CN116381238B - 基于双增策略的均质电化学适配体传感器及其在癌胚抗原检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器及其在癌胚抗原检测中的应用。本发明通过结合RecJf外切酶介导的靶循环策略和滚圈扩增技术，构建了一种用于癌胚抗原高灵敏检测的无固定化和无标记的均质电化学适配体传感器。在该系统中，适配体或其他相关信号元件在电极基底上的预固定不再是必要的，因此均质电化学适配体传感器在不同电极基质上表现出良好的通用性。此外，整个识别和信号放大过程由简单的、非专业的溶液混合操作瞬间激活。该策略不仅可以提高稳定性和再现性，而且由于在均匀溶液相中的自由目标识别和双信号放大，还可以进一步提高灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器及其在癌胚抗原检测中的应用，属于生物分析检测技术领域。
背景技术
电化学生物传感器已在环境监测、食品安全和临床诊断中得到广泛发展。在大多数情况下，电化学生物传感器基于异质机制，因此需要将不同的识别元件固定在电极表面，如适配体、抗体、肽链等。然而，这些异质电化学传感器通常具有一些不可避免的内在缺陷。首先，由于固定化构型的空间位阻增加和自由度降低，电极界面上的固定化可能抑制识别元件与其目标之间的识别效率。其次，在非均质分析过程中，在收集电化学信号之前将识别元件固定在电极表面的过程通常是费力和耗时的。第三，非均质电极表面上识别元件负载密度的批次间差异可能对生物传感重复性和再现性产生不利影响。最后，由于生物材料的自然降解，识别元件固定的电极基板不易于长时间保存。异质电化学生物传感器的上述缺陷极大地阻碍了其在便携式护理点测试(POCT)中的商业应用。因此，希望开发一种无需预固定、灵敏度高的均质电化学传感器，以提升其在商业应用中的可行性。
由于核酸链的高度可编程性和易于修改，适配体作为有效的识别元件已经开发出具有多种信号放大技术的电化学生物传感器。核酸等温扩增技术包括链置换扩增、滚圈扩增(RCA)、混合链式反应、熵驱动和催化发夹组件等，可以用来高效率和低成本地实现信号放大。其中，RCA可以通过聚合酶介导的复制广泛产生含有大量可编程串联重复序列的长DNA分子，实现溶液相中信号的扩增。此外，还可以引入由核酸酶触发的靶循环来构建高度灵敏的电化学适配体传感器，如核酸外切酶I(Exo I)、核酸外切蛋白酶III(Exo III)、Nb.BbvCI、RecJf核酸外切糖酶。RecJf外切酶是一种功能酶，可以催化从单链DNA(ssDNA)沿其5'端至3'端去除单磷酸DNA。因此，它可以用于水解适配体和靶标复合物中的单个适配体链，连续释放靶标以结合更多相应的适配体。
在均质电化学适配体传感器系统的构建过程中，电活性信号的引入也受到了关注。作为电化学信号读出元件，氧化还原活性物质如亚甲基蓝(MB)和二茂铁(Fc)通常共价标记在DNA末端。然而，引入信号标签带来了更高的成本、更复杂的制备和更低的检测稳定性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过结合RCA技术和RecJf外切酶辅助的靶循环，提出了一种均质电化学适配体传感器，用于癌胚抗原(CEA)检测。当CEA样品加入到溶液A中时，由于靶标和适配体之间的识别，cDNA探针从磁性生物偶联物中释放。同时，RecJf外切酶激活靶循环过程，将CEA释放到新一轮的结合和酶反应中。在反应和磁分离之后，将上清液加入溶液B中以引发RCA反应。随后，在添加氯化血红素(hemin)后，将G-四链体/氯化血红素(G-quadruplex/hemin)复合物作为电化学信号探针在金柱电极(AuR)或丝印金电极(SPE)的表面上孵育。通过使用DPV测量，G-quadruplex/hemin复合物中铁卟啉的Fe2+和Fe3+之间的电子转移产生了极强的电化学信号。因此，峰值电流值与G-quadruplex/hemin复合物的数量呈正相关，这取决于CEA的浓度。然而，当没有靶时，cDNA不能从磁珠表面中逃逸。即使添加了溶液B，也无法形成RCA产物，从而导致低的背景信号。在该系统中，通过混合溶液来触发目标识别和信号放大过程，这有利于非专业操作和长时间保存。RecJf外切酶辅助靶循环和RCA信号放大的双重扩增机制克服了非均质反应所造成的缺陷，实现了高灵敏的CEA检测。
本发明的第一个目的是提供一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器，包括溶液A、溶液B、含氯化血红素的G-四链体形成溶液和检测电极；
