CN113549712A - 基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法 - Google Patents

基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法，所述试剂盒包括正向引物，和纳米银针SERS基底，所述纳米银针SERS基底由5’端有巯基修饰的反向引物和纳米银针共价连接而得。其检测方法为：先采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号；在包含待检测样品的反应溶液中插入所述纳米银针SERS基底，恒温扩增；取出纳米银针SERS基底，采集拉曼光谱信号，检测两次拉曼光谱信号的位移差异。相比起根据拉曼峰强度定量检测核酸的方法，本发明的新型冠状病毒核酸检测方法可以实现定性检测核酸，检测方法更简单、更准确、更可靠。

Description

基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于拉曼光谱对新型冠状病毒核酸进行检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
核酸是生命最基本的遗传物质，开展核酸分子诊断对促进人类健康医疗的发展具有重要意义。表面增强拉曼光谱（SERS）是对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，是一种快速无损检测技术，具有制样简单、水的干扰小、非侵入、实时检测等优点，在核酸检测、病原微生物检测、肿瘤精准分子诊断等领域展现出良好的应用潜力。
目前已有许多科研小组开展了基于SERS技术的核酸检测研究，如采用拉曼分子和寡核苷酸探针链修饰金纳米颗粒构建SERS探针，在基片表面修饰链与目标链和SERS探针杂交形成三明治检测结构进行DNA检测[ Y.W.C. Cao, R.C. Jin, C.A. Mirkin,Nanoparticles with raman spectroscopic fingerprints for DNA and rnadetection, Science 297 (2002) 1536-1540]；又如以银纳米颗粒为核酸标记探针拉曼分子并包裹二氧化硅壳(Ag nanorice@MGITC@SiO2)作为SERS探针，利用光刻技术在硅圆片上形成三角状金纳米膜作为SERS活性检测基底，实现了乙型肝炎病毒检测[ Y. Liu, P.Y.Wu, Meditating metal coenhanced fluorescence and sers around goldnanoaggregates in nanosphere as bifunctional biosensor for multiple DNAtargets, Acs Appl. Mater. Interface 5 (2013) 5832-5844.]；Cui小组以银纳米棱镜作为基底，以4-MBA拉曼活性分子作为标记、探针寡核苷酸修饰的金纳米颗粒作为SERS探针，在水溶液中直接进行DNA检测[ M. Li, S.K. Cushing, H.Y. Liang, S. Suri, D.L.Ma, N.Q. Wu, Plasmonic nanorice antenna on triangle nanoarray for surface-enhanced raman scattering detection of hepatitis b virus DNA, Anal. Chem. 85(2013) 2072-2078]；Mirkin小组采用固态金属膜SERS基片构建检测多元基底，分别制作标记不同的拉曼探针分子、与目标检测物互补的探针链结合的SERS探针，开展多种病原检测[ R.C. Jin, Y.C. Cao, C.S. Thaxton, C.A. Mirkin, Glass-bead-based paralleldetection of DNA using composite raman labels, Small 2 (2006) 375-380]。随着SERS研究的深入及多学科领域的交叉发展，SERS技术有望广泛应用于核酸检测以及整个生物医学检测领域，为生命科学提供一种强大的分析技术。
2020年新型冠状病毒（2019-nCoV或SARS-CoV-2）在世界范围内疫情爆发，从政府端、医院临床端、产业端到普通百姓，对于病原微生物感染的认知和重视都达到前所未有的高度，不管对新型冠状病毒的临床检测还是进行实验室研究，如何快速、高效的检测新型冠状病毒核酸成为重中之重。
传统的聚合酶链式反应检测，由于需要复杂的核酸提取步骤、精确的升降温设备和专业的操作，限制了其在基层一线检测现场的普及，有待进一步提高检测的及时性。迫切需要研发检测更方便、更快捷的核酸检测试剂盒及检测方法。
