CN105452488A - 用于检测hev核酸的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
公开的是用于检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的核酸寡聚体,包括扩增寡聚体,捕捉探针,和检测探针。还公开的是使用所公开的寡聚体进行特异性核酸扩增和检测的方法,以及相应的反应混合物和试剂盒。
Description
相关申请
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2013年8月14日提交的临时申请No.61/865,848和2014年2月18日提交的临时申请No.61/941,303的权益,通过援引将其每一篇的全部内容完整收入本文。
发明背景
戊型肝炎病毒(HEV)是一种单链正义RNA病毒,归入肝病毒科,是肝病毒属的唯一成员,其中哺乳类HEV和鸟类HEV是两种主要已知种类。Daltonetal.,LancetInfect.Dis.8:698-709,2008;Baylisetal.,J.Clin.Microbiol.49:1234-1239,2011。在猪和可能其它哺乳动物中具有储库的哺乳类HEV是人中的急性肝炎的一个主要原因。参见Daltonetal.,见上文。该病毒主要经由粪-口路径传播,而且与发展中国家中的零星感染和流行有关,特别是在具有较差的卫生设施和较弱的公共健康基础设施的地区。在发达国家,认为HEV感染是罕见的,主要在旅行至地方性流行病毒的地区时受到感染的个体中发生。然而,最近,在发达地区更加频繁地报告本土感染,包括北美洲,欧洲,日本,新西兰,和澳大利亚。因此,本土戊型肝炎在发达国家比先前的认识更加常见,而且可能比甲型肝炎更加常见。Daltonetal.,LancetInfect.Dis.8:698-709,2008。
已知HEV的四种主要基因型在人中引起感染。Baylisetal.,见上文。HEV感染的临床特征可以包括轻度至重度肝炎以及亚急性肝衰竭。参见例如Pinaetal.,J.Hepatol.33:826-833,2000;Sainokamietal.,J.Gastroenterol.39:640-648,2004;Tsangetal.,Clin.Infect.Dis.30:618-619,2000;Widdowsonetal.,Clin.Infect.Dis.36:29-33,2003;Daltonetal.,Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.20:784-790,2008。HEV感染在孕妇以及具有预先存在的慢性肝病的个体中具有较差的预后。参见Borkakotietal.,J.Med.Virol.85:620-626,2013;Baylisetal.,见上文。针对具有肝炎症状的患者中的HEV的诊断性测试是重要的,特别是对于已经排除了急性肝炎的其它原因的患者。参见Baylisetal.,见上文;Waaretal.,J.Clin.Virol.33:145-149,2005。
因而,对用于以高特异性和灵敏度检测标本中HEV的存在或缺失的组合物,试剂盒,和方法存在需要。此类组合物,试剂盒,和方法对于HEV的诊断,筛选和/或监测血液或血浆捐献中HEV的存在,或监测患者对治疗的响应会是特别有用的。本发明满足这些和其它需要。
发明概述
在一个方面,本发明提供用于测定样品中戊型肝炎病毒(HEV)的存在或缺失的至少两种寡聚体的组合。所述寡聚体组合包括至少两种用于扩增HEV靶核酸的靶区的互补核酸链的扩增寡聚体,其中
(a)至少一种扩增寡聚体选自(i)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:63的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:26的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和(ii)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;且
(b)至少一种扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:47的序列中含有的约17至约28个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:25的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
上文(a)中规定的合适的扩增寡聚体包括包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,SEQIDNO:54,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些优选的变化中,(a)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些实施方案中,(a)的扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:13的序列中含有的约14至约20个核苷酸(例如SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,或SEQIDNO:66)。
在某些变化中,(a)中规定的扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物(例如选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物)。在一些实施方案中,(a)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物(例如选自SEQIDNO:29和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物)。
上文(b)中规定的合适的扩增寡聚体包括包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列选自SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,SEQIDNO:49,SEQIDNO:50,SEQIDNO:51,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些优选的变化中,(b)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:24和SEQIDNO:56的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在其它优选的变化中,(b)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
在一些实施方案中,上文所述至少两种寡聚体的组合包括(a)(i)中规定的扩增寡聚体和(a)(ii)中规定的扩增寡聚体。在一些此类实施方案中,(a)(i)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在某些优选的变化中,(a)(i)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
