CN113447553A - 基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器及其应用，制备时，将K3[Fe(CN)6]封装到介孔二氧化硅(MSN)孔道当中，通过APTES处理使MSN表面带正电荷，随后利用静电作用将适配体和还原氧化石墨烯(RGO)结合在MSN表面形成“分子门”，即获得信号探针的封装控释体系，同时以带正电的ITO电极作为传感电极，通过检测过程中释放出的K3[Fe(CN)6]及RGO在电极上所引起的信号响应与目标物浓度之间的关系实现对靶标的检测。与现有技术相比，本发明利用适配体‑RGO复合物构建双重“分子门”，通过目标物诱导控制信号分子的定量释放，提高了检测灵敏度。同时，传感器的制备方法简单，分析快速，具备良好的选择性和抗干扰能力，在其他污染物的监测中也有着广泛的应用前景。

Description

基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器及其应用
技术领域
本发明属于电化学分析技术领域，涉及一种基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器及其应用。
背景技术
农药，是指农业上用于防治病虫害及调节植物生长的化学药剂。农药品种很多，按用途主要可分为杀虫剂、杀螨剂、杀鼠剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂等。然而，农药若流失到环境中，将造成严重的环境污染，有时甚至造成极其危险的后果。
例如，阿特拉津(ATZ)作为当前农业生产过程中使用最广泛、最典型的一种三嗪类除草剂，因使用量大、稳定性强、在水体中残留时间较长，也被认为是最具污染力的农药之一。其使用时极易对土壤、农作物、地表水造成严重的污染，饮用富含阿特拉津的水不仅存在潜在的致癌风险，还会导致内分泌紊乱、激素紊乱等一系列健康问题。因此，建立一种简便、高效的分析方法以实现对水体中ATZ的快速、高效检测具有重要的意义。
目前，ATZ的分析方法主要包括仪器分析方法、传感分析方法等，但传统的仪器分析过程中样品前处理繁琐、分析周期较长、操作复杂、检测灵敏度较低，而传感分析通常需要将识别元件固定在电极表面上，往往因电极的面积有限、识别元件固定不稳定等缺点，极大地限制了传感体系的发展。
近年来，通过在二氧化硅微球表面设计“分子门”，有效控制孔内物质释放过程，进而构筑基于控释过程的非固定型传感平台的技术受到了越来越多人们的关注。当前已报道的“分子门”主要包括纳米粒子、生物分子、聚合物、超分子组装体等等，它们所构筑的传感体系对目标物的检测大多展现良好的分析效果，但仍然存在着一些不足，如：“分子门”的封堵效果不佳，孔内封装物质易泄露，背景信号过大，MSN(介孔二氧化硅纳米颗粒)表面的修饰较为复杂，“分子门”对目标物刺激的响应不够灵敏等等，限制了该技术的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器及其应用。本发明将目标物的识别检测与封装物的释放结合起来，利用适配体-RGO复合物构建双重“分子门”，通过目标物诱导控制信号分子的定量释放，实现孔道内信号分子的精确可控释放，提升了传感体系的检测性能，可实现对环境水样中农药类污染物的高灵敏度、高选择性分析检测。同时，传感器制备简单，分析快速，具备良好的选择性和抗干扰能力，在其他污染物的监测中也有着广泛的应用前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，该方法包括表面带正电的ITO传感电极的制备及MSN封装控释元件的制备；
所述的表面带正电的ITO传感电极的制备方法为：将预处理后的ITO玻璃放入至APTES溶液(采用乙醇配制，体积分数为1.0％-2.0％)中浸泡5-6h，制得表面带正电的ITO传感电极；
所述的MSN封装控释元件的制备方法包括以下步骤：
1)采用模板法制备MSN；
2)通过摇动扩散过程将K3[Fe(CN)6]信号分子封装到MSN的孔道中，得到K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液；
3)利用APTES对步骤2)中的K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液进行处理，使MSN表面带正电荷，得到MSN-NH2分散液；
4)通过静电作用将适配体和还原氧化石墨烯(RGO)结合在步骤3)中的MSN-NH2表面上，形成双重“分子门”，制得MSN封装控释元件；