现场检测是SERS发展的一个重要方向，目前已经有多种便携式仪器，也有与之相匹配的高灵敏便携式SERS基底，可以将拉曼光谱信号放大一百万倍，因此，可考虑利用SERS基底进行新冠肺炎病毒的核酸检测。
传统基于SERS的核酸检测方法，虽然不同论文采取的策略不同，但比较一致的就是利用拉曼峰强度差异来定量检测，判断阴性和阳性。2016年的Nanoscale中的一篇论文（Nanoscale, 2016, 8, 17365–17373）中公开了一种基于SERS的核酸检测方法，其是通过在SERS基底上面修饰发卡结构，一端通过-SH连在SERS基底上，一端修饰拉曼报告分子，由于发卡结构，报告分子比较靠近于SERS基底，因此有较强的SERS信号。当特征序列过来，发卡结构打开，报告分子远离SERS基底，因此SERS信号减弱，故可通过SERS信号的强弱变化来判断目标序列以及其浓度。但是由于修饰探针的浓度影响，SERS信号没有具体的数值。
这种基于SERS的核酸检测方法，需要满足以下几个条件：
1、因为是通过信号强度来判断阴性和阳性，所以SERS基底需要有很好的均一性（即不同激光光斑下的SERS强度比较一致），然而SERS基底主要增强来自于2~10纳米的间隙（也称作“hot spots”），Science上也有论文报道SERS信号的80%来自于极少数 hot spots的贡献（Science, 321 (2008) 388-392），但是，现在的控制工艺很难控制到10纳米以下的结构，因此真正意义上超高均一性的SERS基底比较难以实现，这也是为什么行业将强度的重复性的范围定义在20%的原因之一（ACS Nano 2020, 14, 28−117）。
2、即使构筑了十分均一的SERS基底，分子的修饰分布也会影响SERS信号的均一性。由于这个策略里面是利用发卡结构的变化来区别阴性和阳性的样本，从原理来看，信号减弱不明显，当目标核酸的量很小时，难度将变得更大。
3、SERS的强度影响因素。SERS是分子吸附在贵金属的粗糙纳米级表面，在合适激光激发下，使得拉曼光谱增强百万倍的现象。即使排除激光和SERS基底均一性的影响，分子在检测过程中可能会有热运动，分解或者其他变化。
此外，本发明的发明人最近的研究表明，分子的取向(即分子以什么角度吸附在SERS基底上面，J. Phys. Chem. Lett., 2019, 10(10), 2306-2312.)对SERS的信号强度影响极大。
因此，利用拉曼峰强度差异来定量检测核酸的方法准确度和可靠度都不够，基于SERS强度变化的定量研究一直是本领域难以攻克的技术难题。
发明内容
基于此，本发明提供了一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，该试剂盒可以用于对新型冠状病毒核酸进行定性检测，方便快捷准确。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括：
(1)、正向引物；
(2)、纳米银针SERS基底，所述纳米银针SERS基底是由5’端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得。
在其中一些实施例中，所述纳米银针是通过电化学工艺制备而成，包括以下步骤：先将银针依次在乙醇、丙酮和水中超声清洗；再将银针置于1M±0.1M硝酸中进行电化学处理，即得；所述电化学处理包括5个~10个周期，每个周期的操作方法为：将银针置于阳极电流持续8秒~10秒，再置于阴极电流持续8秒~10秒。
在其中一些实施例中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一些实施例中，所述正向引物的5’端有FAM修饰。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括溶解剂、RT-基础扩增检测试剂和激活剂。
本发明还提供了一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测的方法，使用上述检测试剂盒，可以实现基于检测拉曼光谱信号的位移差异来对新型冠状病毒核酸进行定性检测。
实现上述发明目的的具体技术方案如下：
一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测的方法，使用上述新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行检测，获取非诊断目的的拉曼光谱信号的位移差异，包括以下步骤：
(1)、采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号，所述纳米银针SERS基底是由5’端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得；
(2)、将步骤(1)的纳米银针SERS基底插入包含待检测样品的反应溶液中，进行恒温扩增；