在包含(a)(i)中规定的扩增寡聚体和(a)(ii)中规定的扩增寡聚体的某些实施方案中,(a)(ii)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,和SEQIDNO:54的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在某些优选的变化中,(a)(ii)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在特定变化中,(I)(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;或(II)(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29或SEQIDNO:31的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在一些实施方案中,上文所述至少两种寡聚体的组合包括(a)(ii)中规定的第一扩增寡聚体和(a)(ii)中规定的第二扩增寡聚体。在一些此类实施方案中,(a)(ii)中的第一和第二扩增寡聚体均包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物(例如选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物)。在某些变化中,(a)(ii)的第一和第二扩增寡聚体均包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在特定变化中,(a)(ii)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(a)(ii)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在上文所述寡聚体组合的一些实施方案中,所述组合包括(b)中规定的第一和第二扩增寡聚体。在一些此类实施方案中,(b)的第一扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:24和SEQIDNO:56的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在其它实施方案中,(b)的第一扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在特定变化中,(I)(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;或(II)(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:23或SEQIDNO:51的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:45的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
上文所述寡聚体组合可以包括(a)(i)中的扩增寡聚体,(a)(ii)中的扩增寡聚体,(b)中的第一扩增寡聚体,和(b)中的第二扩增寡聚体。在一种特定变化中,(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在另一种变化中,(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
上文所述寡聚体组合可以包括(a)(ii)中的第一扩增寡聚体,(a)(ii)中的第二扩增寡聚体,(b)中的第一扩增寡聚体,和(b)中的第二扩增寡聚体。在一种特定变化中,(a)(ii)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(a)(ii)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:46的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在上文所述寡聚体组合的还有其它实施方案中,(a)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,且(b)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:24和SEQIDNO:56的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些此类实施方案中,所述组合包括一套第一,第二,和第三扩增寡聚体,它们分别包含一套第一,第二,和第三靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自如下所述(i)-(vi)套:(i)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:24,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(ii)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(iii)SEQIDNO:29,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(iv)SEQIDNO:66,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(v)SEQIDNO:65,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;和(vi)SEQIDNO:62,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
在一些实施方案中,上文所述寡聚体组合包括一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自如下所述(i)-(xiv)套:
(i)(A)SEQIDNO:54,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:52,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xiii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,41,52,44,45,46,或47,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiv)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些实施方案中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。在特定变化中,该套靶杂交序列A和B选自如下所述(i)-(xiii)套:
(i)(A)SEQIDNO:54,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,56,48,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,24,45,56,或50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,24,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiii)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在仍有其它实施方案中,上文所述寡聚体组合包括一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自如下所述(i)-(x)套:
(i)(A)SEQIDNO:48,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,52,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(x)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些实施方案中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。在特定变化中,该套靶杂交序列A和B选自如下所述(i)-(ix)套:
(i)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,61,62,64,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:33,34,35,62,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:54,62,或64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(ix)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,33,34,35,53,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在上文所述寡聚体组合的一些实施方案中,(b)中的扩增寡聚体为启动子引物,其进一步包括位于靶杂交序列5'的启动子序列(例如T7启动子序列)。一种特别合适的启动子序列为具有SEQIDNO:73中所示序列的T7启动子序列。
在某些实施方案中,寡聚体组合进一步包括至少一种检测探针寡聚体。在特定实施方案中,所述检测探针寡聚体包括如下靶杂交序列,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。在特定变化中,所述检测探针靶杂交序列选自SEQIDNO:37,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。检测探针寡聚体可以在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
在一些变化中,寡聚体组合包括至少两种检测探针寡聚体。例如,寡聚体组合可以包括至少两种包含如下靶杂交序列的检测探针寡聚体,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。在一些此类实施方案中,检测探针靶杂交序列均个别选自SEQIDNO:37,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。在一种特定变化中,寡聚体组合包括第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:55或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在其它变化中,所述寡聚体组合包括至少三种检测探针寡聚体。例如,至少三种检测探针寡聚体可以包括第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:37或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和第三检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:71或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。至少两种检测探针寡聚体中的一种或多种(例如每种)可以在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
在一些实施方案中,寡聚体组合进一步包括包含如下靶杂交序列的捕捉探针寡聚体,该靶杂交序列共价附着至结合固定化探针的序列或模块。特别合适的靶杂交序列包括SEQIDNO:4和SEQIDNO:42中所示序列,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。在包含SEQIDNO:4的靶杂交序列的一些变化中,SEQIDNO:4第20位处的核碱基为腺嘌呤(A)。在一些此类变化中,SEQIDNO:4第19位处的核碱基为胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。在更加特定变化中,所述捕捉探针寡聚体具有选自SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。在某些实施方案中,寡聚体组合进一步包括至少两种或至少三种上文所述捕捉探针寡聚体。例如,寡聚体组合可以包括第一捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:2或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;第二捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:6或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和第三捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:42或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在一种更加特定变化中,所述第一,第二,和第三捕捉探针寡聚体分别具有SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。
在其它方面,本发明提供一种试剂盒或一种反应混合物,其包含上文所述寡聚体组合。
在还有另一方面,本发明提供一种用于测定样品中戊型肝炎病毒(HEV)的存在或缺失的方法。所述方法一般包括下述步骤:(1)使怀疑含有HEV的样品与至少两种用于扩增HEV靶核酸的靶区的寡聚体接触;(2)实施体外核酸扩增反应,其中使用样品中存在的任何HEV靶核酸作为模板来生成扩增产物;并(3)检测扩增产物的存在或缺失,由此测定所述样品中HEV的存在或缺失。所述至少两种扩增寡聚体包括
(a)至少一种选自下述的扩增寡聚体:(i)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:63的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:26的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和(ii)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;和
(b)至少一种包含如下靶杂交序列的扩增寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:47的序列中含有的约17至约28个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:25的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