所述的APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述的MSN为介孔二氧化硅纳米颗粒。
进一步地，所述的ITO玻璃的预处理过程为：将切割后的ITO玻璃依次放入NaOH(0.8-1.2M)溶液、丙酮、乙醇和水中，分别超声清洗10-15min，之后置于空气气氛中干燥。
优选地，所述的ITO玻璃为1.0×5.0cm的氧化铟锡透明导电玻璃。
进一步地，步骤1)中，所述的MSN的制备过程为：将CTAB(0.5-0.6g)溶于水中(230-250mL)，之后加热至80-90℃，并依次加入NaOH溶液(3-4mL，2M)、TEOS(2.0-3.0mL)，之后继续搅拌2.5-3.5h，经洗涤(用超纯水和乙醇清洗沉淀2-3次)、干燥(55-65℃真空干燥)、煅烧后，即制得所述的MSN；
所述的CTAB为十六烷基溴化铵，所述的TEOS为正硅酸乙酯；
煅烧过程中，温度为500-550℃，煅烧时间为5-6h。
进一步地，步骤2)具体为：将制得的MSN(50-100mg)超声分散到无水乙醇(1-2mL)中，之后加入K3[Fe(CN)6]溶液(1-2mL，0.5M)，得到混合液，将混合液轻摇10-12h，使K3[Fe(CN)6]进入MSN的孔道中，得到K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液。
进一步地，步骤3)具体为：向K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液中加入APTES(0.4-0.8mL)，并搅拌6-7h，得到带正电的MSN-NH2，经洗涤(用乙醇和超纯水各清洗2-3次)后重新分散到Tris-HCl缓冲溶液(1.5-2.0mL)中，得到MSN-NH2分散液。
进一步地，步骤4)具体为：将适配体溶液(200-300μL，8-12μM)与MSN-NH2分散液(1.0-1.5mL)混合，并在室温下搅拌孵育4-5h，使带负电的适配体通过静电作用吸附在MSN-NH2表面，得到MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液，之后向MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液中加入RGO溶液(300-400μL)，混合均匀后轻摇5-6h，经洗涤(离心洗涤)后重新分散到Tris-HCl缓冲溶液(1.0-1.5mL)中，得到MSN/K3[Fe(CN)6]-APT-RGO分散液，即为含有MSN封装控释元件的分散液。
进一步地，所述的RGO溶液的制备方法为：将氧化石墨烯配成0.20-0.25mg·mL-1的水溶液，并转移至聚四氟乙烯内胆的高压反应釜中，于175-185℃下反应5.5-6.5h，即得到RGO溶液。
基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器，该传感器采用所述的方法制备而成，所述的传感器包括表面带正电的ITO传感电极及MSN封装控释元件。
基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的应用，所述的传感器用于对水环境中的农药进行检测。通过检测过程中释放出的K3[Fe(CN)6]及RGO在电极上所引起的信号响应与目标物浓度之间的关系实现对靶标物的检测。
进一步地，检测过程为：向含有MSN封装控释元件的分散液(约50μL)中加入待检测水溶液(5-10μL)和Tris-HCl缓冲溶液(约5mL)，混合均匀后放置在25-30℃的生化培养箱中孵育过夜，得到样品溶液，之后以表面带正电的ITO传感电极作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，建立三电极体系，测定样品溶液的DPV曲线(扫描范围为0.6～-0.2V)，根据DPV氧化峰强度与靶标物农药浓度的对应关系(将DPV氧化峰强度与靶标物农药浓度的对数关系绘制成工作曲线)，得到水环境中的靶标物农药浓度。
对所述的传感器进行选择性测定，方法为：向MSN/K3[Fe(CN)6]-APT-RGO分散液(约50μL)中加入一定浓度的靶标物农药溶液(5-10μL)、100倍浓度的其他干扰物混合溶液和Tris-HCl缓冲溶液(约5mL)，混合均匀后放置在30℃生化培养箱中孵育过夜。采用上述同样方法，在相同条件下进行DPV曲线测定，研究在干扰物共存下电化学峰强度的变化，考察传感器的选择性能。干扰物为草甘膦、氧乐果、腐殖酸、四螨嗪、啶虫脒、敌百虫或双酚A。
