CN115532221A - 一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠 - Google Patents

一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠 Download PDF

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Abstract

本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4‑SiO2磁珠。本发明以磁性Fe3O4纳米颗粒为内核，在其表面进行亲水性高分子修饰，并然后包裹一层氧化硅形成Fe3O4‑SiO2磁珠，关键的，所述高分子修饰是由PVP和PAA两种分子进行亲水性修饰，在PVP和PAA高分子修饰后，具有良好的单分散性和亲水性，能够使SiO2均匀的合成在Fe3O4核表面，形成核壳结构的纳米磁珠，相较于单独高分子修饰方法合成的磁珠，双高分子修饰合成的磁珠具有更好的均匀性和单分散性，合成的磁珠可以实现对新冠病毒核酸的高效提取。

Description

一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠。
背景技术
新冠病毒的检测方式主要有新冠病毒抗原检测、新冠病毒抗体检测、新冠病毒核酸检测等方式。其中，检测新冠病毒的特征核酸片段是诊断新冠是否阳性的重要依据，相较于其他诊断方式，具有更高的准确性、更高的特异性和更低的假阳性，因此采用核酸检测来诊断新冠病毒是筛查疫情的主要方式。核酸检测的方式，目前主流方法有酚氯仿抽提法、浓盐法、CTAB法、Trizol法、硅胶柱法、磁珠法等。在众多核酸提取检测方法中，磁珠法具有操作简单、无毒无害、提取时间短、可机械化操作等优点。针对新冠病毒的大批量检测需求，磁珠法能够实现高度机械化操作、可宏量测试，切合病毒检测的需求，因此磁珠法检测新冠病毒可进行广泛推广和应用。磁珠法核酸检测试剂盒中，磁珠的性质对新冠病毒的核酸提取起着关键性作用。
在各类磁珠中，二氧化硅磁珠由于其表面具有羟基而便于进行多样性修饰，已经成为了DNA提取领域最常用的磁珠形式。目前，常见的硅羟基磁珠制备方法为Stober法，具体是在Fe3O4纳米颗粒表面修饰一层纳米SiO2，但是该方法存在Fe3O4纳米颗粒包覆的SiO2层粒径不均一或包覆不均匀，且有容易团聚的缺陷。
然而现有的Fe3O4纳米颗粒表面包覆SiO2的方法也存在一些问题，如下：
1.常见的沉积法包覆的SiO2层的厚度不一，造成了磁珠的粒径差异大，导致后续在提取核酸时的提取效率受到了较大的影响；
2.碱性条件下非常不稳定；
3.硅胶自身结构空隙较多，容易造成表面大量的水存积，增加了化学反应的复杂性；
4. 存在较大的非特异性吸附性。
因此，寻找一种新冠病毒核酸提取效率高，粒径均匀，Fe3O4纳米颗粒表面包覆率高的硅羟基磁珠是当前领域亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于高效提取新型冠状病毒核酸纳米磁珠，纳米磁珠由于磁珠表面的官能团，能够特异性吸附新冠病毒核酸，形成磁珠-核酸复合物，并在外界磁场的作用下富集核酸，然后在洗脱液的作用下收集核酸。合成的磁珠以磁性Fe3O4纳米颗粒为内核，在其表面进行亲水性高分子修饰，并然后包裹一层氧化硅形成。合成的磁珠可以实现对新冠病毒的高效提取，并且可以实现大批量提取需求。经检索发现，这种创新结构的磁珠用于新冠病毒的提取检测的方法和应用的专利未见报道。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种高效提取新型冠状病毒核酸的纳米磁珠，所述纳米磁珠包括磁性内核、亲水修饰层、吸附层；
所述磁性内核为Fe3O4纳米颗粒，所述亲水修饰层为聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酸，所述吸附层为硅酸四乙酯。
本发明还提供一种高效提取新型冠状病毒核酸的纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：
（1）通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为5~500nm的Fe3O4纳米颗粒；
（2）取Fe3O4纳米颗粒分散于水中，加入聚乙烯吡咯烷酮粉末、聚丙烯酸粉末搅拌超声分散均匀，得到Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液；