上文(a)中规定的合适的扩增寡聚体包括包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,SEQIDNO:54,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些优选的变化中,(a)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些实施方案中,(a)的扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:13的序列中含有的约14至约20个核苷酸(例如SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,或SEQIDNO:66)。
在用于测定HEV的存在或缺失的方法的某些变化中,(a)中规定的扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物(例如选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物)。在一些实施方案中,(a)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物(例如选自SEQIDNO:29和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物)。
上文(b)中规定的合适的扩增寡聚体包括包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列选自SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,SEQIDNO:49,SEQIDNO:50,SEQIDNO:51,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些优选的变化中,(b)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:24和SEQIDNO:56的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在其它优选的变化中,(b)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
在上文所述用于测定HEV的存在或缺失的方法的一些实施方案中,所述至少两种扩增寡聚体包括(a)(i)中规定的扩增寡聚体和(a)(ii)中规定的扩增寡聚体。在一些此类实施方案中,(a)(i)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在某些优选的变化中,(a)(i)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
在使用(a)(i)中规定的扩增寡聚体和(a)(ii)中规定的扩增寡聚体来扩增HEV靶区的方法的某些实施方案中,(a)(ii)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,和SEQIDNO:54的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在某些优选的变化中,(a)(ii)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在特定变化中,(I)(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;或(II)(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29或SEQIDNO:31的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在上文所述用于测定HEV的存在或缺失的方法的一些实施方案中,上文所述至少两种寡聚体的组合包括(a)(ii)中规定的第一扩增寡聚体和(a)(ii)中规定的第二扩增寡聚体。在一些此类实施方案中,(a)(ii)中的第一和第二扩增寡聚体均包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物(例如选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物)。在某些变化中,(a)(ii)的第一和第二扩增寡聚体均包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在特定变化中,(a)(ii)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(a)(ii)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在上文所述方法的一些实施方案中,所述扩增步骤利用(b)中规定的第一和第二扩增寡聚体。在一些此类实施方案中,(b)的第一扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:24和SEQIDNO:56的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在其它实施方案中,(b)的第一扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在特定变化中,(I)(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;或(II)(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:23或SEQIDNO:51的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:45的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
为了在上文所述方法中扩增HEV靶区,可以使用(a)(i)中的扩增寡聚体,(a)(ii)中的扩增寡聚体,(b)中的第一扩增寡聚体,和(b)中的第二扩增寡聚体。在一种特定变化中,(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在另一种变化中,(a)(i)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(a)(ii)的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