非固定型传感器无需将识别元件固定到电极表面上，从而极大地简化了传感电极的修饰步骤，使传感器的孵育体系与检测体系均在同一均相溶液中实现，通过目标物识别诱导信号分子的释放产生电流响应实现对目标物的定量检测。该策略简单方便，可实现传感电极及封装载体的重复利用，降低了检测成本，也大大提高了传感检测的重复性和灵敏性，能够实现pM浓度下的检测。
介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)具有较大的比表面积和介孔体积，良好的生物相容性和化学稳定性，形貌及孔径尺寸可控，易于进行表面修饰、毒性低等优势，在药物运输、催化、可控释放、生物成像、化学分离等诸多领域有着重要的应用价值。特别是在二氧化硅微球表面设计“分子门”，通过有效控制孔内物质释放过程，进而构筑控释生物传感平台的技术受到了越来越多的关注。在该过程中通常将信号分子包裹在特定“分子门”封堵的二氧化硅材料中，只有靶标物才可诱导“分子门”打开，释放出信号分子，从而极大地降低了体系中的背景信号干扰。
核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的单链DNA或RNA片段，核酸适配体作为一种新型的“人工抗体”，与传统的抗体、酶、分子印迹等识别元件相比，具有合成过程方便、易于修饰负载、性质结构稳定且亲和力强等优点，因此备受分析检测领域研究学者的青睐，在传感检测领域有着广泛的应用。因此，本发明在MSN表面引入核酸适配体，不仅作为识别元件，同时也起到了“分子门”的作用，在检测过程中有效控制孔内信号分子的释放，从而构筑基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器用于检测水样中的靶标物，以获得良好的检测灵敏度和选择性。
还原氧化石墨烯(RGO)是氧化石墨烯经过还原过程所得，具有与石墨烯相似的结构，以及较大比表面积、优良导电性等优势，特别是RGO独特的二维平面共轭结构和表面强烈的疏水作用，能与DNA等生物分子之间通过强烈的π-π作用结合，获得稳定的复合结构。RGO的引入不仅能与适配体结合作为控释体系的“分子门”，同时也能在传感检测过程中增强电极上的信号响应。
具体而言，本发明在制备传感器时，先将K3[Fe(CN)6]信号分子封装到介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)的孔道当中，并通过APTES处理使MSN表面带有一定的正电荷，随后利用静电作用将适配体和还原氧化石墨烯(RGO)结合在MSN表面形成双重“分子门”，即获得信号探针的封装控释体系。同时，对ITO传感电极进行APTES浸泡处理，获得带正电的工作电极，正电处理不仅可吸附大量的K3[Fe(CN)6]以产生强烈的DPV响应信号，同时也可吸附体系中游离的RGO，为实现信号的放大提供基础。在检测过程中，以带正电的ITO电极作为传感电极，利用靶标诱导释放出的K3[Fe(CN)6]信号分子及“分子门”中游离出来的RGO两者间的协同作用产生的电流信号与靶标浓度之间的量效关系，可以简便快速高灵敏地建立对靶标特异性识别的适配体电化学传感新方法。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明构筑了一种非固定型传感器，无需将识别元件固定在电极表面，电极本身的制备过程简单，易于操作，对靶物质的识别与检测过程都在均相溶液中进行，有效提高了传感体系的稳定性和重复再生性。
2)本发明引入核酸适配体，不仅作为识别元件，通过静电吸附作用直接结合到介孔二氧化硅表面，具有步骤简单、易于实现、不需要更多复杂修饰处理等优点，在检测过程中能够实现对靶标分子的特异性结合，有效提高了传感器的选择性，同时也可与RGO之间通过π-π堆叠作用结合，构建双重“分子门”，从而实现检测过程中信号分子的可控释放，增强传感检测的灵敏度和准确性。
3)本发明采用介孔二氧化硅作为信号分子的封装载体，其合成过程简单，结构性能稳定，具有较大的比表面积，作为信号分子的封装载体，可封装大量的K3[Fe(CN)6]信号分子，为靶标物的高灵敏度检测提供了基础；
4)本发明构筑基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器，将介孔二氧化硅对孔内封装物的可控释放过程与电化学检测技术相结合，实现了对水样中ATZ的高灵敏度、高选择性分析检测，检测限低至1.0pM，线性检测范围为3.0pM-1.0nM，方法简便易行，可用于环境中水样的实时分析及定性定量检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明提供了一种基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，该方法包括表面带正电的ITO传感电极的制备及MSN封装控释元件的制备。
