KR102047362B1 - 아민-코팅 자성 나노입자를 이용한 플라스미드 dna 정제 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 내 플라스미드 DNA 분리를 위한 비용해성 응집체 제거용 아민-코팅 자성 나노입자 및 이를 이용한 플라스미드 DNA 분리 방법을 제공한다. 본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자는 종래의 플라스미드 DNA 분리 과정에 이용되는 완충액과 호환 가능한 이점을 갖으며, 플라스미드 DNA 분리 과정의 완충액 내 첨가되어 원심분리 또는 여과 과정이 아닌 자기장을 이용하여 비용해성 응집체를 제거함으로써 플라스미드 DNA 분리 과정을 보다 단순화하여 효율성을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 플라스미드 DNA 분리용 아민-코팅 자성 나노입자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 핵산 정제과정에서 생성되는 단백질 변성 응집물, 박테리아 지노믹 DNA 및 세포 잔해와 같은 비용해성 응집체를 기존 원심분리기나 필터를 이용한 제거가 아닌, 수용성 아민-코팅 자성 나노입자(hydrophilic amine-coated magnetic nanoparticle)를 이용하여 비용해성 응집체를 자기장에 의해 제거한 후 핵산 결합용 자성입자로 플라스미드 DNA를 자성입자 분리장치를 이용하여 핵산정제에 관한 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.
플라스미드 DNA는 세포내에서 독립적으로 복제과정을 거치며 특정 항생제 내성유전자를 보유하여 숙주에 도입 후 선별이 가능한 특성을 가지고 있어 클로닝, 라이브러리 제작 및 스크리닝, 단백질 발현, 유전자 변형 및 조작, 특정 유전자 발현을 유도하는 형질전환 유기체(GMO, genetically modified organism) 제작 등과 같이 다양한 분야에서 광범위하게 이용되고 있다.
이와 같은 이유로 고순도 고수율의 플라스미드 DNA 분리정제 방법이 많이 개발되었으며, 대용량 처리용 자동화기기(HTS, high throughput automation system)를 이용한 핵산 정제장비도 개발되었다.
최근 자성 입자를 이용하여 생물학적 시료로부터 핵산이나 단백질의 분리 정제 뿐만 아니라, 특이적인 항체와 결합된 자성입자를 이용하여 바이러스 시료의 농축 및 검출에 효율적으로 수행하기 위한 기술이 개발됨에 따라 로슈(Roche), 퀴아젠(Qiagen), 써모사이언티픽(Thermoscientific) 등과 같은 글로벌 바이오기업들에서 자성입자를 이용한 HTS 핵산정제 장치도 많이 개발되었다.
박테리아 세포 배양 및 세포 수집 후 플라스미드 DNA 정제과정은 일반적으로 다음과 같은 네가지 단계를 포함한다: (a) 세포 현탁(suspension); (b) 세포 용해(lysis); (c) 중화 및 결합(neutralization and binding); 및 (d) 세척 및 용출 (washing and elution).
상기 과정 중 HTS 기기를 이용한 플라스미드 DNA의 정제과정에서, 효율성 및 경제성을 높이기 위해서 가장 해결해야 할 부분은 세포용해과정 후 중화과정에서 생성되는 변성 단백질 응집물(denatured protein aggregates), 세포 파편, 박테리아 지노믹 DNA(bacterial genomic DNA or chromosomal DNA) 등과 같은 비용해성 응집체 제거과정이다. 일반적으로 비용해성 응집체를 제거하기 위한 방법으로는 필터를 이용한 방법(유리섬유 필터, 나일론 필터, 실리카 등)을 이용하여 제거하거나 고속 원심분리 방법을 이용하여 제거하는 방법을 취하기 때문에 종래 과정에서 플라스미드 DNA 정제과정의 단순화 및 효율성을 향상시키기 위해서는 상기 과정을 해결할 방법들이 필요하다.
플라스미드 DNA 정제과정에서 비용해성 응집체에 대한 문제를 해결하기 위한 방법으로 다양한 기술들이 개발되었다. 한국 등록 특허 10-1193765(초고속 핵산의 정제방법, Rapid nucleic acid purification)에서는 페이퍼 크로마토그래피법(paper chromatography) 기법을 이용한 무동력 핵산 정제법을 개시하고 있으나, 시료 량의 한계, 자동화 및 대량화의 한계점을 지니고 있다.
