CN114703255B - 一种检测dna甲基转移酶活性的sers传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器。该传感器包括金盘温控电极，金电极，限制性内切酶DpnI，聚合酶KFP，切口核酸内切酶Nb.BbvcI，基底探针H1，引发探针triDNA，捕获探针H2，信号探针sDNA和信号分子4‑MBA组装在金纳米立方块表面的SERS tag。通过提高温控金电极的表面温度，Dam MTase和DpnI的活性显着增加，从而导致SDA模板DNA的快速产生。在SDA过程中，释放的ssDNA呈指数级扩增，其浓度与Dam MTase的活性呈正相关。本发明检测限为8.65×10‑5 U mL‑1，低于大多数文献报道值。

Description

一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测DNA甲基转移酶（Dam MTase）活性的SERS传感器。
背景技术
DNA甲基化在基因转录和基因表达等许多生物学过程中发挥着重要作用。它是一种化学修饰过程，通过DNA甲基化转移酶（MTase）将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中的甲基特异性地转移到特定DNA识别序列中的腺嘌呤或胞嘧啶上。由异常 MTase 活性引起的异常甲基化会影响基因表达并进一步导致各种癌症。因此，开发一种用于检测MTase活性和筛选其抑制剂的高灵敏度生物传感器至关重要。已经报道了许多检测MTase活性的方法，包括电化学、荧光、比色法、光电化学和表面增强拉曼光谱（SERS）。 在这些方法中，SERS 因其高灵敏度和快速读出而备受关注。
SERS作为一种强大的分析技术已被广泛研究用于检测蛋白质、小分子、核酸，因为它具有高灵敏度和快速读出的优点。SERS tag是通过将拉曼报告分子固定在等离激元贵金属纳米颗粒（如Au纳米球、Ag纳米立方体和Au纳米金星）的表面上来制造的。当拉曼报告分子位于纳米粒子周围“热点”处的极大增强电场中时，SERS强度显着增强。与球形等离子体纳米粒子相比，纳米立方体由于角和边缘的尖锐特征提供了更大的SERS增强，可以产生“避雷针”效应。此外，金纳米立方体（AuNCs）具有良好的生物相容性和长期稳定性，特别适合制备用于生物传感应用的SERS tag。然而，AuNCs尚未应用于MTase活性的SERS检测。
链置换扩增（SDA）是一种等温核酸扩增方法，可提供超过1010倍的靶标DNA扩增，并于1992年首次提出。从那时起，SDA因其快速高效的优点被广泛用于检测核酸、蛋白质和小分子。在典型的SDA过程中，主要涉及两种酶，切口内切核酸酶Nb.BbvCI和Klenow片段聚合酶（3'→5' exo-，KFP）。 Nb.BbvCI，可以识别双链DNA中5'-GCTGAGG-3'的特定序列，并在胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）之间切割一个3'-末端。KFP是从大肠杆菌中DNA聚合酶I的大蛋白水解片段的定点突变获得的，该片段保留了聚合酶的活性，但失去了3'、5'-外切核酸酶活性。在SDA过程中，KFP可以在dNTP 存在的情况下，在NB.BbvCI引起的切割位点3'-末端进行DNA聚合反应。聚合导致位于切割位点下游的靶标DNA的分离和包含靶标DNA序列的双链DNA的再生。重复切口-聚合-置换反应，导致靶标DNA的循环扩增和灵敏度的提高。
温控电极是通过施加电流直接或间接加热电极表面的一种技术。其优点在于能够在保持溶液温度不变的同时迅速提高电极温度。目前尚未报道结合链置换放大和温控电极检测Dam MTase活性的SERS 生物传感器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于温控电极和SDA反应以及等离子体AuNCs增强的新型“turn-on”模式（响应信号随着目标浓度的增加而增加）的SERS生物传感器，用于检测Dam MTase活性。具体的，所述的SERS生物传感器包括包括金盘温控电极HAuE，金电极AuE，限制性内切酶DpnI，聚合酶KFP，切口核酸内切酶Nb.BbvcI，基底探针H1，引发探针triDNA，捕获探针H2，信号探针sDNA和信号分子4-MBA组装在金纳米立方块表面的SERS tag。通过提高HAuE的表面温度，Dam MTase和DpnI的活性显著增加，从而导致SDA模板DNA的快速产生。在SDA过程中，释放的ssDNA呈指数级扩增，其浓度与Dam MTase的活性呈正相关，从而达到检测Dam MTase活性的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器，所述的SERS传感器包括金盘温控电极HAuE，金电极AuE，限制性内切酶DpnI，聚合酶KFP，切口核酸内切酶Nb.BbvcI，基底探针H1，引发探针triDNA，捕获探针H2，信号探针sDNA和信号分子4-MBA组装在金纳米立方块表面的SERS tag，其中：
