CN107389665B - 一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法 - Google Patents

一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法，将巯基化玉米赤霉烯酮适配体DNA1和巯基化适配体的互补链DNA2分别与13±2nm纳米金连接形成适配体‑纳米金探针和互补链‑纳米金探针，通过竞争法进行玉米赤霉烯酮的可视化检测。当待测物中含有靶标时，靶标与适配体结合，使适配体‑纳米金探针和互补链‑纳米金探针呈游离状态，在高盐浓度下，纳米金容易发生聚集，颜色由红色变成蓝色；当待测物中不含靶标时，适配体与其互补链碱基互补配对结合，使适配体‑纳米金探针和互补链‑纳米金探针呈稳定的网络结构，在高盐浓度下，纳米金不发生聚集，颜色仍为红色。随着靶标浓度的增大，纳米金颜色由红色逐渐变为蓝色，通过测定溶液在200～800nm的紫外‑可见光谱，即可实现对待测物中玉米赤霉烯酮的定量检测。

Description

一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法
技术领域
一种基于纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法，涉及纳米材料和分子生物学领域，用于食品安全的检测。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)又称为F2毒素，是一种非甾体类雌激素样活性的真菌毒素，其分子式为C18H22O5，白色晶体，是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构，不溶于水、二硫化碳和四氧化碳，易溶于甲醇、乙醇、乙醚及苯等有机溶剂。ZEN是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物，其主要衍生物为α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇。
ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大米、小米和燕麦等谷物及其制品，具有较强的生殖毒性、免疫毒性、肝毒性和致畸作用，食用被ZEN污染的食物可引起中枢神经系统中毒，出现恶心、发冷、头痛、升至抑郁和共济失调等症状，妊娠期的动物(包括人)食用，还会引起流产、死胎和畸胎，对我们人类和畜牧业的发展带来巨大危害。因此，我国对食品、谷物饲料中ZEN含量都有严格的标准，我国GB5009.209-2016规定粮食和粮食制品中ZEN的检出限为5μg/kg，酒类中ZEN的检出限为20μg/kg，酱油、醋、酱及酱制品中ZEN的检出限为50μg/kg，大豆、油菜籽、食用植物油中ZEN的检出限为10μg/kg。GB13078.2-2006规定饲料和玉米中ZEN的允许量为500μg/kg。
目前，用于检测食品和饲料中ZEN含量的方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)和酶联免疫法(ELISA)，这些方法各有其优缺点，如操作复杂、需要昂贵的仪器和专业的操作人员、稳定性差等问题，不适用于现场快速检测。因此，发明一种操作简单、成本低、特异性强、灵敏度高、检测时间短的玉米赤霉烯酮检测方法具有重要的意义。纳米金具有非常独特的光学特性，当金纳米颗粒间的距离拉近时，会引起纳米金颜色的变化。核酸适配体是通过指数富集系统进化技术从体外筛选得到的，能与相应靶物质特异性结合的一类单链寡核苷酸序列。与抗体相比，适配体具有易人工合成和修饰，靶物质范围广，稳定性好，分子量小和易保存等优点。本发明利用纳米金的光学特性和适配体的高特异性、灵敏性，对玉米赤霉烯酮的检测限为0.1ng/ml,在0.1～1000ng/ml范围内线性良好(R2＝0.99617)，检测可在1h内完成，实现玉米赤霉烯酮的快速可视化检测。
发明内容：