其中，表面带正电的ITO传感电极的制备方法为：将预处理后的ITO玻璃放入至APTES溶液中浸泡5-6h，制得表面带正电的ITO传感电极。ITO玻璃的预处理过程为：将切割后的ITO玻璃依次放入NaOH溶液、丙酮、乙醇和水中，分别超声清洗10-15min，之后置于空气气氛中干燥。
MSN封装控释元件的制备方法包括以下步骤：
1)采用模板法制备MSN(介孔二氧化硅纳米颗粒)：将CTAB(十六烷基溴化铵)溶于水中，之后加热至80-90℃，并依次加入NaOH溶液、TEOS(正硅酸乙酯)，之后继续搅拌2.5-3.5h，经洗涤、干燥、煅烧后，即制得MSN。煅烧过程中，温度为500-550℃，煅烧时间为5-6h。
2)通过摇动扩散过程将K3[Fe(CN)6]信号分子封装到MSN的孔道中，得到K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液。具体为：将制得的MSN超声分散到无水乙醇中，之后加入K3[Fe(CN)6]溶液，得到混合液，将混合液轻摇10-12h，使K3[Fe(CN)6]进入MSN的孔道中，得到K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液。
3)利用APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)对步骤2)中的K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液进行处理，使MSN表面带正电荷，得到MSN-NH2分散液。具体为：向K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液中加入APTES，并搅拌6-7h，得到带正电的MSN-NH2，经洗涤后重新分散到Tris-HCl缓冲溶液中，得到MSN-NH2分散液。
4)通过静电作用将适配体和还原氧化石墨烯结合在步骤3)中的MSN-NH2表面上，制得MSN封装控释元件。具体为：将适配体溶液与MSN-NH2分散液混合，并在室温下搅拌孵育4-5h，使带负电的适配体通过静电作用吸附在MSN-NH2表面，得到MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液，之后向MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液中加入RGO溶液，混合均匀后轻摇5-6h，经洗涤后重新分散到Tris-HCl缓冲溶液中，得到MSN/K3[Fe(CN)6]-APT-RGO分散液，即为含有MSN封装控释元件的分散液。RGO溶液的制备方法为：将氧化石墨烯配成0.20-0.25mg·mL-1的水溶液，并转移至聚四氟乙烯内胆的高压反应釜中，于175-185℃下反应5.5-6.5h，即得到RGO溶液。
本发明同时提供了一种基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器，该传感器采用上述方法制备而成，传感器包括表面带正电的ITO传感电极及MSN封装控释元件。
本发明还提供了一种基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的应用，该传感器用于对水环境中的农药进行检测。检测过程为：向含有MSN封装控释元件的分散液中加入待检测水溶液和Tris-HCl缓冲溶液，混合均匀后放置在25-30℃的生化培养箱中孵育过夜，得到样品溶液，之后以表面带正电的ITO传感电极作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，建立三电极体系，测定样品溶液的DPV曲线，根据DPV氧化峰强度与靶标物农药浓度的对应关系，得到水环境中的靶标物农药浓度。
下述实施例以环境水样中的农药污染物阿特拉津(ATZ)的检测为例。
实施例1：
基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法如下：
(1)制备ITO传感电极。将ITO玻璃切割成1.0cm×5.0cm大小，依次放入1M NaOH溶液、丙酮、乙醇和去离子水中各超声清洗10min，放置在空气气氛中干燥。随后将ITO玻璃放入APTES溶液中浸泡6h，依次用乙醇和超纯水冲洗，放在空气中干燥。