基底探针H1：
5'-CGACCGGATCAATAAGACTTCAACCTCAGCCTCACTCTTATTGATCGGTCGTTTTT-(CH2)6-SH-3'；
捕获探针H2：5'-GGTTGAAGTCTCAATAAGACTTCAACCTCATTTT-(CH2)6-SH-3'；
引发探针triDNA：5'-TCAATAAGAGTGAGGC-3'；
信号探针sDNA：5'-GACTTCAACCTTTT-(CH2)6-SH-3'。
上述的一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器的制备方法，包括如下步骤：
（1）金纳米立方块的制备
将0.6 mL 10 mM的NaBH4溶液加入到含有10 mM HAuCl4的10 mL 0.1 M的CTAB溶液中，轻摇2 分钟，随后打开反应瓶瓶塞于28℃水浴3 小时以确保溶液中的NaBH4 完全分解，得到金种子溶液；将2 mL 0.5 mM的HAuCl4溶液添加到由2 mL 0.2 M的CTAC、1.5 mL 0.1 M的AA和50 μL金种子溶液组成的混合物中，于27℃保持15分钟，随后14000 rpm离心30 分钟，除去上清液后，将沉淀分散在1 mL 0.02 M的CTAC 溶液中，得到粒径10 nm的金纳米粒子溶液；将125 μL粒径10 nm的金纳米粒子溶液与25 mL 0.1 M的CTAC和1.825 mL 0.01 M的AA溶液在200 rpm磁力搅拌下于30℃混合2分钟，随后将搅拌速度调节至950 rpm，加入25mL 0.01 M的HAuCl4溶液并于30℃反应15分钟，可以观察到混合溶液颜色由浅红色逐渐变为深红色，随后8000 rpm离心20分钟，除去上清液后，将沉淀重新分散在1 mL 0.01 M的CTAC溶液中，得到金纳米立方块溶液，储存在4 ℃备用；
（2）SERS tag的制备
将5 μL 10 μM的sDNA与5 μL 10 mM的TCEP在室温下避光混合1小时，在此期间，25μL金纳米立方块溶液离心后用水离心洗涤两次，离心条件为4500 rpm 10 min，去除上清液后，将所得沉淀与处理过的sDNA混合，然后加入190 μL 0.01 wt. %的SDS溶液，并于37℃300 rpm条件下孵育过夜，再加入2 μL 2 mM的4-MBA乙醇溶液并在37℃条件下继续孵育2h，得到 AuNCs/sDNA/4-MBA溶液；将AuNCs/sDNA/4-MBA溶液在4500rpm条件下离心三次，每次10 分钟，以去除未修饰的sDNA和4-MBA，在前两次的离心中，将所得沉淀分散在0.01 wt.%的SDS溶液中，最后一次离心后，将所得沉淀分散在含有0.01 wt.% SDS的10 mM pH 7.4的PB溶液中，随后每半小时加入一次 2 M的NaCl，至最终NaCl为0.1 M，得到SERS tag溶液，于4 ℃保存备用；
（3）酶辅助链置换扩增反应
温控金盘电极HAuE用0.05 μm氧化铝粉末进行抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声清洗，再在0.5 M H2SO4溶液中采用循环伏安法进行电化学清洗，最后用去离子水冲洗电极并在氮气下干燥；基底探针H1固定在HAuE之前，先在95℃加热5分钟，然后将其冷却至37℃；接下来，将5 μL 10 μM的捕获探针H1与含有0.2 M NaCl的5 μL 10 mM的TCEP在室温下避光混合1小时，将10 μL混合物滴在HAuE表面并在37℃条件下组装 2 小时，得到HAuE/H1；HAuE/H1用PBS缓冲液（10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4）冲洗后，再在2 mM的MCH中封闭1 h，得到HAuE/H1/MCH；在捕获探针H1固定过程中，制备反应溶液1，所述反应溶液1包含1 × Dam MTase Reaction Buffer和1 × rCutSmart™ Buffer，总体积为 290 μL，然后向反应反应溶液1中加入不同浓度的Dam MTase、20000 U▪mL-1 1.3 μL的DpnI和, 5 μL320 μM的SAM，得到总体积为300μL的反应溶液2；将 HAuE/H1/MCH浸入反应溶液2中，并用直流电加热电极，升高电极温度至37℃，孵育2小时，孵育完成后，取出200 μL反应溶液2，80℃灭活20分钟；将10 μL 10 μM的triDNA添加到前一步灭活的反应溶液2中，并在37℃ 600rpm条件下孵育2 h，随后加入25 μL的10 × NEBuffer™ 2、25 μL的10 × rCutSmart™Buffer、10 μL 10 mM的dNTP、1 μL 10000 U▪mL-1的KFP和1 μL 5000 U▪mL-1的Nb.BbvCI，在37℃ 600 rpm条件下反应2 h以扩增ssDNA，再在80℃条件下失活20 min，得到SDA反应后的溶液，储存在4℃以供进一步使用；
（4）Dam MTase 活性检测
将5 μL 10 μM的捕获探针H2与5 μL 10 mM的TCEP在室温下避光混合1小时，加入PBS缓冲液（10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4）至混合液总体积为200 μL，然后将金电极AuE浸入其中，4℃孵育过夜，得到AuE/H2；用PBS缓冲液（10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4）冲洗AuE/H2表面后，将AuE/H2极依次在0.2 mL 2 mM的MCH和0.2 mL 1 %的BSA中各室温孵育1 h，得到AuE/H2/MCH/BSA；AuE/H2/MCH/BSA用PBS缓冲液（10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4）冲洗并在氮气下干燥，将10 μL SDA反应后的溶液滴在AuE/H2/MCH/BSA的表面，在37 ℃条件下孵育1 h，得到AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA；将AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA浸入200 μL 37℃的SERStag溶液中孵育2 h，得到AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA/4-MBA/sDNA/AuNCs；将孵育后的电极用超纯水冲洗，氮气吹干，进行拉曼检测。
上述的一种检测DNA甲基转移酶（Dam MTase）活性的SERS传感器的制备方法中，所述的SDA反应所扩增的ssDNA的序列为5'-TGAGGTTGAAGTCTTATTGA-3'。
本发明传感器原理：
本发明用于Dam MTase活性检测的SERS传感器的检测原理如图1所示。首先，通过用 sDNA和4-MBA对AuNCs功能化来制备作为SERS tag的AuNCs/sDNA/4-MBA。基地探针H1被设计成包括识别序列的两个部分，一个部分可以被Dam MTase识别，另一个部分（红色序列）与triDNA互补。H1序列（5'-GATC-3'）中的腺嘌呤残基在Dam MTase存在下可被甲基化，然后被内切酶DpnI在甲基化位置特异性识别和切割。通过应用温控电极优化温度以提高DamMTase和DpnI的活性，提高了传感器的灵敏度。接下来，temDNA（从甲基化H1上切割下来）可以与triDNA杂交形成 temDNA/triDNA双链体，这将在KFP和dNTP存在下引发DNA聚合反应，形成完整的双链DNA（dsDNA）。随后，dsDNA将被Nb.BbvCI切割以触发由KFP催化的新DNA聚合反应。同时，上述dsDNA中聚合形成的ssDNA序列会被新聚合的ssDNA序列所取代。重复切口-聚合-置换过程，导致循环扩增，从而产生大量的ssDNA。然后将含有ssDNA的溶液滴在AuE/H2/MCH/BSA上，得到AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA。具体而言，ssDNA通过碱基互补配对打开捕获探针H2，并呈现H2中的非互补序列，该非互补序列可以与固定在AuNCs/sDNA/4-MBA SERStag上的sDNA杂交，得到最终的SERS基底电极AuE/H2/MCH/BSA/4-MBA/sDNA/AuNCs。因此，可以从该电极表面测量SERS 信号。总之，本发明成功研制出了用于检测Dam MTase活性的SERS传感器。