(3)、恒温扩增反应结束后，取出纳米银针SERS基底，采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号，并与步骤(1)采集的拉曼光谱信号进行比较，检测拉曼光谱信号的位移差异。
在其中一些实施例中，步骤(3)中检测所述拉曼光谱信号的位移差异＞4 cm-1还是≤4cm-1。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述纳米银针SERS基底的制备方法，包括以下步骤：
(a)、将5’端有巯基修饰的反向引物与三(2-羧乙基)膦混合，室温25min~35min进行还原；
(b)、将还原后的反向引物于60℃~70℃孵育8min~12min，马上置冰盒上冷却，冷却后平衡到室温；
(c)、在反向引物中插入纳米银针，室温反应25min~35min，使反向引物共价连接于纳米银针上，即得。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述恒温扩增为：38℃~44℃恒温反应20min~30min。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述包含待检测样品的反应溶液的制备方法，包括以下步骤：
(a)、将15μl~25μl溶解剂、2.0μl~3.0μl正向引物、24.5μl~26.5μl待检测样品充分震荡混匀，离心，得到反应预混液；
(b)、将反应预混液加入至RT-基础扩增检测试剂中，充分震荡混匀，至RT-基础扩增检测试剂彻底溶解；
(c)、再加入1.5μl~2.5μl激活剂，充分震荡混匀，离心，得到总体积为50μl的包含待检测样品的反应溶液。
本发明使用新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行新型冠状病毒核酸检测的方法是基于拉曼技术与分子富集技术相结合而实现的。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒包括针对新型冠状病毒核酸设计的特异性恒温扩增的正反向引物，具有拉曼增强效果的纳米银针SERS基底(带有巯基修饰的反向引物与纳米银针进行共价结合而得)，其中纳米银针SERS基底中所使用的纳米银针是通过电化学工艺制备而成，不会出现纳米颗粒团聚现象，使得拉曼光谱信号得以更好地聚焦，具有较好的信号稳定性，再配合特定的针对新型冠状病毒的特异性引物，从而可以实现新型冠状病毒核酸的快速便捷检测。
2、本发明使用新型冠状病毒核酸检测试剂盒对新型冠状病毒核酸进行检测的方法，其首先采集作为恒温扩增的载体的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号；然后将纳米银针SERS基底插入包含待检测样本的溶液中进行恒温扩增，阳性样本经恒温扩增反应后，会在纳米银针SERS基底表面进行富集，而阴性样本经恒温扩增反应后，不会在纳米银针SERS基底表面富集，因此，经便携式拉曼光谱仪进行检测后，采集拉曼光谱信号；计算两次拉曼光谱信号的位移差异＞预设标准4 cm-1还是≤预设标准4cm-1，可以实现阴阳性样本的快速区分。
3、相比起根据拉曼峰的强度对核酸进行定量检测的方案，本发明的方法是一种定性检测方案，通过检测拉曼光谱信号的位移差异解决了利用SERS强度获取信息带来的一些挑战，因此，本发明的检测方法更简单、更准确、更可靠。
附图说明
图1为本发明实施例1中基于拉曼光谱信号位移差异进行核酸检测的方法的原理图。
图2为本发明采用电化学工艺制备的纳米银针的表面结构图。
图3为本发明实施例1中纳米银针SERS基底与待检测样品进行反应的示意图。
图4为本发明实施例1中应用拉曼光谱仪对纳米银针SERS基底进行检测的结果；其中，A：没有与反向引物共价连接的纳米银针(空白纳米银针)的拉曼光谱信号图谱；B：纳米银针SERS基底(共价连接有反向引物)的拉曼光谱信号图谱；C：检测阴性待测物(即不含有新型冠状病毒核酸的样本)的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号图谱；D：检测阳性待测物(即新型冠状病毒全长核酸标准品)的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号图谱。
图5为本发明实施例2中应用拉曼光谱仪对纳米银针SERS基底进行检测的结果；其中，a：空白纳米银针的拉曼光谱信号图谱，纳米银针SERS基底(共价连接有反向引物)的拉曼光谱信号图谱，检测阴性样本1(即不含有新型冠状病毒的核酸样本)的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号图谱，检测阳性样本1(即新型冠状病毒全长核酸标准品)的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号图谱；b：检测阴性样本2和3、阳性样本2和3的纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号图谱；c：三个批次实验的拉曼强度分析； d: 三个批次实验的拉曼光谱信号位移分析。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1 一种基于拉曼光谱的新型冠状肺炎病毒核酸检测的试剂盒及检测方法