한국 등록특허 10-0762969호(기능성 실리카 코팅 자성 나노입자를 이용한 고효율의 핵산 및 단백질의 선택적 분리정제 방법, High Efficient Separation for Nucleic Acids and Proteins with Functionalized Silica-coated MagneticNanoparticles) 에서는 알킬기와 소수성 자성입자를 이용하여 단백질의 흡수 및 탈착에 대해 개시하였으나, 자성입자를 이용한 비용해성 응집체 제거에 대해서는 직접 증명하지 못하였다.
미국 공개특허 US 5665554호 (Magnetic bead precipitation method)에서 언급한 FMP (ferrite magnetic particle)을 이용한 응집물 제거를 개제하였으나 페라이트 마그네틱 파티클 자체로 응집물 제거는 효율적이지 못하며, 표면이 공기 중에 쉽게 산화되는 특성이 있어 보관 안정성이 떨어지는 문제를 보였다.
한국 공개특허 10-2015-0089172(자성 입자를 이용한 핵산 분리 방법)에서 상기 문제를 해결하고자 소수성 자성 나노입자(hydrophobic magnetic nanoparticle)을 이용하여 비용해성 응집체를 자기장을 이용한 제거방법을 게재하였으나 소수성 나노 자성체의 복잡한 제조과정과 기존 상용화된 플라스미드 정제용 완충액들과 호환되지 못하는 점 및 컬럼 타입 핵산 정제에 비해 낮은 수율등이 문제점으로 제시된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 플라스미드 DNA의 정제과정에서 생성되는 단백질 변성 응집물, 지노믹 DNA 및 세포 잔해물과 같은 비용해성 응집체(insoluble aggregate)를 효율적으로 제거하면서 기존의 상용화된 플라스미드 DNA 정제용 완충액에 호환가능한 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 아민기가 기능화된 아민-코팅 자성 나노입자를 플라스미드 DNA 정제용 완충액에 첨가하는 경우, 상기 비용해성 응집체를 효과적으로 제거하여 플라스미드 DNA를 분리할 수 있음을 확인함으로써 본 발명은 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 아민-코팅 자성 나노입자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포 내 플라스미드 DNA 분리용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비용해성 응집체의 제거 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포 내 플라스미드 DNA 분리 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세포 내 플라스미드 DNA 분리를 위한 비용해성 응집체 제거용 아민-코팅 자성 나노입자로, 상기 아민-코팅 자성 나노입자는 자성 나노입자의 표면에 아민기가 기능화된 것을 특징으로 하는 아민-코팅 자성 나노입자를 제공한다.
본 발명자들은 플라스미드 DNA의 정제과정에서 생성되는 단백질 변성 응집물, 지노믹 DNA 및 세포 잔해물과 같은 비용해성 응집체(insoluble aggregate)를 효율적으로 제거하면서 기존의 상용화된 플라스미드 DNA 정제용 완충액에 호환가능한 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 아민기가 기능화된 아민-코팅 자성 나노입자를 플라스미드 DNA 정제용 완충액에 첨가하는 경우, 상기 비용해성 응집체를 효과적으로 제거하여 플라스미드 DNA를 분리할 수 있음을 확인하였다.
종래의 세포 내 플라스미드 DNA 분리를 위해 원심분리 또는 필터를 이용하여 여과함으로써 비용해성 응집체를 제거하는 방법과 달리, 본 발명은 플라스미드 DNA 분리를 위한 완충액에 본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자를 첨가하고 자기장을 통해 상기 비용해성 응집체를 제거하는 주요한 특징을 갖는다.