本发明的显著优点在于：
本发明SERS生物传感器中，结合AuNC增强SERS、链置换放大（SDA）策略以及温控金盘电极（HAuE）的优点，提出了一种SERS 生物传感器，用于高灵敏度检测Dam甲基转移酶（MTase）的活性。由于角和边缘的尖锐特征，AuNC提供了更大的SERS增强。此外，AuNC具有良好的生物相容性和长期稳定性，特别适合制备用于生物传感应用的 SERS 标签。随着电极温度的升高， Dam甲基转移酶和限制性内切酶DpnI的活性增强，SERS信号增强，检测限大大降低。通过简单地改变DNA序列和相应的限制性内切酶，生物传感器将可用于不同种类甲基转移酶活性的检测。
附图说明
图1 为本发明SERS生物传感器原理图。
图2为传感器检测性能优化图，其中A为对DNA甲基化及酶切温度进行的优化，B为SDA反应时间进行的优化，C为ssDNA杂交时间优化D为对SERS tag组装时间的优化。
图3为所述传感器的灵敏度检测结果图，其中A为4-MBA的拉曼谱图，B为4-MBA在1585 cm−1处峰强与Dam MTase浓度（0.0001-35 U mL−1）对数线性关系曲线。C为4-MBA在1585 cm−1处峰强与Dam MTase浓度（0.0001-0.5 U mL−1）对数线性关系曲线。
图4为传感器的抑制剂影响探究结果图，A：抑制剂5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，200 μM）对DpnI, KFP and NB.BbvCI的影响；B：不同浓度抑制剂5-氟尿嘧啶对Dam MTase活性的影响曲线。
具体实施方式
实验所用缓冲液及核苷酸序列
缓冲液：Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4)，PBS buffer (10 mM PB, 0.1 MNaCl, pH 7.4), 10 × Dam MTase Reaction Buffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM β-ME, 10mM EDTA, pH 7.5), 10 × rCutSmart™ Buffer (50 mM potassium acetate, 20 mMTris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 100 µg mL−1 Recombinant Albumin, pH7.9), 10 × NEBuffer™ 2 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT,pH 7.9), 10 × rCutSmart™ Buffer (50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 100 µg mL−1 Recombinant Albumin, pH 7.9),and 5 × TBE buffer (445 mM Tris, 445 mM boric acid, 10 mM EDTA, pH 8.0-8.6).
表1.实验中所用到的核苷酸序列
实施例1传感器的制备
（1）金纳米立方块的制备
首先制备金种子溶液。将NaBH4溶液（0.6 mL，10 mM）加入到含有HAuCl4（10 mM）的10 mL CTAB（0.1 M）溶液中，盖紧反应瓶瓶塞，轻轻摇动 2 分钟，然后打开反应瓶瓶塞并将反应瓶置于28℃水浴3小时，以确保溶液中的NaBH4完全分解，得到金种子溶液。
其次，制备粒径为10 nm的金纳米粒子。将HAuCl4溶液（2 mL, 0.5 mM）添加到由CTAC（2 mL, 0.2 M）、AA（1.5 mL, 0.1 M）和金种子溶液（50 μL）组成的混合物中，将反应液置于27 ℃保持15分钟，随后14000 rpm离心30分钟，除去上清液后，将所得沉淀分散在CTAC溶液（1 mL，0.02 M）中，得到金纳米粒子溶液。