本发明的目的是提供一种灵敏度高的基于适配体修饰纳米金形成探针捕获玉米赤霉烯酮，结合纳米金的光学特性进行比色的快速检测玉米赤霉烯酮的可视化方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法，将巯基化玉米赤霉烯酮适配体DNA1和巯基化适配体的互补链DNA2分别与13±2nm纳米金连接形成适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针，通过竞争法进行玉米赤霉烯酮的可视化检测。当待测物中含有靶标时，靶标与适配体结合，使适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针呈游离状态，在高盐浓度下，纳米金容易发生聚集，颜色由红色变成蓝色；当待测物中不含靶标时，适配体与其互补链碱基互补配对结合，使适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针呈稳定的网络结构，在高盐浓度下，纳米金不发生聚集，颜色仍为红色。随着靶标浓度的增大，纳米金颜色由红色逐渐变为蓝色，通过测定溶液在200～800nm的紫外-可见光谱，即可实现对待测物中玉米赤霉烯酮的定量检测。
具体地，所述的DNA1序列为5'SH-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG-3'，所述的DNA2序列为5'SH-AGTAGATAGATACCATGTAATGATAGACATTACACTATAC-3'。
具体地，所述的纳米金的制备方法步骤如下：
(1)所用容器用王水浸泡约8h，然后用超纯水清洗浸泡好的容器并烘干；
(2)在烘干后的容器中加入体积比为100:1的超纯水和1％氯金酸溶液，在油浴锅中边搅拌边加热至沸腾，10min后加入1％柠檬酸钠(含0.05％柠檬酸)，柠檬酸钠与氯金酸的体积比为4:1，继续加热10～15min至溶液变成清亮透明的酒红色；
(3)停止加热，继续搅拌15～20min，再冷却至室温，即得到粒径为13±2nm的纳米金颗粒。
具体地，所述的超纯水的电阻率大于等于18.2MΩ.cm。
具体地，所述的适配体-纳米金探针制备方法步骤如下：
(1)将巯基化适配体DNA1与TCEP混合活化，适配体与TCEP的摩尔质量比为1:100；
(2)将所述的纳米金在4℃，12000rpm/min的条件先离心30min，吸出一半体积上清液，再振荡重悬；
(3)将活化后的DNA1加入上述的纳米金溶液中，适配体DNA1与纳米金的摩尔质量比为100:1，在37℃150rpm/min条件下摇床孵育12～16h，形成DNA1-纳米金探针；
(4)将十二烷基硫酸钠(SDS)加入上述DNA1-纳米金探针中，SDS的终浓度约为0.01％；
(5)在12h内分多次加入0.5mol/L的NaCl溶液，使NaCl的终浓度达到20～30mmol/L，每次加入NaCl前先超声10～15s，加入后振荡混合；
(6)将经步骤(5)处理后的DNA1-纳米金探针在37℃150rpm/min摇床条件下陈化12h；
(7)将陈化后的DNA1-纳米金探针在4℃8000rpm/min条件下离心20min，吸出上清液，再加入等量的10mM PBS缓冲液重悬，如此重复离心洗涤2次，以去除未与纳米金结合的DNA1，即得到所述的适配体-纳米金探针。
具体地，所述的10mM PBS缓冲液的配方为10mmol/L Na2HPO4、2mmol/L KH2PO4，pH值为7.4.
具体地，所述的互补链-纳米金探针的制备方法步骤如下：
(1)将巯基化互补链DNA2与TCEP混合活化，互补链与TCEP的摩尔质量比为1:100；
(2)将所述的纳米金在4℃，12000rpm/min的条件先离心30min，吸出一半体积上清液，再振荡重悬；
(3)将活化后的DNA2加入上述的纳米金溶液中，互补链DNA2与纳米金的摩尔质量比为100:1，在37℃150rpm/min条件下摇床孵育12～16h，形成DNA2-纳米金探针；
(4)将十二烷基硫酸钠(SDS)加入上述DNA2-纳米金探针中，SDS的终浓度约为0.01％；
(5)在12h内分多次加入0.5mol/L的NaCl溶液，使NaCl的终浓度达到20～30mmol/L，每次加入NaCl前先超声10～15s，加入后振荡混合；
(6)将经步骤(5)处理后的DNA2-纳米金探针在37℃150rpm/min摇床条件下陈化12h；
(7)将陈化后的DNA2-纳米金探针在4℃8000rpm/min条件下离心20min，吸出上清液，再加入等量的10mM PBS缓冲液重悬，如此重复离心洗涤2次，以去除未与纳米金结合的DNA2，即得到所述的互补链-纳米金探针。
具体地，所述的10mM PBS缓冲液的配方为10mmol/L Na2HPO4、2mmol/L KH2PO4，pH值为7.4.
具体地，所述的适配体-纳米金探针、互补链-纳米金探针、待测物的体积比为1:1:1，95℃水浴5min后37℃孵育50min.