본 명세서에서 사용된, 용어 “자성”은 물질이 나타내는 자기적인 성질을 의미한다. 모든 물질은 자기장(magnetic field)과 상호작용하여 인력(attractive force) 또는 척력(repulsive force)이 발생된다. 즉, 물질에 자기장을 가하면 자화(magnetization)되고, 상기 물체가 자화되는 양상에 따라 강자성체, 상자성체, 반자성체, 페리자성체 등으로 구분된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 “나노입자”는 나노미터(nm)의 크기를 갖는 구조 또는 물질을 의미한다. 나노미터의 크기란 마이크론 미터(10-6) 크기를 1,000 분의 1로 축소한 것으로, 물질의 크기가 나노미터 수준으로 작아지면 다양하고 특이한 물리적, 화학적, 기계적 및 전자적 특성을 나타내게 된다.
상기 나노입자는 일반적으로 평균 크기가 약 1 nm 내지 약 1000 nm, 예를 들면, 약 1 nm 내지 약 10 nm, 약 10nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 100 nm 내지 약 250 nm, 약 250 nm 내지 약 500 nm, 약 500 nm 내지 약 750 nm, 또는 약 750 nm 내지 약 1000 nm 범위일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 50-500 nm, 100-400 nm, 100-300 nm 또는 100-200 nm로 제조될 수 있다. 나노입자의 크기가 500 nm 이상인 경우에는 침강 속도가 빨라져 사용상 불편함을 초래하여 침강 방지를 위해 글루코스, 슈크로스, 클리세롤, 폴리에틸렌아민, 비테인 등과 같은 분산제를 사용하여야 한다. 나노입자의 크기가 250 nm 이하에서는 상기 분산제가 필요치 않으며 50 nm 이하에서는 자성이 약하여 자기장에서 분리 시간이 오래 걸려 정제과정에서 자성 나노입자가 소실될 문제가 생기므로 고속 정제용 플라스미드 DNA 정제에 적합하지 않다.
본 명세서에서 사용된, 용어 “자성 나노입자”는 자성을 띄는 나노미터 크기의 구조 또는 물질을 의미한다.
상기 자성 나노입자는 용액 합성, 공동 침전, 졸-겔 방법, 고 에너지 분쇄, 수열 합성, 마이크로에멀젼 합성, 열분해에 의한 합성 또는 음파화학적 합성에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자성 나노입자는 철, 코발트, 니켈, 그의 산화물 및 그들의 합금으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 자성 나노입자는 철로 이루어진 자성 나노입자이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 “아민-코팅 자성 나노입자”는 표면에 아민기가 기능화된(functionalized) 자성 나노입자를 의미한다. 상기 아민기의 기능화는 아민 첨가제(amine additives), 예컨대, 아미노프로필트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane; APTES), 폴리라이신(polylysine), 글리시독시프로필트리메톡시실란(glycidoxypropyltrimethoxysilane; GPTS), 트리에톡시실란 운데칸산(triethoxysilane undecanoic acid; TETU), 및 4-트리메톡시실릴벤즈알데히드(4-trimethoxysilylbezaldehyde)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 처리하여 실시할 수 있다.
상기 아민-코팅 자성 나노입자는 자성 나노입자 표면에 아민 첨가제를 처리하여 아민기를 기능화 하거나, 상기 자성 나노입자에 최종 코팅을 아민 첨가제로 처리함으로써 최종적으로 자성 나노입자 표면에 아민기가 기능화 되도록 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자는 실리카 코팅된 자성 나노입자 상에 아민기를 기능화하여 제조한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 “비용해성 응집체”는 플라스미드 DNA의 분리 과정 중 생성되는 단백질 응집체, 세포 잔해물 및 지노믹(genomic) DNA 등을 의미한다. 상기 비용해성 응집체는 인클루젼 바디(inclusion body)과 동일한 의미로 사용할 수 있다.
본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자를 이용한 비용해성 응집체의 제거는 당업계에 공지된 플라스미드 DNA를 포함하는 임의의 세포를 대상으로 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포는 박테리아 또는 효모이다.
본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자는 비용해성 응집체를 제거하기 위해 플라스미드 DNA 분리를 위한 완충액에 처리될 수 있다.
상기 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 방법은 다음의 4단계로 나눌 수 있다. ① 세포 현탁물을 제조하는 단계1; ② 세포의 용해, 단백질 응집 및 DNA 변성의 단계2; ③ 세포 DNA를 중화시키는 단계3; 및 ④ 플라스미드 DNA를 수득하는 단계4.