本实施例的一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测的试剂盒，包括：
(1)、正向引物；
引物序列如SEQ ID No.1所示：
正向引物：5'-FAM-TACATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATG(SEQ ID No.1)
在正向引物5’端进行FAM修饰，作为拉曼报告活性分子。
(2)、纳米银针SERS基底；
由5’端有巯基修饰的反向引物和电化学工艺制备的纳米银针共价连接而得；反向引物序列如SEQ ID No.2所示。
反向引物：5'-SHC6-CCAAGCTATAACGCAGCCTGTAAAATCA(SEQ ID No.2)。
(3)、溶解剂DA
(4)、RT-基础扩增试剂(干粉状)
(5)、激活剂MC
(6)、便携式拉曼光谱仪。
以上试剂(3)-(5)来自RT-基础型核酸扩增试剂盒(ERA法，苏州先达基因科技有限公司)。
请参考图1，为本发明中基于拉曼光谱信号位移进行核酸检测的方法的原理图。利用本实施例的新型冠状病毒核酸检测的试剂盒，基于拉曼光谱信号位移差异，对新冠肺炎病毒进行核酸检测，包括以下步骤：
1、特异性引物设计
引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
正向引物：5'-FAM-TACATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATG(SEQ ID No.1)
反向引物：5'-SHC6-CCAAGCTATAACGCAGCCTGTAAAATCA(SEQ ID No.2)。
其中，在正向引物5’端进行FAM修饰，作为拉曼报告活性分子；在反向引物5’端进行巯基修饰，用于步骤2中与纳米银针共价连接。
2、反向引物与纳米银针共价连接，得到纳米银针SERS基底
(1)、将200μL的50μM的5’端有巯基修饰的反向引物与5μL的1M的三(2-羧乙基)膦混合，室温下进行30 min还原；
(2)、将还原的反向引物置65℃孵育10min变性，马上置冰盒上冷却，冷却后平衡到室温；
(3)、在反向引物中插入纳米银针，室温下反应30min，使寡核苷酸通过Ag-S键共价连接于纳米银针上，得到纳米银针SERS基底，采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号。
步骤(3)中所述纳米银针采用电化学工艺制备而得，具体的制备方法，包括以下步骤：以针灸银针为原料，先在乙醇、丙酮和水中各超声10分钟去除表面污染物。再将清洁的针灸银针置于申请人实验室自制的电化学反应池中（电化学反应池中装有1M的硝酸）进行批量电化学处理，即可得到表面具有银纳米阵列结构的银针，且优势取向为面心立方Ag。所述电化学处理包括5个周期，每个周期的操作方法为：将针灸银针置于阳极电流持续8秒~10秒，再置于阴极电流持续8秒~10秒。本发明电化学工艺制备的纳米银针的表面结构，如图2所示。对纳米银针的检测区域进行放大，可以看出，通过电化学工艺处理后的区域，银针表面呈现纳米结构，纳米蚀刻银针的宽带散射光谱与便携式拉曼光谱仪中最常用的激发激光波长(785 nm)良好匹配，使其与低成本便携式拉曼光谱仪高度兼容。
目前商业化的SERS基底通常使用贵金属纳米颗粒，其常见的制备方法是化学合成法（通常需要高温搅拌），这种工艺对于容器的洁净度要求极高（微小的杂质也会影响结核过程），依赖于制备者的操作习惯（不同人制备出来的颗粒常常不同），比较难以用大容器进行批量制备（加热和均一性不好，洁净度比较难达到要求）；贵金属纳米颗粒较容易颗粒团聚，一旦颗粒出现团聚，会对拉曼光谱信号造成干扰，且检测相对比较复杂，不利用新学者掌握。
本发明中使用的纳米银针，是采用电化学工艺制备而成，电化学工艺更接近于自动化的批量生产，仅仅需要调整仪器的参数，来批量制备不同形貌的纳米银针。纳米银针由于呈单一的针状，不会出现颗粒团聚现象，可以使得拉曼光谱信号得以更好地聚焦，具有较好的信号稳定性。而且纳米银针本身作为取样器，极大地简化了操作步骤，有利用应用推广。
3、在待测样本中插入纳米银针SERS基底，进行恒温扩增
本步骤中，各试剂如无特殊说明，均取自RT-基础型核酸扩增试剂盒(ERA法，苏州先达基因科技有限公司)。
(1)、制备反应预混液
制备两种反应预混液，制备方法分别为：
a、在PCR管内依次加入20μl试剂溶解剂DA、2.5μl正向引物（10μM）、25.5μl阳性待测物(新冠病毒全长核酸标准品)溶液(Twist Bioscience)，预混液总体积48μl，充分震荡混匀并于掌上离心机瞬离。