（3）通过碱性水解法，向Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入SiO2前驱体溶液和氨水，在30~100℃下保持10~180min，离心，得到Fe3O4-SiO2磁珠。
进一步的，（1）中，通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为10~200 nm的Fe3O4纳米颗粒。
进一步的，（2）中，按质量比，Fe3O4纳米颗粒：聚乙烯吡咯烷酮粉末：聚丙烯酸粉末=1 ：2.5~500 ：2.5~500。
（3）中，所述SiO2前驱体溶液包括但不限于硅酸四乙酯醇水溶液、正硅酸甲酯的醇水溶液和硅酸钠水溶液中的至少一种。
进一步的，（3）中，加入硅酸四乙酯的浓度为0.2~10%（体积）。
进一步的，（3）中，所述氨水的浓度为0.2~10%（体积）。
进一步的，（3）中，加入硅酸四乙酯的浓度为0.2~5%（体积）。
进一步的，（3）中，通过碱性水解法，向Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入硅酸四乙酯和氨水，50~80℃下保持60~180min。
进一步的，（3）中，所述Fe3O4-SiO2磁珠的形貌结构为核壳结构、异质结构、花瓣状结构、三明治结构中的至少一种。
本发明还提供上述的高效提取新型冠状病毒核酸的纳米磁珠在提取新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.本发明公开了一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠，其粒径具有良好的均匀性，并且其超顺磁性Fe3O4纳米颗粒核具有良好的磁性，外层的SiO2可以均匀吸附和解吸附核酸分子，实现快速的磁响应，因此合成的磁珠可以实现磁场操控的核酸分子提取和富集。本发明提出的基于Fe3O4-SiO2磁珠具有良好的磁性和核酸亲和性，能够实现新冠病毒核酸分子的快速提取和检测。
2.本发明公开了高效提取新型冠状病毒核酸的纳米磁珠的制备方法，磁珠内核材料由超顺磁性Fe3O4纳米材料构成，并由PVP和PAA两种分子进行亲水性修饰，在PVP和PAA高分子修饰后，具有良好的单分散性和亲水性，能够使SiO2均匀的合成在Fe3O4核表面，形成核壳结构的纳米磁珠，相较于单独高分子修饰方法合成的磁珠，双高分子修饰合成的磁珠具有更好的均匀性和单分散性。
3.本发明所采用的Fe3O4-SiO2磁珠纳米材料成分和结构具有良好的创新性，磁性Fe3O4纳米颗粒用PVP和PAA进行亲水性修饰，良好的亲水性促进了合成磁珠的单分散性。并且磁珠合成原材料都是具有良好生物相容性的生物医用材料，不包含其他不可降解成分如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯等，具有良好的生物相容性和生物降解性。同时，本发明中的磁珠材料能够具有大批量生产的潜力，且价格低廉，因此容易被广泛应用于新冠病毒的核酸检测。
总之，本发明公开的新型磁珠材料，由于Fe3O4-SiO2磁珠的原料价格优惠，生物相容性良好，磁响应效果快，能够特异性吸附核酸分子，容易实现批量化生产，且无需昂贵的仪器设备，能够快速的实现新冠核酸的提取和检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：图a为合成的Fe3O4纳米颗粒TEM（透射电子显微镜）图；图b为PAA和PVP高分子双修饰合成的Fe3O4-SiO2磁珠的TEM图；
图2：图a为PAA高分子修饰合成的Fe3O4-SiO2磁珠的TEM图；图b为PVP高分子修饰合成的Fe3O4-SiO2磁珠的TEM图；
图3：合成的Fe3O4-SiO2磁珠磁珠（PAA和PVP双修饰）的磁强度图；
图4：合成的Fe3O4-SiO2磁珠磁珠（PAA和PVP双修饰）在磁场条件下快速响应并被富集；
图5：合成的Fe3O4-SiO2磁珠磁珠（PAA和PVP双修饰）提取新冠病毒样本和阴性样本的核酸PCR图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
在本发明的一些实施例中，一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，具体步骤如下：