(2)制备MSN纳米颗粒。称取0.5g十六烷基溴化铵(CTAB)，并溶解在250mL超纯水中，随后加热至90℃，并加入3.5mL NaOH溶液(2M)以调节pH。在连续搅拌下，缓慢滴加2.5mL正硅酸乙酯(TEOS)，继续加热搅拌3h，用超纯水和乙醇将生成的沉淀各清洗3遍，放在60℃真空烘箱中干燥，随后置于550℃条件下煅烧5h即制得MSN纳米颗粒。
(3)MSN孔道中封装K3[Fe(CN)6]信号分子。称取100mg的MSN样品，超声分散到2mL无水乙醇中，加入2mL的K3[Fe(CN)6]溶液(0.5M)，将混合液轻摇12h，使K3[Fe(CN)6]进入MSN的孔道当中。
(4)MSN表面氨基化处理。向K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液中加入0.8mLAPTES，搅拌6h，形成带正电的MSN-NH2。将分散液用乙醇和超纯水各清洗3次，并重新分散到2.0mLTris-HCl缓冲溶液(100mM，pH＝7.4)中。
(5)构建APT-RGO双重“分子门”。将核酸适配体配成浓度为10μM的水溶液，取200μL适配体溶液与1.0mL MSN-NH2分散液混合，在室温下搅拌孵育5h，使带负电的适配体通过静电作用吸附在MSN-NH2表面，获得MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液。向MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液中加入300μL RGO溶液(0.25mg·mL-1)，混合均匀后放在摇床上轻摇5h，随后离心洗涤并重新分散在1.0mL的Tris-HCl缓冲溶液中，获得APT-RGO双重“分子门”封堵的MSN/K3[Fe(CN)6]-APT-RGO分散液。
介孔二氧化硅纳米粒子为球形结构，粒径大小约为200-300nm，孔径分布均匀，孔径尺寸约为2.35nm。当孔道内封装信号分子，进一步构建适配体-RGO“分子门”后，二氧化硅颗粒表面有物质附着，表明二氧化硅封装控释元件被成功制备。
实施例2：
采用实施例1制备的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器进行ATZ的电化学检测。传感器的电化学性质使用CHI660c工作站进行表征，以制备的带正电的ITO传感电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在100mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)中进行电化学DPV测定，扫描范围为0.6～-0.2V。具体过程如下：
取50μL均匀分散的MSN/K3[Fe(CN)6]-APT-RGO分散液，向其中加入5μL不同浓度的ATZ溶液，再加入5mL的Tris-HCl(100mmol/L，pH＝7.4)缓冲溶液，混合均匀后放置在30℃生化培养箱中孵育过夜。以带正电的ITO传感电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极建立三电极体系，测定DPV曲线，其扫描范围为0.6～-0.2V。从结果可以看出，在一定的ATZ浓度范围内，随着ATZ浓度的增加，[Fe(CN)6]3-的还原峰强度也随之增加，这是由于溶液中的ATZ分子被“分子门”上的核酸适配体特异性识别并捕获，进而从MSN表面脱离下来，孔道内的[Fe(CN)6]3-扩散到带正电的ITO电极表面产生DPV响应信号，同时一起脱离下来的RGO也因其良好的电子传输能力而显著增强了电化学信号强度。随着ATZ浓度的增加，[Fe(CN)6]3-和RGO的释放量增大，因此DPV还原峰强度逐渐增大。根据峰的强度与体系中ATZ浓度的对数关系绘制工作曲线，即可对ATZ进行定量检测。传感器对ATZ的检测限低至1.0pM，线性检测范围为3.0pM-1.0nM。
实施例3：
采用实施例1制备的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器进行选择性能检测。
将实施例2孵育体系中加入的5μL不同浓度的ATZ溶液换成5μL一定浓度的ATZ和100倍浓度的干扰物混合溶液，在相同条件下进行DPV测定，研究[Fe(CN)6]3-的响应信号强度变化，考察传感器的选择性能。结果表明，在其他干扰物共存条件下进行红外光谱测定时，DPV还原峰的强度没有明显变化，干扰因子均小于20％，体现了传感器良好的选择性。
实施例4：
采用实施例1制备的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器进行稳定性检测。