b、在PCR管内依次加入20μl试剂溶解剂DA、2.5μl正向引物（10μM）、25.5μl阴性待测物(不含有新冠病毒核酸样本)溶液(来源于金域新冠临检实验室，已采用经获批的新冠肺炎病毒PCR检测试剂盒进行检测，确认为新冠肺炎阴性)，预混液总体积48μl，充分震荡混匀并于掌上离心机瞬离。
(2)、将上一步制备的预混液加入至预置的干粉化RT-基础扩增试剂中，充分震荡混匀，至干粉彻底溶解；
(3)、加入2μl激活剂MC，充分震荡混匀并于掌上离心机瞬离，得到总体积为50μl的反应溶液；
(4)、将以上反应溶液转移至直径为0.2cm的适配反应容器中(如图3所示)，插入步骤2的连接有反向引物的纳米银针SERS基底(作为恒温扩增的载体)，于42℃适配恒温仪器上反应30min；目标待测物在纳米银针SERS基底上进行恒温扩增和富集；
4、便携式拉曼光谱仪进行检测
反应完成后，从阳性待测物(即新冠病毒全长核酸标准品)反应溶液和阴性待测物(即不含有新冠病毒的核酸样本)反应溶液中，分别将纳米银针SERS基底取出，抽离背景反应体系，放置于便携式拉曼光谱仪上进行检测，降低检测背景反应体系的影响(现有技术是基于贵金属纳米颗粒的，当完成反应后在背景反应体系中进行检测，背景反应体系中存在反应的酶和副产物，可能会对结果产生影响，但纳米银针SERS基底无法放在背景反应体系中进行检测，需取出放到拉曼光谱仪上进行检测，这是必须过程，同时也降低了背景反应体系的影响)，实现信号的二次扩大，高效增加检测信号的特异性。作为对照，同时对没有与反向引物共价连接的纳米银针(空白纳米银针)也进行了检测。
1分钟就可以进行结果输出。光谱仪可视化系统自动将光谱信号转化为数据信号进行结果显示。结果如图4所示，没有与反向引物共价连接的纳米银针(空白纳米银针)，没有特征峰信号；共价连接有反向引物的纳米银针SERS基底，发现其特征峰位于729 cm-1位置；阳性待测物(即新冠病毒全长核酸标准品)的特征峰前移至715cm-1，计算阳性待测物与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异为14cm-1，位移差异＞4 cm-1(位移差异预设标准为4cm-1)，确定待测物为阳性；阴性待测物(即不含有新冠病毒的核酸样本)的特征峰前移至725cm-1，计算阴性待测物与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异=4cm-1，位移差异≤4 cm-1，确定待测物为阴性。
本实施例结果表明，通过检测拉曼光谱信号的位移差异＞4 cm-1还是≤4 cm-1，可以实现对待检测样本结果阴阳性的快速判读。
实施例2 本发明的检测方法可重复性、准确度的验证
利用本发明实施例1的试剂盒和检测方法，进行了三个批次的重复性实验，每个批次分别包括1个阳性样本(即新型冠状病毒全长核酸标准品)(Twist Bioscience)、和1个阴性样本(即不含有新型冠状病毒的核酸样本)(来源于金域新冠临检实验室，已采用经获批的新冠肺炎病毒PCR检测试剂盒进行检测，确认为新冠肺炎阴性)。结果如图5所示。
从图5中的a和b可以看出，没有与反向引物共价连接的纳米银针(空白纳米银针)，没有特征峰信号；共价连接有反向引物的纳米银针SERS基底，发现其特征峰位于729 cm-1位置；阳性样本1(即新冠病毒全长核酸标准品)的特征峰前移至718cm-1，计算阳性样本1与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异为11cm-1，位移差异＞4 cm-1，阴性样本1(即不含有新冠病毒的核酸样本)的特征峰前移至728cm-1，计算阴性样本1与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异=1cm-1，位移差异＜4 cm-1。
阳性样本2和3(即新冠病毒全长核酸标准品)的特征峰前移至720cm-1，计算阳性样本2和3与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异为9cm-1，位移差异＞4 cm-1，阴性样本2和3(即不含有新冠病毒的核酸样本)的特征峰前移至728cm-1，计算阴性样本2和3与纳米银针SERS基底特征峰的位移差异=1cm-1，位移差异＜4 cm-1。说明，本发明的试剂盒的检测方法，具有较好的可重复性。
三个批次实验的拉曼强度分析结果如图5中的c所示，从图中可以看出不同批次表现出来的拉曼信号强度不同，样本1和样本2中，阳性样本的峰强度高于阴性样本，而样本3中，阳性样本峰强度低于阴性样本，这反应了在SERS检测过程中，拉曼峰强度容易受到微环境(例如：光漂白，分子的脱附，SERS基底热效应等)的影响，不太稳定。