（1）首先通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到5-500 nm的Fe3O4纳米颗粒。然后取1-200 mg的Fe3O4纳米颗粒，加入0.5-5 g PVP和0.5-5 g PAA粉末搅拌超声分散均匀，形成Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液，然后通过碱性水解法，向Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入0.1-5 mL的硅酸四乙酯（TEOS）和0.1-5 mL的氨水，在30-100℃的条件下保持10-180分钟，在碱（氨水）催化条件下，硅酸四乙酯（TEOS）的水解反应属于亲核取代反应（SN1）机理，半径较小的OH官能团直接进攻TEOS中心的硅原子而完成水解反应；随着乙氧基的除去，硅原子上的正电性增加，并且空间效应更为有利，从而TEOS的水解单体中含有更多的Si-OH基团，形成较多的Si(OH)4。由于Si(OH)4具有很强的反应活性，迅速吸附到溶液中悬浮的Fe3O4纳米颗粒的表面。在包覆的过程中，初始形成少量的活性Si(OH)4，与Fe3O4纳米颗粒表面的部分活性点发生化学反应，作为表面膜的结合点，接着继续生成的Si(OH)4与Fe3O4纳米颗粒表面已包覆的Si(OH)4反应，从而形成表面厚度逐渐增大的复合粒子，即Fe3O4-SiO2磁珠，离心收集产物Fe3O4-SiO2磁珠，其尺寸约为5-1000 nm。
（2）将不同条件下合成的Fe3O4-SiO2磁珠进行化学和材料表征。合成的磁珠的磁性强度通过共振样品磁强计进行检测。合成的磁珠形貌、尺寸大小通过透射电子显微镜进行表征。磁珠在缓冲液中的快速磁吸引实验通过在永磁铁吸引条件下富集进行记录。
（3）将合成的新型磁珠用于新冠病毒的核酸提取和检测。将采集样本和模拟测试假病毒标准样本加入组织裂解液，然后加入10-500 μL合成的0-1 g/mL的Fe3O4-SiO2磁珠，对核酸进行特异性吸附，通过强磁铁的作用，吸附分离Fe3O4-SiO2磁珠。Fe3O4-SiO2磁珠上吸附的核酸通过洗脱液进行收集，并在实时定量PCR仪中检测新冠病毒的ORF1ab和N gene两种特异性基因，实现对样本的新冠病毒核酸的快速分离和检测。
优选的，所述采集的样本包括但不限于咽拭子、鼻拭子、粪便上清液、肺部灌洗液、冷链样品等需检测样品。
优选的，所述Fe3O4-SiO2的修饰方式，包括但不限于PVP/PAA表面接枝、PVP/PAA表面包覆、形成油酸-PVP/PAA络合物、PVP/PAA双层结构等修饰方式。
优选的，所述Fe3O4-SiO2磁珠结构，包括但不限于核壳结构磁珠、异质结结构磁珠、花瓣状结构磁珠、三明治（Fe3O4-PVP/PAA-SiO2）结构磁珠等。
优选的，所述Fe3O4纳米颗粒尺寸为5-500 nm，合成的Fe3O4-SiO2磁珠的尺寸为5-1000 nm。
优选的，所述Fe3O4纳米颗粒尺寸为10-200 nm，合成的Fe3O4-SiO2的磁珠尺寸为10-500 nm。
优选的，所述Fe3O4纳米颗粒尺寸为20-100 nm，Fe3O4-SiO2磁珠的尺寸为20-100nm。
优选的，向所述Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入TEOS和氨水分别为0.1-5 mL和0.1-5 mL，在30-100℃的条件下保持10-180分钟。
优选的，向所述Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入TEOS和氨水分别为0.1-2.5 mL和0.1-2.5 mL，在30-80℃的条件下保持30-180分钟。
优选的，所述的向Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入TEOS和氨水分别为0.5-2 mL和1-2.5 mL，在50-80℃的条件下保持60-180分钟。
根据本发明所优选的，所述的核酸磁富集是向组织裂解液加入10-500 μL合成的0-1 g/mL的Fe3O4-SiO2磁珠。
优选的，所述的核酸磁富集是向组织裂解液加入10-250 μL合成的0-500 mg/mL的Fe3O4-SiO2磁珠。
优选的，所述的核酸磁富集是向组织裂解液加入50-150 μL合成的10-250 mg/mL的Fe3O4-SiO2磁珠。