상기 단계2의 완충액에 함유된 계면활성제는 세포막에 포함되어 있는 인지질과 단백질을 제거하여 세포막을 터뜨림으로써 세포 성분의 방출을 유도한다. 또한 NaOH는 플라스미드 DNA, 지노믹 DNA, 단백질을 변성시킨다. 상기 단계3의 완충액에 함유된 아세트산칼륨은 변성된 플라스미드 DNA를 이중가닥으로 재생시키며 이보다 복잡한 지노믹 DNA는 이중가닥으로 복구되지 못하고 단백질과 더불어 비용해성의 복잡한 DNA 구조를 형성하게 된다.
상기 단계1에 이용되는 완충액1은 Tris-Cl 1-50 mM, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid) 1-10 mM 및 RNaseA 0.01-0.2 ㎎/㎖를 포함할 수 있다. 상기 Tris-Cl의 농도는 10-50 mM, 20-50 mM, 30-50 mM 또는 40-50 mM이고, 상기 EDTA의 농도는 2-10 mM, 4-10 mM, 6-10 mM 또는 8-10 mM이며, 상기 RNaseA의 농도는 0.03-0.17 ㎎/㎖, 0.06-0.14 ㎎/㎖ 또는 0.09-0.11 ㎎/㎖일 수 있다.
상기 단계2에 이용되는 완충액2는 NaOH 0.05-0.2 N 및 SDS(Sodium dodecyl sulfate) 0.5-5%를 포함할 수 있다. 상기 NaOH의 농도는 0.08-0.2 N, 0.12-0.2 N 또는 0.16-0.2 N이고, 상기 SDS의 농도는 0.5-4.5%, 1.5-4.0% 또는 1.5-3.5%일 수 있다.
상기 단계3에 이용되는 완충액3은 염산구아니딘 2-5 M, 아세트산칼륨 0.1-1.0 mM, 아세트산 0.5-3 M를 포함할 수 있다. 상기 염산구아니딘의 농도는 2.5-4.5 M, 3.0-4.5 M 또는 3.5-4.5 M이고, 상기 아세트산칼륨의 농도는 0.2-0.9 mM, 0.3-0.8 mM, 0.4-0.8 mM, 0.5-0.8 mM 또는 0.6-0.8 mM이며, 상기 아세트산의 농도는 1.0-3.0 M, 1.5-3.0 M 또는 2.0-3.0 M일 수 있다.
상기 완충액1 내지 3에 포함되는 화합물은 동일한 기능을 갖는 다른 화합물로 대체될 수 있으며, 경우에 따라 적절한 농도로 완충액 내에 포함될 수 있다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 아민-코팅 나노입자를 이용한 비용해성 응집체의 제거 방법 또는 세포 내 플라스미드 DNA 분리 방법에 최적 조건은 완충액1(50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.1 ㎎/㎖ RNase A), 완충액2(0.2N NaOH, 2% SDS) 및 완충액3(4 M 염산구아니딘, 750 mM 아세트산칼륨, 2.5 M 아세트산, 60 ㎎/㎖ 아민-코팅 자성 나노입자)이다.
상기 플라스미드 DNA를 분리하고자 하는 세포가 효모인 경우, 단계2의 완충액은 효모 세포벽을 분해하기 위한 자이몰리아제(zymolyase)와 같은 효모 세포벽 용해제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자는 상기 단계1 내지 3에 이용되는 완충액과 호환 가능하다. 즉, 상기 완충액에 본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자를 첨가하여 실시하고 단계3 이후에 자기장을 이용하여 비용해성 응집체를 제거할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아민-코팅 자성 나노입자는 세포 현탁물, 세포 용해물 또는 상기 세포 용해물을 중화시켜 비용해성 응집체가 형성된 반응물에 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아민-코팅 자성 나노입자는 1-100 ㎎/㎖ 농도로 첨가될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 아민-코팅 자성 나노입자는 10-90 ㎎/㎖, 20-80 ㎎/㎖, 30-70 ㎎/㎖, 40-70 ㎎/㎖ 또는 50-70 ㎎/㎖로 첨가될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아민-코팅 자성 나노입자를 유효성분으로 포함하는 세포 내 플라스미드 DNA 분리용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 내 플라스미드 DNA 분리용 조성물은 본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자를 플라스미드 DNA 분리용 완충액이다.