在上文所述方法中扩增HEV靶区的其它实施方案中,可以使用(a)(ii)中的第一扩增寡聚体,(a)(ii)中的第二扩增寡聚体,(b)中的第一扩增寡聚体,和(b)中的第二扩增寡聚体。在一种特定变化中,(a)(ii)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(a)(ii)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;(b)的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且(b)的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:46的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在上文所述用于测定HEV的存在或缺失的方法的还有其它实施方案中,(a)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:29,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,且(b)的扩增寡聚体包含选自SEQIDNO:24和SEQIDNO:56的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在一些此类实施方案中,所述扩增步骤使用包括一套第一,第二,和第三扩增寡聚体的寡聚体组合,它们分别包含一套第一,第二,和第三靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自如下所述(i)-(vi)套:(i)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:24,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(ii)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(iii)SEQIDNO:29,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(iv)SEQIDNO:66,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;(v)SEQIDNO:65,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;和(vi)SEQIDNO:62,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。
在一些实施方案中,所述扩增步骤使用包括一套第一和第二扩增寡聚体的寡聚体组合,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自如下所述(i)-(xiv)套:
(i)(A)SEQIDNO:54,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:52,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xiii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiv)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些实施方案中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。在特定变化中,该套靶杂交序列A和B选自如下所述(i)-(xiii)套:
(i)(A)SEQIDNO:54,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,56,48,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,24,45,56,或50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,24,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiii)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在仍有其它实施方案中,所述扩增步骤使用包括一套第一和第二扩增寡聚体的寡聚体组合,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自如下所述(i)-(x)套:
(i)(A)SEQIDNO:48,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,52,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(x)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在包含具有SEQIDNO:56的靶杂交序列的扩增寡聚体的某些实施方案中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)(即SEQIDNO:46,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物)。在特定变化中,该套靶杂交序列A和B选自如下所述(i)-(ix)套:
(i)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,61,62,64,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:33,34,35,62,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:54,62,或64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(ix)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,33,34,35,53,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
在上文所述用于测定HEV的存在或缺失的方法的一些实施方案中,(b)中的扩增寡聚体为启动子引物,其进一步包括位于靶杂交序列5'的启动子序列(例如T7启动子序列)。一种特别合适的启动子序列为具有SEQIDNO:73中所示序列的T7启动子序列。
典型地,所述用于测定HEV的存在或缺失的方法进一步包括在扩增步骤(1)之前自样品中的其它成分纯化HEV靶核酸。在特定实施方案中,所述纯化步骤包括使所述样品与至少一种包含如下靶杂交序列的捕捉探针寡聚体接触,该靶杂交序列共价附着至结合固定化探针的序列或模块。特别合适的靶杂交序列包括SEQIDNO:4和SEQIDNO:42中所示序列,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。在包含使用SEQIDNO:4的靶杂交序列的方法的一些变化中,SEQIDNO:4第20位处的核碱基为腺嘌呤(A)。在一些此类变化中,SEQIDNO:4第19位处的核碱基为胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。在更加特定变化中,所述捕捉探针寡聚体具有选自SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。在某些实施方案中,所述纯化步骤包括使用上文所述至少两种或至少三种捕捉探针寡聚体。例如,所述纯化步骤可以包括使用第一捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:2或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;第二捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:6或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和第三捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:42或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在一种更加特定变化中,所述第一,第二,和第三捕捉探针寡聚体分别具有SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。