本发明利用油热法合成的磁性Fe3O4纳米材料，通过高分子PVP和PAA亲水性高分子双修饰提高水分散性和单分散性，并在其表面修饰一层SiO2，形成Fe3O4-SiO2磁珠，双分子修饰相较于单分子修饰具有更好的亲水性和单分散性。磁性Fe3O4纳米颗粒能够在强磁场作用下快速富集，表面SiO2层对核酸分子具有良好的亲和性，可以特异性吸附核酸而不吸附其他蛋白质、糖类等分子，因此可以用于核酸分子的分离和检测。实验证明，合成的磁珠具有较大的磁性，可以实现快速磁响应，并且双分子修饰的磁珠具有良好的单分散性，可以提高核酸提取的均匀性，可以用于新冠病毒核酸的提取和检测。本发明所述的磁珠能够实现新冠病毒的核酸高效提取和检测，并确定了最佳的磁珠合成和核酸检测的实验条件。
实施例1
一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，步骤如下：
（1）通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为20±5nm的Fe3O4纳米颗粒；
（2）取10mgFe3O4纳米颗粒分散于水中，加入1gPVP粉末、1g PAA粉末搅拌超声分散均匀，得到亲水的Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液；
（3）通过碱性水解法，向50 mL Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入1mL TEOS醇水溶液和0.5 mL氨水，在80℃下保持2h，离心，得到Fe3O4-SiO2磁珠。
将合成的磁珠进行表征和检测，利用TEM检测其尺寸分布、形貌和均匀度，并利用共振样品磁强计测试其磁性强度。并在强磁铁的作用下，验证其快速磁分离效果。
将合成的磁珠用于新冠病毒核酸检测实验，将待检测阴性样本和新冠病毒模拟假病毒样本加入到裂解液中，加入100 μL的100 mg/mL磁珠溶液，对裂解的核酸进行特异性吸附。在磁场作用下进行磁分离进行富集核酸。吸附的核酸进行洗涤和洗脱。收集的核酸在PCR仪上进行核酸检测，以ORF1ab和N gene基因片段进行筛选，检测样本的新冠病毒核酸携带情况。
实施例2
一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，步骤如下：
（1）通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为50±5nm的Fe3O4纳米颗粒；
（2）取10mgFe3O4纳米颗粒分散于水中，加入1gPVP粉末、1g PAA粉末搅拌超声分散均匀，得到亲水的Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液；
（3）通过碱性水解法，向100 mL Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入2mL TEOS醇水溶液和2 mL氨水，在60℃下保持4h，离心，得到Fe3O4-SiO2磁珠。
检测表征方法同实施例1。
对比例1
一种提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，步骤如下：
（1）通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为20±5nm的Fe3O4纳米颗粒；
（2）取10mg Fe3O4纳米颗粒分散于水中，加入1gPVP粉末搅拌超声分散均匀，得到亲水的Fe3O4-PVP水分散溶液；
（3）通过碱性水解法，向50 mL Fe3O4-PVP水分散溶液中加入1mL TEOS醇水溶液和0.5 mL氨水，在80℃下保持2h，离心，得到PVP高分子修饰合成的Fe3O4-SiO2磁珠。
将合成的磁珠进行表征和检测，利用TEM检测其尺寸分布、形貌和均匀度，结果如图2b所示。
对比例2
一种提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，步骤如下：
（1）通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为20±5nm的Fe3O4纳米颗粒；
（2）取10mgFe3O4纳米颗粒分散于水中，加入1gPAA粉末搅拌超声分散均匀，得到亲水的Fe3O4-PAA水分散溶液；
（3）通过碱性水解法，向50 mL Fe3O4-PAA水分散溶液中加入1mL TEOS醇水溶液和0.5 mL氨水，在80℃下保持2h，离心，得到PAA高分子修饰合成的Fe3O4-SiO2磁珠。
将合成的磁珠进行表征和检测，利用TEM检测其尺寸分布、形貌和均匀度，结果如图2a所示。
性能表征
TEM形貌：
