，实验结果如图6。图中1号为本研究中Fe3O4@SiO2提取的DNA，2号和3号是商品化磁珠提取的DNA，4号是传统的色谱柱提取法提取的DNA。实验结果表明，几种不同提取方式提取的DNA条带位置准确，没有拖带。1号磁珠提取DNA条带和其他相比，条带最明亮，说明本研究中的磁珠和商品化试剂盒相比，具有更好的DNA提取效果，是优良的DNA提取率材料。
实施例22
为了更好的验证本申请中磁珠提取DNA的能力，我们做了实际样品的测定，提取虾的DNA并使用荧光PCR仪检测虾样品中的副溶血性弧菌。
通过Chung[24]等人的研究，确定副溶血性弧菌的致病基因包括tdh,trh,gyrase,O3MM1,oxR。针对这些致病基因利用primer5.0进行引物设计，并对引物进行筛选，Tm值以及GC含量需要符合标准，Tm保持在56-63℃，GC含量保持在40-60％。为了确保引物的特异性，在Blasts中进行了核实，筛选出竞争状态好的引物。针对致病基因最终筛选出来的引物如表2所示：
表2
Figure BDA0002615602960000151
首先使用本研究中的磁珠提取对虾样品DNA，将提取的基因应用于荧光PCR检测。PCR最终程序设定为95℃30s；95℃15s，58℃20s，72℃30s，循环40次。反应体系(20μL)：10μLTakara SYBR master mix，上下游引物各0.5μL，模板5μL(0.1ng/μL)，去离子水5μL。我们同时检测了tdh,trh,gyrase,O3MM1,oxR，实验结果如图7所示，三个样品(a，c，d)检出了副溶血性弧菌，(b)没有检测到副溶血性弧菌，与实际结果保持了一致。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种磁性纳米复合材料，其特征在于，所述磁性纳米复合材料具有核壳结构，内核为Fe3O4，壳层为SiO2，在所述内核与壳层之间还有中间层；
所述中间层来自聚合物；
所述聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、聚多巴胺中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料，其特征在于，所述磁性纳米复合材料的粒径为50～200nm。
3.根据权利要求1所述的磁性纳米复合材料，其特征在于，粒径分布在80～150nm范围内的所述磁性纳米复合材料的体积含量为70～85％。
4.权利要求1至3任一项所述的磁性纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述方法至少包括：
(1)获得含有Fe3O4的分散液；
(2)将含有所述分散液和聚合物的原料，反应I，得到中间产物；
(3)将含有中间产物、碱源I、硅源的原料，反应II，即可得到所述磁性纳米复合材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，Fe3O4、聚合物和硅源的质量比为1:4～8：10～40。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述含有Fe3O4的分散液的获得至少包括以下步骤：
将含有Fe2+源、Fe3+源、碱源II、水和醇类化合物的物料，反应III，再加入柠檬酸钠，即可得到所述含有Fe3O4的分散液；
优选地，所述反应III的条件为：反应温度为20～30℃；反应时间为5～30min；
优选地，所述Fe2+源、Fe3+源、水和醇类化合物的比例为0.5～1.5mmol：1.5～3.5mmol：5～15mL：5～15mL；
优选地，所述碱源II和Fe2+源的体积摩尔比为1～2L/mol；
优选地，所述碱源II选自氨水、氢氧化钠中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述反应I的条件为：反应温度为20～30℃；反应时间为12～20h；
优选地，在所述步骤(3)中，所述碱源I选自氨水、氢氧化钠中的至少一种；
所述硅源选自正硅酸乙酯；
优选地，在所述步骤(3)中，所述反应II的条件为：反应温度为20～30℃；反应时间为1.5～6.5h；
优选地，所述反应II在超声波设备中进行；
优选地，所述步骤(3)至少包括以下步骤：
将含有中间产物、碱源I、硅源、水和醇类化合物的原料，反应II，得到溶液A，调节所述溶液A的pH至7.5～8.5，离心，得到的沉淀即为所述磁性纳米复合材料。
8.一种DNA的提取方法，其特征在于，使用磁性纳米复合材料提取样品中的DNA，得到含有所述DNA的溶液；
所述磁性纳米复合材料选自权利要求1至3任一项所述的磁性纳米复合材料、根据权利要求4至7任一项所述方法制备得到的磁性纳米复合材料中的任一种。
9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述样品选自水产品。
10.权利要求8或9所述的提取方法在检测副溶血弧菌中的应用。
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