在一些实施方案中,所述检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与至少一种配置成在测定扩增产物的存在或缺失的条件下与扩增产物特异性杂交的检测探针寡聚体接触,由此测定所述样品中HEV的存在或缺失。在特定实施方案中,所述检测探针寡聚体包括长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交的靶杂交序列。在特定变化中,所述检测探针靶杂交序列选自SEQIDNO:37,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。检测探针寡聚体可以在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
在一些变化中,所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应与至少两种检测探针寡聚体接触。例如,可以使所述体外核酸扩增反应与至少两种包含如下靶杂交序列的检测探针寡聚体接触,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。在一些此类实施方案中,检测探针靶杂交序列均个别选自SEQIDNO:37,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。在一种特定变化中,所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应接触第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:55或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在其它变化中,所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应与至少三种检测探针寡聚体接触。所述至少三种检测探针寡聚体可以包括第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:37或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和第三检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:71或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。所述至少两种检测探针寡聚体中的一种或多种(例如每种)可以在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
在利用检测探针寡聚体的方法的一些实施方案中,所述检测探针包括至少一种标记物。在特定变化中,所述一种或多种标记物选自化学发光标记物,发荧光标记物,淬灭剂,或其任意组合。在某些实施方案中,所述检测步骤(3)在同质检测系统中检测至少一种带标记物的检测探针寡聚体与扩增产物的杂交。一种对于在同质检测系统中使用特别合适的标记物是在所述至少一种检测探针寡聚体的两个核碱基之间连接的化学发光吖啶(acridinium)酯(AE)化合物。
在上文所述用于测定HEV的存在或缺失的方法的某些变化中,步骤(2)处的扩增反应为等温扩增反应,诸如例如转录介导的扩增(TMA)反应。
本发明的这些和其它方面在阅读下述发明详述和附图之后会变得明显。
定义
除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与所描述的方法和组合物所属领域的普通技术人员的普遍理解相同的含义。如本文中使用的,下述术语和短语具有归于它们的含义,除非另有规定。
术语“一个/一种”和“该/所述”包括复数指示物,除非上下文另有清楚指示。例如,如本文中使用的,“一种核酸”理解为表示一种或多种核酸。如此,术语“一个/一种”,“一个或多个/一种或多种”,和“至少一个/至少一种”可以在本文中互换使用。
“样品”包括任何可能含有戊型肝炎病毒(HEV)(包括例如HEV基因型1,2,3,或4中的任一种)或其成分(诸如核酸或核酸片段)的标本。样品包括“生物学样品”,它们包括任何自活的或死的人衍生,可能含有HEV或自其衍生的靶核酸的组织或材料,包括例如外周血,血浆,血清,淋巴结,胃肠组织(例如肝),或其它体液或身体材料。可以处理生物学样品以物理或机械破坏组织或细胞结构,由此将细胞内成分释放入可以进一步含有酶,缓冲剂,盐,去污剂等等的溶液中,它们用于使用标准方法制备生物学样品,供分析用。还有,样品可以包括经过加工的样品,诸如那些自使样品流过或流经过滤装置,或在离心后,或通过粘附至介质,基质,或支持物获得的。
“核酸”指包含两个或更多个成共价键的具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷或核苷类似物的多聚体化合物,其中核苷通过磷酸二酯键或其它联接连接到一起以形成多核苷酸。核酸包括RNA,DNA,或嵌合DNA-RNA聚合体或寡核苷酸,及其类似物。核酸“主链”可以由多种联接构成,包括一种或多种糖-磷酸二酯联接,肽-核酸键(在“肽核酸”或PNA中,参见例如国际专利申请公开文本No.WO95/32305),硫代磷酸酯联接,甲基膦酸酯联接,或其组合。核酸的糖模块可以是核糖或脱氧核糖任一,或具有已知取代的类似化合物,诸如例如2'-甲氧基取代和2'-卤化物取代(例如2'-F)。含氮碱基可以是常规碱基(A,G,C,T,U),其类似物(例如肌苷,5-甲基异胞嘧啶,异鸟嘌呤;参见例如TheBiochemistryoftheNucleicAcids5-36,Adamsetal.,ed.,11thed.,1992;Abrahametal.,2007,BioTechniques43:617-24),它们包括嘌呤或嘧啶碱基的衍生物(例如N4-甲基脱氧鸟苷,脱氮或氮杂嘌呤,脱氮或氮杂嘧啶,在5或6位具有取代基团的嘧啶碱基,在2,6和/或8位具有改变的或替换取代基的嘌呤碱基,诸如2-氨基-6-甲基氨基嘌呤,O6-甲基鸟嘌呤,4-硫-嘧啶,4-氨基-嘧啶,4-二甲基肼-嘧啶,和O4-烷基-嘧啶,和吡唑-化合物,诸如未取代的或3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶;美国专利No.5,378,825,No.6,949,367和国际专利申请公开文本No.WO93/13121,通过援引将每一篇收入本文)。核酸可以包括“无碱基”残基,其中主链的一个或多个残基不包括含氮碱基(参见例如美国专利No.5,585,481,通过援引收入本文)。核酸可以只包含在RNA和DNA中找到的常规糖,碱基,和联接,或者可以包括常规成分和取代(例如通过2'-甲氧基主链连接的常规碱基,或包括常规碱基和一种或多种碱基类似物的混合物的核酸)。核酸可以包括“锁定核酸”(LNA),其中一个或多个核苷酸单体具有在RNA中锁定的双环呋喃糖单元来模拟糖构象,它增强针对单链RNA(ssRNA),单链DNA(ssDNA),或双链DNA(dsDNA)中的互补序列的杂交亲和力(Vesteretal.,Biochemistry43:13233-41,2004,通过援引收入本文)。核酸可以包括经过修饰的碱基以改变核酸的功能或行为,例如添加3'端双脱氧核苷酸以阻断另外的核苷酸添加至核酸。用于在体外生成核酸的合成方法是本领域公知的,尽管可以使用常规技术自天然来源纯化核酸。