由于环境中实际水样中所含物质往往比较复杂，除了共存污染物外，可能含有其他高浓度的离子，使得水样多呈现出酸性或碱性，因此探究传感体系在该条件下的检测性能具有十分重要的意义。将实施例2中的Tris-HCl(100mmol/L，pH＝7.4)缓冲溶液换成不同pH或不同盐离子浓度的Tris-HCl溶液，在相同条件下进行DPV测定，研究[Fe(CN)6]3-的响应信号强度变化，考察传感器在极端检测环境中的适用性。结果表明，在pH＝3～11范围内测得DPV信号的保持率均在90％以上，且当Na+浓度为0～4.0mol/L时，信号保持率仍达到93％以上，因此所构筑的基于信号探针封装释放的非固定型传感器在一定范围的强酸、强碱或高盐等极端条件下具有良好的稳定性与适应性。
实施例5：
采用实施例1制备的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器进行实际水样中ATZ的检测。
为了进一步证实传感器的实际应用能力，将传感器用于实际水样中ATZ的检测。选取同济大学三好坞池塘的水样作为实际水样，采用同样方法测量DPV曲线，通过加标回收的方法检测水样中的ATZ含量，根据阿特拉津的标准工作曲线得到实际水样中的ATZ浓度。所测样品中ATZ的加标回收率保持在102.00％～104.63％范围内，且相对标准偏差RSD均小于5％，结果表明所构筑的非固定型适配体传感器在实际样品测定中具有良好的应用潜力。
实施例6：
本实施例基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法是采用模板法制备介孔二氧化硅纳米颗粒，通过轻摇过程将K3[Fe(CN)6]信号分子封装进MSN孔道，并通过APTES处理使其表面带有一定的正电荷。进一步引入适配体和RGO后，通过静电作用在MSN表面形成双重“分子门”，从而得到MSN封装控释元件。
其中，MSN的封装控释元件的制备过程包括以下步骤：
步骤(1)：制备MSN纳米颗粒：称取0.5g CTAB，并溶解在250mL超纯水中，随后加热至90℃，并加入3.5mL NaOH溶液(2M)以调节pH。在连续搅拌下，缓慢滴加2.5mL TEOS，继续加热搅拌3h，用超纯水和乙醇将生成的沉淀各清洗3遍，放在60℃真空烘箱中干燥，随后煅烧处理即制得MSN。
步骤(2)：MSN孔道中封装K3[Fe(CN)6]信号分子：称取100mg MSN样品，超声分散到2mL无水乙醇中，加入2mL的K3[Fe(CN)6]溶液，将混合液轻摇12h，使K3[Fe(CN)6]进入MSN的孔道当中。
步骤(3)：MSN表面氨基化处理：向K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液中加入0.8mLAPTES，搅拌6h。将分散液用乙醇和超纯水各清洗3次，并重新分散到2.0mL的Tris-HCl缓冲溶液中，得到带正电的MSN-NH2。
步骤(4)：构建APT-RGO双重“分子门”。
步骤(4-1)：配制适配体溶液；
步骤(4-2)：取200μL适配体溶液与1.0mL MSN-NH2分散液混合，在室温下搅拌孵育5h，获得MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液。
步骤(4-3)：向MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液中加入300μL RGO溶液(0.25mg·mL-1)，混合均匀后放在摇床上轻摇5h，离心洗涤并重新分散在1.0mL的Tris-HCl缓冲溶液中，获得APT-RGO双重“分子门”封堵的MSN/K3[Fe(CN)6]-APT-RGO分散液。
步骤(1)中煅烧处理的工艺条件为：以5℃/min的升温速率升温至550℃，恒温煅烧5h，随后冷却至室温即可。
步骤(2)中K3[Fe(CN)6]的浓度为0.5mol/L。
步骤(4-1)中适配体溶液的配制方法为：将1OD的ATZ适配体在5000r/min条件下离心3min，之后加入高纯水，使核酸适配体的浓度为10μmol/L。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括表面带正电的ITO传感电极的制备及MSN封装控释元件的制备；
所述的表面带正电的ITO传感电极的制备方法为：将预处理后的ITO玻璃放入至APTES溶液中浸泡5-6h，制得表面带正电的ITO传感电极；
所述的MSN封装控释元件的制备方法包括以下步骤：
1)采用模板法制备MSN；