본 발명의 세포 내 플라스미드 DNA 분리용 조성물은 상기 아민-코팅 자성 나노입자를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비용해성 응집체(insoluble aggregate)의 제거 방법을 제공한다:
(a) 플라스미드 DNA를 포함하는 세포의 현탁물, 용해물 또는 상기 용해물을 중화시켜 비용해성 응집체가 형성된 반응물에 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 아민-코팅 자성 나노입자를 처리하여 상기 아민-코팅 자성 나노입자 및 비용해성 응집체의 흡착을 유도하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 자기장을 이용하여 비용해성 응집체를 제거하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 세포 내 플라스미드 DNA 분리 방법을 제공한다:
(a) 플라스미드 DNA를 포함하는 세포 부유물 또는 이의 용해물에 아민-코팅 자성 나노입자를 처리하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 자기장을 이용하여 비용해성 응집체를 제거하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물에 실리카-코팅 자성 나노입자를 처리하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 자기장을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하는 단계.
본 발명의 비용해성 응집체의 제거 방법 및 세포 내 플라스미드 DNA 분리 방법은 상기 아민-코팅 자성 나노입자와 관련된 설명과 거의 동일하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 세포 내 플라스미드 DNA 분리를 위한 비용해성 응집체 제거용 아민-코팅 자성 나노입자 및 이를 이용한 플라스미드 DNA 분리 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자는 종래의 플라스미드 DNA 분리 과정에 이용되는 완충액과 호환 가능한 이점을 갖는다.
(c) 본 발명의 아민-코팅 자성 나노입자는 플라스미드 DNA 분리 과정의 완충액 내 첨가되어 원심분리 또는 여과 과정이 아닌 자기장을 이용하여 비용해성 응집체를 제거함으로써 플라스미드 DNA 분리 과정을 보다 단순화하여 효율성을 향상시킬 수 있다.
도 1a는 두 가지 수용성 자성입자를 이용한 플라스미드 DNA 정제 결과에 대한 전기영동 사진이다.
도 1b는 본 발명에 따른 플라스미드 정제과정을 나타내는 모식도이다
도 2는 두 가지 서로 다른 아민 코팅법을 이용해 제조된 수용성 아민 자성체를 이용한 정제결과에 대한 전기영동 사진이다.
도 3a는 수용성 아민 코팅 자성입자를 플라스미드 DNA 정제 단계별 투입 결과 비용해성 응집체의 제거 효율에 대한 결과이다.
도 3b는 클로로포름 사용 여부에 따른 플라스미드 DNA 정제 결과에 대한 제한효소 처리 및 PCR 수행에 대한 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명에 제시한 방법과 조성물을 이용한 소량 및 대량 정제 결과에 대한 전기영동 사진이다.
도 1b는 본 발명에 따른 플라스미드 정제과정을 나타내는 모식도이다
도 2는 두 가지 서로 다른 아민 코팅법을 이용해 제조된 수용성 아민 자성체를 이용한 정제결과에 대한 전기영동 사진이다.
도 3a는 수용성 아민 코팅 자성입자를 플라스미드 DNA 정제 단계별 투입 결과 비용해성 응집체의 제거 효율에 대한 결과이다.
도 3b는 클로로포름 사용 여부에 따른 플라스미드 DNA 정제 결과에 대한 제한효소 처리 및 PCR 수행에 대한 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명에 제시한 방법과 조성물을 이용한 소량 및 대량 정제 결과에 대한 전기영동 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 두 가지 수용성 자성체를 이용한 플라스미드 DNA 분리정제 방법
박테리아로부터 플라스미드 DNA를 추출하기 위하여 다음과 같이 두 가지 플라스미드 DNA가 도입된 박테리아를 이용하였다.