最后，制备金纳米立方块。将前一步制备的金纳米粒子溶液（125 μL）与CTAC（25mL，0.1 M）和AA（1.825 mL，0.01 M）溶液在磁力搅拌（200 rpm）下在30℃下混合2分钟，随后将搅拌速度调节至950 rpm，再加入HAuCl4溶液（25 mL，0.01 M）并在30℃下反应15分钟，可以观察到混合溶液颜色由浅红色逐渐变为深红色，然后将混合溶液在8000 rpm条件下离心20分钟，除去上清液后，将所得沉淀重新分散在CTAC溶液（1 mL, 0.01 M）中，得到金纳米立方块溶液，并储存在4℃备用。
（2）SERS tag的制备
将sDNA（5 μL，10 μM）与TCEP（5 μL，10 mM）在室温下避光混合1小时，得到sDNA与TCEP的混合物。在sDNA与TCEP混合的期间，将25 μL（1）中制得的金纳米立方块溶液在4500rpm条件下离心10分钟，所得沉淀用超纯水4500 rpm离心洗涤两次，每次10 min，去除上清液后，将所得沉淀加入前一步的sDNA与TCEP的混合物中，然后加入190 μL SDS溶液 (0.01wt. %)，并于恒温振荡器（37℃，300 rpm）中孵育过夜，获得AuNCs/sDNA溶液；向前一步的AuNCs/sDNA溶液中加入4-MBA 乙醇溶液（2 μL, 2 mM）并在37℃下继续孵育2 h，组装得到AuNCs/sDNA/4-MBA溶液；将AuNCs/sDNA/4-MBA溶液在4500 rpm条件下离心三次，每次10min，以去除未修饰的sDNA和4-MBA，在前两次的离心中，将所得沉淀分散在200 μL 0.01wt. % 的SDS溶液中，最后一次离心后，将所得沉淀重新分散在200 μL含有0.01 wt. % SDS的PB溶液（10 mM，pH 7.4）中，随后每半小时加入一次10 μL 2 M的NaCl，使得NaCl的终浓度达到0.1 M，得到SERS tag溶液。将制备好的SERS tag溶液于4 ℃保存备用。
（3）酶辅助链置换扩增反应（SDA）
温控金盘电极（HAuE）用 0.05 μm 氧化铝粉末进行打磨抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中各超声清洗一次，每次5分钟。再在0.5 M H2SO4溶液中采用循环伏安法进行电化学清洗，直到得到稳定可重复的循环伏安峰，最后用去离子水冲洗电极并用氮气吹干电极表面。
基底探针H1固定在HAuE之前，先在95℃条件下加热5分钟，然后自然冷却至37℃。接下来，将H1（5 μL，10 μM）与含有0.2 M NaCl的TCEP（5 μL，10 mM）在室温下避光混合1小时，将10 μL混合物滴在HAuE表面，37 ℃孵育2小时，通过Au-S键形成HAuE/H1。用PBS缓冲液（10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4）冲洗HAuE/H1，随后浸入MCH（2 mM）中室温封闭 1 h，形成HAuE/H1/MCH。在H1固定在HAuE的过程中，制备反应溶液1，该反应溶液1包含1 × DamMTase Reaction Buffer和1 × rCutSmart™ Buffer，总体积为290 μL；然后向反应溶液1中加入不同浓度的Dam MTase、DpnI（20000 U▪mL-1，1.3 μL）和SAM（320 μM，5 μL），总体积达到300 μL，得到反应溶液2。将HAuE/H1/MCH浸入反应溶液2中，并通过用6 V直流电加热电极，升高电极温度至37℃，并在37℃条件下酶切2小时。酶切完成后，取出200 μL反应溶液2，在80 ℃条件下灭活20分钟，随后进行SDA反应。SDA反应具体为：将triDNA（10 μL, 10 μM）添加到前一步灭活的反应溶液2中，并在摇床（37 °C，600 rpm）中孵育2 h，随后向其中加入10 × NEBuffer™ 2（25 μL）、10 × rCutSmart™ Buffer（25 μL）、dNTP（10 mM, 10 μL）、KFP (10000 U▪mL-1，1 μL）和 Nb.BbvCI（5000 U▪mL-1，1 μL），将混合溶液在摇床（37 °C,600 rpm）中进行SDA反应，反应时间为2 h，以扩增ssDNA，再将混合溶液在80℃条件下失活20 min，得到SDA反应后的溶液，储存在4℃以供进一步使用。其中，所扩增的ssDNA的序列为：5'-TGAGGTTGAAGTCTTATTGA-3'。
（4）Dam MTase活性检测