具体地，适配体-纳米金探针、互补链-纳米金探针、待测物混合后加入一定浓度NaCl，NaCl浓度为50～70mmol/L。
检测原理：DNA1与DNA2是完全互补配对的碱基序列，DNA1能够识别并捕获靶物质玉米赤霉烯酮，互补链DNA2和玉米赤霉烯酮竞争与适配体DNA1结合。当待测物中含有玉米赤霉烯酮时，DNA1与玉米赤霉烯酮结合，纳米金呈现游离的状态，在一定的盐浓度下，纳米金表面的负电荷被屏蔽，纳米颗粒间的排斥力减弱，发生聚集现象，由于纳米金的颜色具有光距离依赖特性，因此纳米金的颜色发生变化，待测物中玉米赤霉烯酮的浓度不同，纳米金聚集的程度也不同，从而导致纳米金溶液的颜色也不同；当待测物中没有玉米赤霉烯酮时，DNA1与DNA2互补杂交，形成稳定的网络结构，在一定的盐浓度下，纳米金粒子间的距离没有被拉近，因此纳米金溶液的颜色没有发生变化，根据纳米金溶液颜色的变化实现玉米赤霉烯酮的可视化检测。
本发明的优点是：
(1)利用适配体对被检测物质进行特异性捕获，有效提高了检测的稳定性和准确性。
(2)与抗体相比，适配体具有可人工合成，不需要动物或细胞的培养，便于化学修饰，合成周期短、成本低，稳定性好，批次间差异小，可长期保存等优点。
(3)玉米赤霉烯酮为小分子物质，与适配体的结合位点少，因此通过互补链、靶标与适配体结合的竞争关系，改变纳米颗粒间的距离，使纳米金颜色发生变化，肉眼可区别，不需要复杂仪器进行检测，便于现场实时检测。
(4)适配体-探针和互补链-纳米金探针易于制备和保存，减少检测时间，实现玉米赤霉烯酮的快速可视化检测。
附图说明
图1：一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的检测原理图
图2：纳米金的透射电镜图
图3：纳米金和适配体DNA1、互补链DNA2修饰纳米金的紫外-可见吸收图谱
图4：玉米赤霉烯酮检测标准曲线图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，此外，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
实施例1：
1.合成巯基修饰的适配体DNA1和与适配体互补配对的互补链DNA2(购自上海生工生物工程股份有限公司)
适配体DNA1：5'SH-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG-3'；
互补链DNA2：5'SH-AGTAGATAGATACCATGTAATGATAGACATTACACTATAC-3'；
2.制备纳米金
(1)所使用的容器用王水(体积比为3:1的浓盐酸和浓硝酸)浸泡12h，再用超纯水清洗干净，烘干；
(2)在容器中加入50mL超纯水(电阻率≥18.2MΩ)和0.5mL 1％氯金酸溶液，用转子搅拌均匀，煮沸10min，加入2mL 1％柠檬酸钠(含0.05％柠檬酸)，溶液逐渐变为紫红色，继续加热10min；
(3)停止加热，继续搅拌20min，在室温下冷却，得到酒红色的纳米金溶液，通过紫外-可见吸收图谱和透射电子显微镜对所制备的纳米金溶液进行表征，表征图谱见图1和图2.