其中，溶液A中包括由cDNA、适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJf外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA(滚环扩增)反应液。
进一步地，所述cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物在靶标与适配体结合时，cDNA释放，并由RecJf外切酶辅助完成靶循环扩增。
进一步地，所述适配体与所述磁珠通过链霉亲和素与生物素进行连接。
进一步地，RCA反应液包括环状模板DNA、dNTPs以及phi29 DNA聚合酶。
进一步地，所述环状模板DNA通过如下方法制备得到：
将连接探针与磷酸化的挂锁探针混合后杂交；杂交后在含T4 DNA连接酶的缓冲液中进行挂锁探针的环化；环化后失活T4 DNA连接酶，并消除多余探针；再热处理后得到所述的环状模板DNA。
进一步地，连接探针为5'-AAT TGA ATA AGC TAC GCA CAG TT-3'(SEQ ID NO.1)；挂锁探针5'p-TTA TTC AAT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTT TTT TTC CCA ACCCGC CCT ACC CTT TTA ACT GTG CGT AGC-3'(SEQ ID NO.2)。
进一步地，所述检测电极包括工作电极、对电极和参比电极。
进一步地，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
进一步地，金电极为金柱电极(AuR)或丝印金电极(SPE)。
本发明的第二个目的是提供一种用于肿瘤标志物检测的基于双增策略的均质电化学适配体传感器，包括溶液A、溶液B、含氯化血红素的G-四链体形成溶液和检测电极；
其中，溶液A中包括由cDNA、肿瘤标志物的适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJf外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA反应液。
进一步地，所述肿瘤标志物为癌胚抗原CEA。
进一步地，肿瘤标志物为癌胚抗原CEA时，CEA的适配体的序列为：5'-ATACCAGCTTAT TCA ATT-3'(SEQ ID NO.3)。
进一步地，CEA的适配体的序列修饰生物素之后为：5'-ATA CCA GCT TAT TCAATT-Biotin-3'。
进一步地，cDNA序列为SH-(CH2)6-AAT TGA ATA AGC T(SEQ ID NO.4)。
进一步地，所述肿瘤标志物的适配体与所述磁珠通过链霉亲和素与生物素进行连接。
进一步地，RCA反应液包括环状模板DNA、dNTPs以及phi29 DNA聚合酶。
进一步地，所述环状模板DNA通过如下方法制备得到：
将连接探针与磷酸化的挂锁探针混合后杂交；杂交后在含T4 DNA连接酶的缓冲液中进行挂锁探针的环化；环化后失活T4 DNA连接酶，并消除多余探针；再热处理后得到所述的环状模板DNA。
进一步地，连接探针为5'-AAT TGA ATA AGC TAC GCA CAG TT-3'；挂锁探针5'p-TTA TTC AAT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACCCTT TTA ACT GTG CGT AGC-3'。
进一步地，所述检测电极包括工作电极、对电极和参比电极。
进一步地，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
进一步地，金电极为金柱电极(AuR)或丝印金电极(SPE)。
本发明的第三个目的是提供一种非诊断目的的肿瘤标志物检测方法，包括如下步骤：
S1、将肿瘤标志物的标准溶液加入溶液A中，在35～40℃下反应0.5～2h，磁分离后取上清液，得到反应液；
S2、将S1步骤得到的反应液加入溶液B中进行RCA反应，得到RCA反应液；
S3、向RCA反应液中加入含氯化血红素的G-四链体形成溶液，并在检测电极上进行孵育，并检测电化学信号；
S4、根据标准溶液的浓度与电化学信号的强度绘制标准曲线；
S5、将待检测样本按照S1～S3步骤，测定其电化学信号，代入S4步骤的标准曲线中计算待检测样本中相应的肿瘤标志物的浓度；