将实施例1和对比例1、对比例2合成的Fe3O4-SiO2磁珠材料通过TEM分析纳米颗粒的形貌和尺寸分布，其结果如图1和图2所示，双分子修饰合成的磁珠形貌均一，尺寸分布均匀，而对比例1、对比例2单分子修饰合成的磁珠单分散性差，且形貌不均匀，因此对比例1、对比例2合成的磁珠无法用于核酸提取。
磁强度表征：
对实施例1得到的Fe3O4-SiO2磁珠通过共振样品磁强计测试合成的磁珠磁强度，其结果如图3所示，合成的磁珠具有良好的磁性，可以在磁场条件下快速磁吸附。进一步的，将一定浓度的磁珠分散到水溶液中，在强磁铁的作用下被快速吸引富集，其结果如4图所示，结果显示磁珠良好的超顺磁性，可以广泛用于新冠病毒的大规模检测。
核酸提取效果：
将实施例1合成的Fe3O4-SiO2磁珠分散到缓冲液中，在裂解液对待检测样品作用下，分离蛋白质和核酸分子，将合成的磁珠将入到裂解液中对核酸分子进行吸附并磁分离。提取的核酸进行洗涤和洗脱，然后在PCR仪器上进行检测，其结果如图5所示，结果表明本发明合成的磁珠对核酸的提取效果优异。

Claims (10)

1.一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠，其特征在于，所述纳米磁珠包括磁性内核、亲水修饰层、吸附层；
所述磁性内核为Fe3O4纳米颗粒，所述亲水修饰层为聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酸，所述吸附层为SiO2或其衍生物。
2.一种权利要求1所述的高效提取新型冠状病毒核酸的纳米磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为5~500nm的Fe3O4纳米颗粒；
（2）取Fe3O4纳米颗粒分散于水中，加入聚乙烯吡咯烷酮粉末、聚丙烯酸粉末搅拌超声分散均匀，得到Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液；
（3）通过碱性水解法，向Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入SiO2前驱体溶液和氨水，在30~100℃下保持10~180min，离心，得到Fe3O4-SiO2磁珠。
3.如权利要求2所述的高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，其特征在于，（1）中，通过高温油热法分解油酸铁化合物，得到粒径为10~200 nm的Fe3O4纳米颗粒。
4.如权利要求2所述的高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，其特征在于，（2）中，按质量比，Fe3O4纳米颗粒：聚乙烯吡咯烷酮粉末：聚丙烯酸粉末=1 ：100 ：100。
5.如权利要求2所述的高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，其特征在于，（3）中，所述SiO2前驱体溶液为硅酸四乙酯醇水溶液、正硅酸甲酯的醇水溶液和硅酸钠水溶液中的至少一种。
6.如权利要求2所述的高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，其特征在于，（3）中，所述SiO2前驱体溶液的浓度为0.2~10%（体积），所述氨水的浓度为0.2~10%（体积）。
7.如权利要求5所述的高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，其特征在于，（3）中，加入硅酸四乙酯的浓度为0.2~5%（体积）。
8.如权利要求2所述的高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，其特征在于，（3）中，通过碱性水解法，向Fe3O4-PVP/PAA水分散溶液中加入硅酸四乙酯和氨水，50~80℃下保持60~180min。
9.如权利要求2所述的高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠的制备方法，其特征在于，（3）中，所述Fe3O4-SiO2磁珠的形貌结构为核壳结构、异质结构、花瓣状结构、三明治结构中的至少一种。
10.权利要求1所述的一种高效提取新型冠状病毒核酸的Fe3O4-SiO2磁珠在提取新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸中的应用。
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