三个批次实验的拉曼光谱信号位移分析结果如图5中的d所示，从图中可以看出拉曼峰强度差异不一致的3个样本在拉曼位移的统计中表现出了一致性，阳性样本的拉曼光谱信号与阴性样本的拉曼光谱信号相比，均有大于4cm-1的位移，且都是移向更低波数，说明，拉曼光谱信号位移可以作为稳定的判定依据。
综上，相比起根据拉曼峰的强度的定量检测方法，本发明的定性检测方法更简单、更准确、更可靠。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州金域医学检验中心有限公司、香港城市大学深圳研究院、广州市金域转化医学研究院有限公司、广州金域医学检验集团股份有限公司
<120> 基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacatgatct ctgctttact aatgtctatg 30
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaagctata acgcagcctg taaaatca 28

Claims (10)

1.一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)、正向引物；
(2)、纳米银针SERS基底，所述纳米银针SERS基底是由5’端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得。
2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述纳米银针是通过电化学工艺制备而成，包括以下步骤：先将银针依次在乙醇、丙酮和水中超声清洗；再将银针置于1M±0.1M硝酸中进行电化学处理，即得；所述电化学处理包括5个~10个周期，每个周期的操作方法为：将银针置于阳极电流持续8秒~10秒，再置于阴极电流持续8秒~10秒。
3.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物的5’端有FAM修饰。
5.根据权利要求1~4任一项所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括溶解剂、RT-基础扩增试剂和激活剂。
6.一种基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法，其特征在于，所述方法获取拉曼光谱信号的位移差异，包括以下步骤：
(1)、采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号，所述纳米银针SERS基底是由5’端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得；
(2)、将步骤(1)的纳米银针SERS基底插入包含待检测样品的反应溶液中，进行恒温扩增；
(3)、恒温扩增反应结束后，取出纳米银针SERS基底，采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号，并与步骤(1)采集的拉曼光谱信号进行比较，检测拉曼光谱信号的位移差异。
7.根据权利要求6所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法，其特征在于，步骤(3)中检测所述拉曼光谱信号的位移差异＞4cm-1，或检测所述拉曼光谱信号的位移差异≤4cm-1。
8.根据权利要求6所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法，其特征在于，步骤(1)中所述纳米银针SERS基底的制备方法，包括以下步骤：
(a)、将5’端有巯基修饰的反向引物与三(2-羧乙基)膦混合，室温25min~35min进行还原；
(b)、将还原后的反向引物于60℃~70℃孵育8min~12min，马上置冰盒上冷却，冷却后平衡到室温；
(c)、在反向引物中插入纳米银针，室温反应25min~35min，使反向引物共价连接于纳米银针上，即得。
9.根据权利要求6所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法，其特征在于，步骤(2)中所述恒温扩增为：38℃~44℃恒温反应20min~30min。
10.根据权利要求6所述的基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述包含待检测样品的反应溶液的制备方法，包括以下步骤：
(a)、将15μl~25μl溶解剂、2.0μl~3.0μl正向引物、24.5μl~26.5μl待检测样品充分震荡混匀，离心，得到反应预混液；
(b)、将反应预混液加入至RT-基础扩增试剂中，充分震荡混匀，至RT-基础扩增试剂彻底溶解；
(c)、再加入1.5μl~2.5μl激活剂，充分震荡混匀，离心，得到总体积为50μl的包含待检测样品的反应溶液。
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