其中，溶液A中包括由cDNA、肿瘤标志物的适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJf外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA反应液。
进一步地，所述肿瘤标志物为癌胚抗原CEA。
进一步地，肿瘤标志物为癌胚抗原CEA时，CEA的适配体的序列为：5'-ATACCAGCTTAT TCAATT-3'。
进一步地，CEA的适配体的序列修饰生物素之后为：5'-ATA CCA GCT TAT TCAATT-Biotin-3'。
进一步地，所述肿瘤标志物的适配体与所述磁珠通过链霉亲和素与生物素进行连接。
进一步地，RCA反应液包括环状模板DNA、dNTPs以及phi29 DNA聚合酶。
进一步地，所述环状模板DNA通过如下方法制备得到：
将连接探针与磷酸化的挂锁探针混合后杂交；杂交后在含T4 DNA连接酶的缓冲液中进行挂锁探针的环化；环化后失活T4 DNA连接酶，并消除多余探针；再热处理后得到所述的环状模板DNA。
进一步地，连接探针为5'-AAT TGA ATA AGC TAC GCA CAG TT-3'；挂锁探针5'p-TTA TTC AAT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACCCTT TTA ACT GTG CGT AGC-3'。
进一步地，所述检测电极包括工作电极、对电极和参比电极。
进一步地，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
进一步地，金电极为金柱电极(AuR)或丝印金电极(SPE)。
本发明的有益效果是：
本发明通过结合RecJf外切酶介导的靶循环策略和滚圈扩增技术，构建了一种用于癌胚抗原(CEA)高灵敏检测的无固定化和无标记的均质电化学适配体传感器。在该系统中，适配体或其他相关信号元件在电极基底上的预固定不再是必要的，因此均质电化学适配体传感器在不同电极基质上表现出良好的通用性。此外，整个识别和信号放大过程由简单的、非专业的溶液混合操作瞬间激活。该策略不仅可以提高稳定性(30天稳定性为95.1％)和再现性(五只独立电极为2.12％)，而且由于在均匀溶液相中的自由目标识别和双信号放大，还可以进一步提高灵敏度(fg mL–1水平的检测限值)。
附图说明
图1为基于双增策略的电流型适配体传感器用于CEA检测的原理图；
图2为传感器对不同浓度CEA的电流-时间曲线响应及检测标准曲线：A和C对应AuR；B和D对应SPE。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中所述DNA适配体购于生工生物工程(上海)股份有限公司，癌胚抗原CEA购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1：癌胚抗原CEA浓度标准曲线的绘制
(1)滚环模板的制备：将购买的连接探针(100μM，4μL)和磷酸化的挂锁探针(100μM，4μL)均匀混合并在95℃下加热5min，然后逐渐冷却至室温以产生杂交。随后，加入T4 DNA连接酶(40UμL–1，2μL)以及T4连接酶缓冲液(4μL)并用PBS缓冲液补充整个反应体系至40μL，在16℃下启动挂锁探针的过夜环化。接着在65℃下加热10min使T4 DNA连接酶失活，再引入Exo III(100UμL–1，2μL)和Exo I(5UμL–1，6μL)在37℃下反应2h去消化多余的DNA探针，最后90℃热处理10min即可获得环形DNA模板，并将其保持在4℃条件下直到将来使用；
(2)cDNA/Apt/MBs磁性复合物的制备：在构建传感器之前，还需要制备好由磁珠(MBs)、生物素修饰的CEA适配体(Apt)以及其部分互补序列(cDNA)三部分组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物，制备过程简述如下：首先，将修饰有巯基的cDNA序列与TCEP(10mM)在25℃下反应1h以减少二硫键，接着取出100μL MBs(10mg mL–1)用PBS缓冲液洗涤三次去除保护液后与200μL生物素修饰的Apt溶液(1μM)在37℃条件下轻轻摇动过夜，使两者依靠链霉亲和素与生物素这种强的作用力形成Apt/MBs。之后，通过磁性分离去除未与磁珠结合的适配体序列，再加入200μL处理好的cDNA溶液(1μM)，在37℃下与Apt/MBs反应2h，获得cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物。最后，同样磁性分离未结合的cDNA，用200μL PBS缓冲液中将复合物重悬并保存在4℃冰箱；