고복제수 플라스미드(High copy number plasmid)인 pUC19 벡터(2.9 kb)에 다중 제한효소 클로닝 부위(MCS; multi cloning site)에 2.5 kb 크기의 박테리아 DNA가 도입된 pUC19-B1 플라스미드 DNA를 숙주세포인 대장균(DH5α)균주에 형질전환하여 실험하였으며, 저복제수 플라스미드(low copy number plasmid)의 경우는 pET28a(5.3 kb) 벡터가 도입된 대장균 DH5α균주를 이용하여 핵산 정제를 수행하였다. pUC19 벡터가 되입된 DH5α는 암피실린(ampicilin)이 함유된 배지에서, pET28a 벡터가 도입된 DH5α는 카나마이신(kanamycine)이 함유된 배지에서 37℃, 250 rpm으로 16시간 진탕 배양 후 소량정제(miniprep)의 경우 0.5-2 ㎖을 취하여 실험하였으며, 대량정제(Midi/Maxi prep)의 경우 50-200 ㎖의 배양 세포로부터 플라스미드 DNA 정제를 수행하였다.
구체적으로, 16시간 배양한 형질전환 대장균 2 ㎖을 수확하여 250 ㎕ 완충액 1 (50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.1 ㎎/㎖ RNase A)으로 분산시켰다. 분산 후 250 ㎕ 완충액 2(0.2N NaOH, 2% SDS)와 200 ㎕ 클로로포름을 넣고 1분간 방치시켜 용해시킨 다음 아민-코팅 자성나노입자가 포함된 완충액 3(4 M 염산구아니딘, 750 mM 아세트산칼륨, 2.5 M 아세트산, 60 ㎎/㎖ 라이신 코팅 자성 나노입자 또는 APTES 코팅 자성 나노입자)를 350 ㎕ 첨가 후 5-6회 위 아래로 흔들어 주었다. 상기 반응액을 자성입자 분리 스탠드에 1분 동안 방치하여 비용해성 응집체를 아민-코팅 자성입자로 분리시켜 남은 상층액을(클로로포름층 제외) 회수하여 새로운 튜브에 옮겼다. 상기 상층액에 실리카 코팅 자성 나노입자(30 ㎎/㎖)를 100 ㎕ 첨가하여 플라스미드 DNA와 결합 시킨 다음 자성입자 분리 스탠드에 1분 동안 두어 회수한 후 남은 용액을 제거하였다. 실리카 코팅 자성 나노입자에 포집된 플라스미드 DNA를 80% 에탄올 800 ㎕를 첨가하여 상기와 같은 방법으로 세척한 다음 55℃에서 10분 동안 방치하여 잔류 에탄올이 제거 될 때까지 건조시켰다. 건조 후 100-200 ㎕ TE 완충용액(10 mM Tris.Cl(pH 8.0), 1 mM EDTA) 또는 멸균수를 넣어 실리카 코팅 자성 나노입자로부터 플라스미드 DNA를 용출시킨 후 자성입자 분리스탠드에 두어 자성 나노입자를 부착시켜 용출된 플라스미드 DNA만 회수하였다.
회수된 DNA의 정제 결과를 분광광도계를 이용하여 DNA 수율 및 순도를 확인하고(표 1), 1% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 확인하였다(도 1).
| - | 농도 (ng/ul) | O.D (260/280) | O.D (260/230) | 총량 (ug) |
| pUC-B1 | 103.5 | 2.06 | 1.93 | 10.35 |
| pET28a | 85.4 | 2.09 | 1.85 | 8.54 |
실시예 2. 두가지 아민 코팅 자성 나노입자를 이용한 핵산 정제 결과
실리카 코팅 자성입자는 Stober 방법(Stober W, Fink A. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. J Colloid Interface Sci. 1968;28:629.)을 이용하여, TEOS (tetraethylorthosilicate)를 암모니아로 가수분해 하여 Fe3O4의 표면을 실리카(SiO2)로 코팅하여 생산하였다.