根据上述处理HAuE的方法对用作SERS衬底的金电极（AuE，直径2mm）进行预处理。将捕获探针H2（5 μL，10 μM）与TCEP（5 μL，10 mM）混合1小时，然后加入PBS缓冲液（10 mMPB，0.1 M NaCl，pH 7.4），至混合液总体积为200 μL，然后将AuE浸入混合溶液中，并于4℃孵育过夜，得到AuE/H2。用PBS 缓冲液（10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4）冲洗AuE/H2表面后，将AuE/H2依次在MCH（0.2 mL，2 mM）和BSA（0.2 mL，1 %）中各室温孵育1 h，得到AuE/H2/MCH/BSA。AuE/H2/MCH/BSA用PBS缓冲液（10 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.4）冲洗并在氮气下干燥，随后将上述SDA反应后的溶液（10 μL）滴在AuE/H2/MCH/BSA的表面，并在37℃条件下孵育1 h，通过ssDNA和H2的杂交获得AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA。最后，将AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA浸入200 μL 37℃的SERS tag溶液中2 h，通过SERS tag中sDNA和H2/ssDNA的杂交获得AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA/4-MBA/sDNA/AuNCs。将AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA/4-MBA/sDNA/AuNCs用超纯水冲洗，氮气吹干表面，进行拉曼检测。每次随机采集7个点的SERS信号，取平均值。
实施例2 实验条件的优化
为了使设计的传感器达到最佳检测性能，本实施例优化了4个实验参数：DNA甲基化酶切反应的温度（25、30、34、37、40、43 ℃），SDA反应时间优化（0.5、1、1.5、2、3 h），ssDNA杂交时间优化（0.5、1、2、3、4 h），以及SERS tag组装的时间（0.5、1、1.5、2、3 h）。
如图2所示，2A为对DNA甲基化酶切反应的温度的优化，随着电极温度从25℃升高到 44℃，拉曼强度继续增加，然而，当温度高于 37℃时，拉曼强度降低。Dam MTase的结构可能会因高温而受损，相应的活性会降低。因此，选择37℃作为DNA甲基化和酶切割过程的最佳电极表面温度。2B为对SDA反应时间优化，拉曼强度随着SDA反应时间的延长而增加，当SDA反应时间为2 h时拉曼强度达到最大。因此，选择2 h作为后续实验SDA反应的最佳时间。2C为对ssDNA杂交时间优化，拉曼强度随着杂交时间的延长而增加，当杂交时间为1 h时拉曼强度达到最大。因此，选择1小时作为后续实验ssDNA杂交时间的最佳条件。2D为对SERStag组装的时间的优化，拉曼强度随着SERS tag组装时间的延长而增强并在2小时达到平台值，但在2小时后略有下降，可能是由于DNA从AuE上脱落。因此，选择2 h作为后续实验SERStag组装时间的最佳条件。
实施例3 传感器对检测Dam MTase活性灵敏度检测
在优化实验条件下，通过使用不同浓度的Dam MTase来探索本发明所提出的SERS生物传感器的灵敏度。
如图3所示，随着Dam MTase浓度的增加，在1585 cm-1处的SERS强度逐渐增强。DamMTase浓度（从 0.0001 到 0.5 U mL-1）的对数与拉曼强度之间存在良好的线性关系。相应的回归方程为 ISERS = 2042.27 + 497.72 log CDam MTase (U▪mL-1，R2 = 0.996)。检测限（LOD）计算为8.65 × 10-5 U▪mL-1 (S/N = 3)。表明该传感器能够实现对Dam MTase活性的高灵敏度检测。
实施例4在实际样胎牛血清中检测Dam MTase活性
为了评估本发明所提出的SERS 生物传感器在真实生物样品中检测Dam MTase活性的适用性，使用了含有三种不同浓度 Dam MTase（0.5、10-3、10-4 U▪mL-1）的胎牛血清样品用于测量。
如表2所示，回收率范围为90.82 % 至104.7 %，RSD范围为5.32 % 至11.1 %，表明胎血清样品对所提出的SERS生物传感器的干扰可以忽略不计。 因此，本发明所提出的生物传感器具有在真实生物样品中灵敏地检测Dam MTase活性的潜力。