(3)靶标反应以及双扩增反应：取10μL上述制备的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物，去除上清后在其中加入RecJf外切酶(30UμL–1，0.5μL)和PBS缓冲液作为目标循环溶液(溶液A)。然后将不同浓度的肿瘤标志物(10μL)加入其中，整个体系在37℃下反应1h，使CEA竞争性地打开cDNA/Apt双链，结合磁性复合物中的Apt，并完成RecJf核酸外切酶辅助的靶循环扩增过程。最后，加入RCA反应液即溶液B(上述步骤(1)中制备的5μL的环状模板DNA、5μL10mM的dNTPs以及0.5μL 10UμL–1的phi29 DNA聚合酶)启动RCA扩增反应，于37℃下反应60min后获得RCA产物；
(4)电极清洗与活化：将金柱电极在食人鱼溶液(H2SO4:H2O2＝7:3)中浸泡15min，分别在超纯水和无水乙醇中超声3min，再在0.3μm和0.05μm氧化铝悬浮液中分别打磨3min。用水冲干净后进行0.5M硫酸扫描清洗(–0.2V到1.5V，扫描速率1V s-1，循环次数100次)，再用水冲干净，氮气吹干以备后续使用；将SPE置于25mM柠檬酸缓冲液中用电化学工作站在1.7V的电压下活化180s，然后用超纯水清洗并用氮气干燥以备使用；
(5)电化学检测：取6μL RCA产物在清洁后的AuR和SPE上孵育1h，然后将6μL MCH(2mM)滴加到电极表面以封闭电极防止非特异性结合，随后将电极浸没于含20mM氯化血红素(hemin)的G-四链体形成溶液中，使RCA产物能够结合hemin形成G-四链体/hemin复合物。最后，将制备好的电极、铂丝电极以及Ag/AgCl电极插入DPV检测液中，在电化学工作站上以–0.65V至–0.1V的电位范围内进行DPV检测；
(6)检测标准曲线的绘制：将一系列不同浓度的CEA(0.1pg mL-1、1pg mL-1、10pgmL-1、100pg mL-1、1ng mL-1、10ng mL-1、100ng mL-1、200ng mL-1、500ng mL-1)加入步骤(3)所述的溶液A反应完成后继续转移上清液至溶液B，完成RecJf核酸外切酶辅助的靶标循环反应以及phi29 DNA聚合酶辅助的RCA反应，获得的产物按照步骤(5)进行电化学检测。然后以CEA浓度为横坐标，电流信号响应值为纵坐标，确定传感器在不同基质的电极上(AuR、SPE)的检测范围，再根据肿瘤标志物浓度的对数值确定其与电流信号响应值存在的线性关系并计算检测限。如图2所示，电极表面(AuR如图2中A；SPE如图2中B)电流响应值随着溶液中CEA浓度的增加而增加，在AuR和SPE表面相对应的线性回归方程是I＝0.11lgCCEA+1.49(R2＝0.9987)和I＝0.10lgCCEA+1.78(R2＝0.9971)，该方法检测限分别为6.15fg mL–1和1.26fgmL–1。
实施例2：实际样品中癌胚抗原CEA含量的测定
为了进一步验证所提出的检测策略在测定实际样品中CEA含量的准确性，采用标准加入法研究了制备的传感器在人血清样品中的回收率和相对标准偏差。
将含有不同浓度的CEA(0.1ng mL–1,0.5ng mL–1,1ng mL–1,5ng mL–1,10ng mL–1,25ng mL–1)血清样品加入溶液A反应完成后继续转移上清液至溶液B，完成RecJf核酸外切酶辅助的靶标循环反应以及phi29 DNA聚合酶辅助的RCA反应。取6μL RCA产物在清洁后的AuR和SPE上孵育1h，然后将6μL MCH(2mM)滴加到电极表面以封闭电极防止非特异性结合，随后将电极浸没于含20mM氯化血红素(hemin)的G-四链体形成溶液中，使RCA产物能够结合hemin形成G-四链体/hemin复合物。最后，将制备好的电极、铂丝电极以及Ag/AgCl电极插入DPV检测液中，在电化学工作站上以–0.65V至–0.1V的电位范围内进行DPV检测。具体样品和检测结果如表1所示。
表1
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (6)
1.一种基于双增策略的均质电化学适配体传感器，其特征在于，包括溶液A、溶液B、含氯化血红素的G-四链体形成溶液和检测电极；