상기 실리카 코팅 자성입자의 표면에 아민기를 코팅하여 아민-코팅된 자성 나노입자를 제조하였다. 아민으로 표면을 코팅하는 방법은 여러가지가 알려져 있지만 대표적인 방법은 아미노산인 L-라이신(L-lysine)을 이용한 방법과 APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane)를 이용한 코팅 방법이 있다. 이 두 가지 아민 코팅 방법을 이용하여 제작된 자성체 나노입자의 비용해성 응집체에 대한 제거 효율 및 핵산 정제시 순도를 비교 테스트 수행하였다. 라이신을 이용한 아민으로 표면변경법은 실리카 코팅된 자성입자를 이용하여 Zehra et al. 그룹이 제시한 방법(l-lysine coated magnetite nanoparticles: synthesis, structural and conductivity characterization. J alloys Compd 484:371-376)을 이용해 수행하였으며, APTES를 이용한 표면 변경법은 실리카 코팅된 자성입자를 이용하여 Cao et al. 그룹이 제시한 방법(Fabrication of Cyclodextrin Functionalized Superparamagnetic Fe3O4/Amino-Silane Core-Shell Nanoparticles via Layer-by-Layer Method. Applied Surface Science, 255, 7974-7980.)방법을 이용해 수행하였다. 상세하게 기술하면, L-라이신을 이용한 아민 코팅방법은 100 g의 실리카 코팅 자성입자를 멸균수에 분산하여 최종 34 mM 농도가 되도록 L-라이신을 넣어준 다음, 최종 농도가 2.8%가 되도록 암모니아를 넣고 상온에서 24시간 반응시켜 생산하였다. APTES를 이용한 아민 코팅법은 100g의 실리카 코팅 자성입자를 80% 에탄올에 분산 하여 최종 1.5% APTES를 넣고 섞어준 다음, 최종 농도가 0.56%가 되도록 암모니아를 넣고 상온에서 24시간 반응 시켜 생산하였다.
이 두 가지 수용성 아민 코팅 자성입자를 이용하여 실시예 1과 같은 방법으로 핵산 정제 수행 후 순도확인 결과는 표 2와 같이 큰 차이를 보이지 않았으며, 전기영동 결과에서도 큰 자이를 보이지 않았다(도 2).
| - | 농도 (ng/ul) | O.D (260/280) | O.D (260/230) | 총량 (ug) |
| 라이신 코팅 | 116.9 | 2.08 | 1.82 | 11.69 |
| APTES 코팅 | 110.0 | 2.06 | 1.80 | 11.00 |
실시예
3. 플라스미드 DNA 정제단계에서
아민코팅
자성입자의 투입 단계에 따른 비용해성 응집체 제거 효율
다른 완충액에 넣어서 사용할 경우의 비용해성 응집체의 제거 효율을 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. (a) 실시예 1과 같이 아민코팅 자성입자를 중화용액(완충액 3)에 희석하여 사용한 경우, (b) 용해 용액(완충액 2)에 자성입자를 넣어 사용한 경우, (c) 분산 용액(완충액 1)에 자성입자를 넣어 사용한 경우를 비교하였다. 비용해성 응집체에 대한 제거효율을 측정하기 위하여, 상기 완충액에 포함된 아민 코팅 자성입자를 이용한 제거와 원심분리로 제거 후 플라스미드 DNA의 정제 순도를 측정하여 비교하였다. 수용성 아민코팅 자성입자를 상기 단계별 투입하여 플라스미드 정제결과 표 3에 보는바와 같이 수율은 비슷하였으나, 중화용액과 용해용액에 아민자성입자를 넣어서 비용해성 응집체를 제거하는 것이 제일 좋은 결과를 나타내었다.
| - | 원심분리법 | 완충액 1 | 완충액 2 | 완충액3 |
| Total DNA yield(ug) | 10.35 | 10.54 | 11.35 | 11.61 |
| O.D. 260/280 ㎚ | 2.01 | 2.06 | 2.03 | 2.06 |
| O.D. 260/230 ㎚ | 1.83 | 1.62 | 1.77 | 1.80 |
실시예 4. 클로로포름 사용 여부에 따른 핵산 정제 순도 향상결과 비교
플라스미드 정제시 실시예 1에서 클로로포름을 사용하지 않은 경우 분광광도계를 이용한 핵산 정제 수율 및 순도 관찰결과 수율은 비슷하나 260/230 비가 클로로포름 처리한 경우 더 좋은 순도를 나타내었다(표 4).
| - | 농도 (ng/ul) | O.D.(260/280) | O.D.(260/230) | 총량(ug) |
| 클로로포름 처리 × | 111.5 | 2.03 | 1.60 | 11.15 |
| 클로로포름 처리 ○ | 114.5 | 2.05 | 1.84 | 11.45 |
전기영동 결과와 PCR 수행결과 및 제한효소 처리결과에서는 도 3에서 보이는 바와 같이 큰 차이를 보이지 않았다.