表2.稀释的胎牛血清样品中的 Dam MTase 活性检测
实施例5 Dam MTase活性抑制试验
用于疾病治疗和去甲基化药物开发的DNA甲基转移酶抑制剂的筛选引起了极大的关注。本发明选择一种抗生素药物（5-氟尿嘧啶）作为模型抑制剂来评估对Dam MTase的抑制作用。由于该方法涉及DpnI、KFP和Nb.BbvCI，因此有必要排除抑制剂对这些酶的影响。DNA完全甲基化后，将5-氟尿嘧啶（200 μM）加入反应液中，考察抑制剂对系统中除DamMTase外的其他酶的影响。
如图4A所示，在5-氟尿嘧啶存在与否的情况下，1585 cm-1处的拉曼峰强度没有明显变化，说明5-氟尿嘧啶对 DpnI、KFP和 Nb.BbvCI的影响几乎可以被忽略。然后在DNA甲基化反应液中加入不同浓度的5-氟尿嘧啶，考察其对Dam MTase的抑制作用。如图4B所示，随着5-氟尿嘧啶的浓度从5 μM增加到100 μM，Dam MTase的活性显著降低，这意味着对DamMTase的抑制作用逐渐增强。同时，半抑制浓度（IC50），定义为将酶活性降低50%所需的抑制剂浓度，在图4B中计算为7.99 μM。基于上述实验结果，所提出的传感器具有筛选MTase抑制剂的潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgaccggatc aataagactt caacctcagc ctcactctta ttgatcggtc gttttt 56
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttgaagtc tcaataagac ttcaacctca tttt 34
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcaataagag tgaggc 16
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacttcaacc tttt 14
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaggttgaa gtcttattga 20

Claims (1)

1.一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述的SERS传感器包括金盘温控电极HAuE，金电极AuE，限制性内切酶DpnI，聚合酶KFP，切口核酸内切酶Nb.BbvcI，基底探针H1，引发探针triDNA，捕获探针H2，信号探针sDNA和信号分子4-MBA组装在金纳米立方块表面的SERS tag，其中：
基底探针H1：
5’-CGACCGGATCAATAAGACTTCAACCTCAGCCTCACTCTTATTGATCGGTCGTTTTT-(CH2)6-SH-3’；
捕获探针H2：5’-GGTTGAAGTCTCAATAAGACTTCAACCTCATTTT-(CH2)6-SH-3’；
引发探针triDNA：5’-TCAATAAGAGTGAGGC-3’；
信号探针sDNA：5’-GACTTCAACCTTTT-(CH2)6-SH-3’；
所述的制备方法包括如下步骤：
（1）金纳米立方块的制备
将0.6mL 10mM的NaBH4溶液加入到含有10mM HAuCl4的10mL 0.1M的CTAB溶液中，轻摇2分钟，随后打开反应瓶瓶塞于28℃水浴3小时以确保溶液中的NaBH4完全分解，得到金种子溶液；将2mL 0.5mM的HAuCl4溶液添加到由2mL 0.2M的CTAC、1.5mL 0.1M的AA和50μL金种子溶液组成的混合物中，于27℃保持15分钟，随后14000rpm离心30分钟，除去上清液后，将沉淀分散在1mL 0.02M的CTAC溶液中，得到粒径10nm的金纳米粒子溶液；将125μL粒径10nm的金纳米粒子溶液与25mL 0.1M的CTAC和1.825mL 0.01M的AA溶液在200rpm磁力搅拌下于30℃混合2分钟，随后将搅拌速度调节至950rpm，加入25mL 0.01M的HAuCl4溶液并于30℃反应15分钟，可以观察到混合溶液颜色由浅红色逐渐变为深红色，随后8000rpm离心20分钟，除去上清液后，将沉淀重新分散在1mL 0.01 M的CTAC溶液中，得到金纳米立方块溶液，储存在4℃备用；