其中，溶液A中包括由cDNA、适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJf外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA反应液；
所述cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物在靶标与适配体结合时，cDNA释放，并由RecJf外切酶辅助完成靶循环扩增；
所述RCA反应液包括环状模板DNA、dNTPs以及phi29 DNA聚合酶；
所述环状模板DNA通过如下方法制备得到：
将连接探针与磷酸化的挂锁探针混合后杂交；杂交后在含T4 DNA连接酶的缓冲液中进行挂锁探针的环化；环化后失活T4 DNA连接酶，并消除多余探针；再热处理后得到所述的环状模板DNA；
连接探针为5'-AAT TGA ATA AGC TAC GCA CAG TT-3'；挂锁探针5'p-TTA TTC AATTTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTA ACTGTG CGT AGC-3'。
2.根据权利要求1所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，所述适配体与所述磁珠通过链霉亲和素与生物素进行连接。
3.根据权利要求1所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，所述检测电极包括工作电极、对电极和参比电极。
4.一种用于肿瘤标志物检测的权利要求1所述的基于双增策略的均质电化学适配体传感器，其特征在于，包括溶液A、溶液B、含氯化血红素的G-四链体形成溶液和检测电极；
其中，溶液A中包括由cDNA、肿瘤标志物的适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJf外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA反应液。
5.根据权利要求4所述的均质电化学适配体传感器，其特征在于，肿瘤标志物为癌胚抗原CEA时，癌胚抗原CEA的适配体的序列为：5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT -3'，cDNA序列为SH-(CH2)6-AAT TGA ATA AGC T。
6.一种非诊断目的的肿瘤标志物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将肿瘤标志物的标准溶液加入溶液A中，在35~40 ℃下反应0.5~2 h，磁分离后取上清液，得到反应液；
S2、将S1步骤得到的反应液加入溶液B中进行RCA反应，得到RCA反应液；
S3、向RCA反应液中加入含氯化血红素的G-四链体形成溶液，并在检测电极上进行孵育，并检测电化学信号；
S4、根据标准溶液的浓度与电化学信号的强度绘制标准曲线；
S5、将待检测样本按照S1~S3步骤，测定其电化学信号，代入S4步骤的标准曲线中计算待检测样本中相应的肿瘤标志物的浓度；
其中，溶液A中包括由cDNA、肿瘤标志物的适配体和磁珠组成的cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物和RecJf外切酶，其中，所述cDNA的全部序列与适配体的部分序列互补；溶液B为RCA反应液；
所述cDNA/Apt/MBs磁性生物复合物在靶标与适配体结合时，cDNA释放，并由RecJf外切酶辅助完成靶循环扩增；
所述RCA反应液包括环状模板DNA、dNTPs以及phi29 DNA聚合酶；
所述环状模板DNA通过如下方法制备得到：
将连接探针与磷酸化的挂锁探针混合后杂交；杂交后在含T4 DNA连接酶的缓冲液中进行挂锁探针的环化；环化后失活T4 DNA连接酶，并消除多余探针；再热处理后得到所述的环状模板DNA；
连接探针为5'-AAT TGA ATA AGC TAC GCA CAG TT-3'；挂锁探针5'p-TTA TTC AATTTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTT TTT TTC CCA ACC CGC CCT ACC CTT TTA ACTGTG CGT AGC-3'。
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