실시예 5. 대량 배양액에서의 정제 과정
상기 실시예 1에서는 소량 배양액(0.5-2 ㎖)의 세포배양액으로부터 플라스미드를 정제하였다. 본 발명에서 개시한 조성물과 방법을 이용하여 50-200 ㎖의 대량 배양액으로부터 세포를 수집 후 실시예 1에서 언급한 방법으로 플라스미드 DNA 정제를 수행하였다. 구체적으로는 고복제수 플라스미드인 pUC19-B1 벡터를 포함한 세포 50-100 ㎖ 배양액에서 세포를 수집하여 2.5 ㎖ 분산 완충액(suspension buffer), 2.5 ㎖ 용해 완충액(lysis buffer), 3 ㎖ 클로로포름, 3.5 ㎖ 아민 코팅 자성체가 포함된 중화 완충액(neutralization buffer + amine coated magnetic nanoparticle)를 실시예 1과 같은 방법으로 처리 후 플라스미드 DNA를 정제하였다(도 4).
표 5에서 나타낸 바와 같이 소량 및 대량 배양 세포에서 정제 효율 및 순도에는 큰 차이를 나타내지 않았다.
| - | 농도 (ng/ul) | O.D.(260/280) | O.D.(260/230) | 총량(ug) |
| pUC19(2 ㎖ 배양) | 98.7 | 2.01 | 1.85 | 9.87 |
| 106.9 | 2.00 | 1.88 | 10.69 | |
| pUC19(50 ㎖ 배양) | 108.4 | 2.03 | 1.92 | 216.8 |
| 105.3 | 2.05 | 1.85 | 210.6 |
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
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- 자성 나노입자의 표면에 아민기가 기능화된 아민-코팅 자성 나노입자를 유효성분으로 포함하는 비용해성 응집체 제거용 조성물로,
상기 자성 나노입자의 크기는 50 nm 내지 500 nm 이고,
상기 조성물은 (i) RNase A가 처리된 세포 현탁물 (ii) 세포 용해물 또는 (iii) 상기 세포 용해물을 중화시켜 비용해성 응집체가 형성된 반응물에 원심분리없이 처리되는, 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는 비용해성 응집체(insoluble aggregate)의 제거 방법:
(a) 플라스미드 DNA를 포함하는 (i) RNase A가 처리된 세포 현탁물 (ii) 세포 용해물 또는 (iii) 상기 용해물을 중화시켜 비용해성 응집체가 형성된 반응물에, 자성 나노입자의 표면에 아민기가 기능화된 아민-코팅 자성 나노입자를 처리하여 상기 아민-코팅 자성 나노입자 및 비용해성 응집체의 결합을 유도하는 단계로서,
상기 자성 나노입자의 크기는 50 nm 내지 500 nm 이고; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 원심분리를 실시하지 않고 자기장을 이용하여 비용해성 응집체를 제거하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 세포 내 플라스미드 DNA 분리 방법:
(a) 플라스미드 DNA를 포함하는 (i) RNase A가 처리된 세포 부유물 또는 (ii) 세포 용해물에, 자성 나노입자의 표면에 아민기가 기능화된 아민-코팅 자성 나노입자를 처리하여 상기 아민-코팅 자성 나노입자 및 비용해성 응집체의 결합을 유도하는 단계로서,
상기 자성 나노입자의 크기는 50 nm 내지 500 nm 이고;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 원심분리를 실시하지 않고 자기장을 이용하여 비용해성 응집체를 제거하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물에 실리카-코팅 자성 나노입자를 처리하여 실리카-코팅 자성 나노입자 및 플라스미드 DNA의 결합을 유도하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 자기장을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하는 단계.
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