3.制备适配体-纳米金探针
(1)取40μL 10μmol/L的适配DNA1于1.5mL离心管中，加入40μL 1mmol/L TCEP和40μL 10mmol/L PBS(pH＝7.4)，混合活化1h；
(2)取2mL纳米金置于2mL离心管中，4℃12000rpm/min离心30min，吸出1mL上清液，再振荡重悬，得到浓缩2倍的纳米金溶液；
(3)将活化好的适配体加入到浓缩2倍的纳米金溶液中，37℃摇床孵育12h；
(4)将11.2μL 1％SDS加入到适配体-纳米金探针中，使SDS浓度达0.01％；
(5)在12h内分6次加入68.4μL0.5mol/LNaCl溶液，每次加入11.4μL，使NaCl终浓度达30mmol/L，每次加入NaCl前先超声10s，加入后振荡混合，在37℃150rpm/min摇床条件下陈化12h；
(6)陈化后的适配体-纳米金探针在4℃8000rpm/min离心20min，吸出上清液，再加入等量的10mmol/L PBS(pH＝7.4)缓冲液重悬，如此重复离心洗涤2次，以去除未与纳米金结合的适配体，得到的适配体-纳米金探针保存在4℃条件下备用。
4.互补链-纳米金探针的制备方法和适配体-纳米金探针的制备方法相同
5.玉米赤霉烯酮的检测
取100μL制备好的适配体-纳米金探针、100μL互补链-纳米金探针、100μL不同浓度的玉米赤霉烯酮溶液和50μLBB缓冲液，置于1.5mL离心管中混匀，95℃热处理5min，然后置于37℃摇床中孵育50min，随后加入10.5μL 2mol/LNaCl溶液，使NaCl终浓度达到60mmol/L；观察溶液颜色变化，并在200～800nm进行UV-vis扫描。根据A650/A525的值和玉米赤霉烯酮的浓度绘制玉米赤霉烯酮的标准曲线，参见图4.
实施例2：啤酒实际样品中玉米赤霉烯酮的检测及加标回收率检测
1.检测样品预处理：将啤酒样品置于4℃冰箱冷藏30min后超声30min直至完全脱气，取20.0g于50ml容量瓶中，用70％甲醇定容至刻度，摇匀，移取10.0ml溶液并加入40ml水稀释混匀，经0.22μm滤膜过滤至滤液澄清，滤液备用。
2.利用本发明方法测定样品中玉米赤霉烯酮的含量，实验步骤同实施例1，结果见表一。
3.以步骤2得到的玉米赤霉烯酮浓度数据为本底值，向其中加入不同浓度的ZEN标准品，同样利用本发明方法再次检测玉米赤霉烯酮含量，得到检测值。回收率％＝(检测值-本底值)/添加量×100％。从表一数据可以看到回收率在92.4％～111.3％，说明本发明稳定，灵敏，准确，适用于啤酒实际样品的检测。
表一：啤酒实际样品中玉米赤霉烯酮的检测及加标回收率
啤酒加标样品 背景浓度(ng/ml) 添加浓度(ng/ml) 测定值(ng/ml) 回收率％
1 ND 0.1 0.096 96
2 ND 1 0.924 92.4
3 ND 10 11.12 111.2
注：ND为未检出。
序列表
〈110〉 江南大学
〈120〉 一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法
〈130〉
〈160〉 1
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 1
tcatctatctatggtacattactatctgtaatgtgatatg 40
〈210〉 2
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 2
agtagatagataccatgtaatgatagacattacactatac 40

Claims (1)

1.一种基于适配体修饰纳米金比色检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：将巯基化玉米赤霉烯酮适配体DNA1和巯基化适配体的互补链DNA2分别与13±2 nm纳米金连接形成适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针，通过竞争法进行玉米赤霉烯酮的可视化检测；当待测物中含有靶标时，靶标与适配体结合，使适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针呈游离状态，在高盐浓度下，纳米金容易发生聚集，颜色由红色变成蓝色；当待测物中不含靶标时，适配体与其互补链碱基互补配对结合，使适配体-纳米金探针和互补链-纳米金探针呈稳定的网络结构，在高盐浓度下，纳米金不发生聚集，颜色仍为红色；随着靶标浓度的增大，纳米金颜色由红色逐渐变为蓝色，通过测定溶液在200～800 nm的紫外-可见光谱，即可实现对待测物中玉米赤霉烯酮的定量检测；
所述巯基化适配体的互补链DNA2的序列为5'SH-AGTAGATAGATACCATGTAATGATAGACATTACACTATAC-3'；
所述巯基化玉米赤霉烯酮适配体DNA1与纳米金偶联形成识别捕获探针，巯基化玉米赤霉烯酮适配体的互补链DNA2与纳米金偶联形成信号探针，适配体-纳米金探针与互补链-纳米金探针的体积比为1:1；
所述适配体-纳米金探针、互补链-纳米金探针、待测物混合后加入一定浓度NaCl，NaCl浓度为50～70 mmol/L。
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