（2）SERS tag的制备
将5μL 10μM的sDNA与5μL 10mM的TCEP在室温下避光混合1小时，在此期间，将25μL金纳米立方块溶液离心后用水离心洗涤两次，离心条件为4500rpm 10min，去除上清液后，将所得沉淀与处理过的sDNA混合，然后加入190μL 0.01wt.%的SDS溶液，并于37℃ 300rpm条件下孵育过夜，再加入2μL 2mM的4-MBA乙醇溶液并在37℃条件下继续孵育2h，得到AuNCs/sDNA/4-MBA溶液；将AuNCs/sDNA/4-MBA溶液在4500rpm条件下离心三次，每次10分钟，以去除未修饰的sDNA和4-MBA，在前两次的离心中，将所得沉淀分散在0.01wt.%的SDS溶液中，最后一次离心后，将所得沉淀分散在含有0.01wt.% SDS的10mM pH7.4的PB溶液中，随后每半小时加入一次2M的NaCl，直至NaCl的终浓度为0.1M，得到SERS tag溶液，于4℃保存备用；
（3）酶辅助链置换扩增反应
温控金盘电极HAuE用0.05μm氧化铝粉末进行抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声清洗，再在0.5M H2SO4溶液中采用循环伏安法进行电化学清洗，最后用去离子水冲洗电极并在氮气下干燥；基底探针H1固定在HAuE之前，先在95℃加热5分钟，然后将其冷却至37℃；接下来，将5μL 10μM的基底探针H1与含有0.2M NaCl的5μL 10mM的TCEP室温避光混合1小时，将10μL混合物滴在HAuE表面并在37℃条件下组装2小时，得到HAuE/H1；用含有0.1MNaCl的10mM pH7.4的PBS缓冲液冲洗HAuE/H1后，再在2mM的MCH中封闭1h，得到HAuE/H1/MCH；在基底探针H1固定过程中，制备反应溶液1，所述反应溶液1包含1×Dam MTaseReaction Buffer和1×rCutSmart™ Buffer，总体积为290μL，然后向反应溶液1中加入不同浓度的Dam MTase、20000U/mL 1.3μL的DpnI和5μL 320μM的SAM，得到总体积为300μL的反应溶液2；将HAuE/H1/MCH浸入反应溶液2中，并用直流电加热电极，升高电极温度至37℃，孵育2小时，孵育完成后，取出200μL反应溶液2，80℃灭活20分钟；将10μL 10μM的triDNA添加到前一步灭活的反应溶液2中，并在37℃ 600rpm条件下孵育2h，随后加入25μL的10×NEBuffer™ 2、25μL的10×rCutSmart ™ Buffer、10μL 10mM的dNTP、1μL 10000U/mL的KFP和1μL 5000U/mL的Nb.BbvCI，在37℃ 600rpm条件下反应2h以扩增ssDNA，再在80℃条件下失活20min，得到SDA反应后的溶液，储存在4℃以供进一步使用；
（4）Dam MTase活性检测
将5μL 10μM的捕获探针H2与5μL 10mM的TCEP室温避光混合1小时，加入含有0.1M NaCl的10mM pH7.4的PBS缓冲液至混合液总体积为200μL，然后将金电极AuE浸入其中，4℃孵育过夜，得到AuE/H2；用含有0.1M NaCl的10mM pH7.4的PBS缓冲液冲洗AuE/H2表面后，将AuE/H2依次在0.2mL 2mM的MCH、0.2mL 1%的BSA中室温孵育1h，得到AuE/H2/MCH/BSA；AuE/H2/MCH/BSA用含有0.1M NaCl的10mM pH7.4的PBS缓冲液冲洗并在氮气下干燥，将10μL SDA反应后的溶液滴在AuE/H2/MCH/BSA的表面，在37℃条件下孵育1h，得到AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA；将AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA浸入200μL 37℃的SERS tag溶液中孵育2h，得到AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA/4-MBA/sDNA/AuNCs；将孵育后的电极用超纯水冲洗，氮气吹干，进行拉曼检测；
所述的SDA反应所扩增的ssDNA的序列为：5’-TGAGGTTGAAGTCTTATTGA-3’。
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