2)通过摇动扩散过程将K3[Fe(CN)6]信号分子封装到MSN的孔道中，得到K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液；
3)利用APTES对步骤2)中的K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液进行处理，使MSN表面带正电荷，得到MSN-NH2分散液；
4)通过静电作用将适配体和还原氧化石墨烯结合在步骤3)中的MSN-NH2表面上，制得MSN封装控释元件；
所述的APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述的MSN为介孔二氧化硅纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的ITO玻璃的预处理过程为：将切割后的ITO玻璃依次放入NaOH溶液、丙酮、乙醇和水中，分别超声清洗10-15min，之后置于空气气氛中干燥。
3.根据权利要求1所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的MSN的制备过程为：将CTAB溶于水中，之后加热至80-90℃，并依次加入NaOH溶液、TEOS，之后继续搅拌2.5-3.5h，经洗涤、干燥、煅烧后，即制得所述的MSN；
所述的CTAB为十六烷基溴化铵，所述的TEOS为正硅酸乙酯；
煅烧过程中，温度为500-550℃，煅烧时间为5-6h。
4.根据权利要求1所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将制得的MSN超声分散到无水乙醇中，之后加入K3[Fe(CN)6]溶液，得到混合液，将混合液轻摇10-12h，使K3[Fe(CN)6]进入MSN的孔道中，得到K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液。
5.根据权利要求1所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：向K3[Fe(CN)6]封装后的MSN分散液中加入APTES，并搅拌6-7h，得到带正电的MSN-NH2，经洗涤后重新分散到Tris-HCl缓冲溶液中，得到MSN-NH2分散液。
6.根据权利要求1所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：将适配体溶液与MSN-NH2分散液混合，并在室温下搅拌孵育4-5h，使带负电的适配体通过静电作用吸附在MSN-NH2表面，得到MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液，之后向MSN/K3[Fe(CN)6]-APT分散液中加入RGO溶液，混合均匀后轻摇5-6h，经洗涤后重新分散到Tris-HCl缓冲溶液中，得到MSN/K3[Fe(CN)6]-APT-RGO分散液，即为含有MSN封装控释元件的分散液。
7.根据权利要求6所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的RGO溶液的制备方法为：将氧化石墨烯配成0.20-0.25mg·mL-1的水溶液，并转移至聚四氟乙烯内胆的高压反应釜中，于175-185℃下反应5.5-6.5h，即得到RGO溶液。
8.基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器，其特征在于，该传感器采用如权利要求1至7任一项所述的方法制备而成，所述的传感器包括表面带正电的ITO传感电极及MSN封装控释元件。
9.如权利要求8所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的应用，其特征在于，所述的传感器用于对水环境中的农药进行检测。
10.根据权利要求9所述的基于信号探针封装释放的非固定型电化学传感器的应用，其特征在于，检测过程为：向含有MSN封装控释元件的分散液中加入待检测水溶液和Tris-HCl缓冲溶液，混合均匀后放置在25-30℃的生化培养箱中孵育过夜，得到样品溶液，之后以表面带正电的ITO传感电极作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，建立三电极体系，测定样品溶液的DPV曲线，根据DPV氧化峰强度与靶标物农药浓度的对应关系，得到水环境中的靶标物农药浓度。
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