如本文中使用的,术语“多核苷酸”表示核酸链。贯穿本申请,核酸以5'端至3'端表示。合成核酸,例如DNA,RNA,DNA/RNA嵌合物(包括其中包括非天然核苷酸或类似物时),通常是“3'至5'”合成的,即将核苷酸添加至生长中的核酸的5'端。
如本文中使用的,“核苷酸”是由磷酸基团,五碳糖,和含氮碱基(本文中也称作“核碱基”)组成的核酸亚单元。在RNA中找到的五碳糖是核糖。在DNA中,五碳糖是2'-脱氧核糖。该术语还包括此类亚单元的类似物,诸如在核糖的2'位处的甲氧基基团(本文中也称作“2'-O-Me”或“2'-甲氧基”)。如本文中使用的,含有“T”残基的甲氧基寡核苷酸具有在核糖模块的2'位处的甲氧基基团,和在核苷酸的碱基位置处的尿嘧啶。
如本文中使用的,“非核苷酸单元”是没有显著参与聚合体的杂交的单元。此类单元不得参与例如与核苷酸形成任何显著氢键,而且会排除具有五种核苷酸碱基或其类似物之一作为成分的单元。
如本文中使用的,“靶核酸”是包含要扩增的靶序列的核酸。靶核酸可以是本文所述DNA或RNA,而且可以是单链或双链任一。靶核酸可以包括靶序列以外的其它序列,它们可以不受扩增。
如本文中使用的,术语“靶序列”指靶核酸中要扩增和/或检测的特定核苷酸序列。“靶序列”包括在扩增过程(例如TMA)期间寡核苷酸(例如引发寡核苷酸和/或启动子寡核苷酸)与其复合的复合序列。在靶核酸最初是单链的情况中,术语“靶序列”还会指与靶核酸中存在的“靶序列”互补的序列。在靶核酸最初是双链的情况中,术语“靶序列”指有义(+)和反义(-)链二者。
“靶杂交序列”在本文中用于指寡聚体中配置成与靶核酸序列杂交的部分。优选地,靶杂交序列配置成与靶核酸序列特异性杂交。靶杂交序列可以但并非必须与靶序列中它们配置成与之杂交的部分100%互补。靶杂交序列还可以包括相对于靶序列插入的,删除的和/或替代的核苷酸残基。可以出现少于100%的靶杂交序列与靶序列的互补性,例如当靶核酸是一个种类内的多数株的时候,诸如将寡聚体配置成与HEV的各种基因型杂交的情况。理解的是,存在其它原因将靶杂交序列配置成具有少于100%的与靶核酸的互补性。
如本文中提到HEV核酸的区使用的,术语“靶向一种序列”指寡核苷酸与靶序列以容许本文所述扩增和检测的方式杂交的过程。在一个优选实施方案中,寡核苷酸与靶定的HEV核酸序列互补且不含错配。在另一个优选实施方案中,寡核苷酸与靶定的HEV核酸序列互补但含有1,2,3,4,或5处错配。优选地,与HEV核酸序列杂交的寡核苷酸包括至少10至多至50个与靶序列互补的核苷酸。理解的是,至少10和多至50是包含范围,使得包括10,50和它们之间的每个整数。优选地,寡聚体与靶序列特异性杂交。
术语“配置成”表示提到的寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际安排。例如,配置成自靶序列生成规定扩增子的扩增寡聚体具有与靶序列杂交且能用于扩增反应以生成扩增子的多核苷酸序列。还例如,配置成与靶序列特异性杂交的寡核苷酸具有在严格杂交条件下与提到的序列特异性杂交的多核苷酸序列。
如本文中使用的,术语“配置成与……特异性杂交”意味着扩增寡核苷酸,检测探针,或其它寡核苷酸的靶杂交区设计成具有能靶向提到的HEV靶区的序列的多核苷酸序列。此类寡核苷酸不限于仅仅靶向该序列,而是作为用于靶向HEV靶核酸的组合物,在用于靶向HEV靶核酸的试剂盒中,或在用于靶向HEV靶核酸的方法中有用。寡核苷酸设计成作为用于自样品扩增和检测HEV的测定法的成分发挥功能,并且因此设计成在测试样品中通常找到的其它核酸存在下靶向HEV。“与……特异性杂交”并不意味着排他的杂交,因为可以发生一些低水平的与非靶核酸的杂交,正如本领域中理解的。而是说,“与……特异性杂交”意味着寡核苷酸配置成在测定法中发挥功能,主要是与靶杂交,使得能测定样品中靶核酸的精确检测。
如本文中提到HEV靶定核酸使用的,术语“片段”指一段连续核酸。在某些实施方案中,片段包括来自与SEQINNO:1对应的HEVRNA的连续核苷酸,其中片段中连续核苷酸的数目少于与SEQIDNO:1对应的完整序列的连续核苷酸的数目。
如本文中使用的,术语“区”指核酸的一部分,其中所述部分比完整核酸要小。例如,当提到的核酸是寡核苷酸启动子引物时,术语“区”可以用于指整个寡核苷酸的更小启动子部分。类似地,而且也是仅仅作为例子,当核酸是HEVRNA时,术语“区”可以用于指核酸的更小区域,其中所述更小区域受到本发明的一种或多种寡核苷酸靶定。作为另一个非限制性例子,当提到的核酸是扩增子时,术语区可以用于指为探针的靶杂交序列的杂交鉴定的更小核苷酸序列。
可互换的术语“寡聚体”,“寡聚物”,和“寡核苷酸”指具有一般少于1,000个核苷酸(nt)残基的核酸,包括具有下限约5个nt残基和上限约500至900个nt残基的范围中的聚合体。在一些实施方案中,寡核苷酸在具有下限约12至15个nt和上限约50至600个nt的尺寸范围中,而其它实施方案在具有下限约15至20个nt和上限约22至100个nt的范围中。寡核苷酸可以自天然发生来源纯化,或者可以使用多种公知的酶促或化学方法任一合成。优选地,寡核苷酸是使用例如DNA合成仪和相关化学合成的(例如ABI3900,LifeTechnologies,FosterCity,CA)。在一个方面,合成的扩增寡聚体可以是使用自动化合成仪和亚磷酰胺(phosphoramidite)化学合成的寡核苷酸。在一个方面,合成的寡核苷酸是使用亚磷酰胺化学生成的,而且大多数3’端羟基基团共价结合至固体支持物。固体支持物包括但不限于受控孔径玻璃(CPG)和大孔聚苯乙烯(MPPS)。在一个方面,合成的寡核苷酸是使用亚磷酰胺化学生成的,而且亚磷酰胺构建块具有附着至它们的官能团的保护基团。反应性基团包括但不限于二甲氧基三苯甲基(DMT),叔丁基二甲基甲硅烷基基团(TBDMS),三异丙基甲硅烷基氧基甲基基团(TOM),和2-氰乙基基团。术语寡核苷酸并不将任何特定功能指向试剂;而是说,它一般用于涵盖本文所述所有此类试剂。寡核苷酸可以承担多种不同功能。例如,如果它是对互补链特异性的且能够与互补链杂交,而且在核酸聚合酶存在下能被进一步延伸的话,它可以发挥引物功能;如果它含有RNA聚合酶识别的序列且容许转录的话,它可以发挥引物功能并提供启动子(例如T7引物);而且,如果它能够与靶核酸或其扩增子杂交且进一步提供可检测模块(例如吖啶酯化合物)的话,它可以发挥检测靶核酸的功能。
如本文中使用的,与规定的参照核酸序列“基本上对应的”寡核苷酸意味着寡核苷酸与参照核酸序列足够相似,使得寡核苷酸具有与参照核酸序列相似的杂交特性,即它会在严格杂交条件下与相同靶核酸序列杂交。本领域技术人员会领会,“基本上对应的寡核苷酸”可以与参照序列不同且仍然与相同靶核酸序列杂交。还理解的是,与第二核酸对应的第一核酸包括其RNA或DNA等同物以及其DNA/RNA嵌合物,而且包括其互补物,除非上下文另有清楚指示。核酸的这种变化可以就序列内相同碱基的百分比或探针或引物和它的靶序列之间完美互补碱基的百分比而言进行表述。如此,在某些实施方案中,如果这些碱基同一性或互补性的百分比为100%至约80%的话,寡核苷酸与参照核酸序列“基本上对应”。在优选实施方案中,百分比为100%至约85%。在更加优选实施方案中,此百分比为100%至约90%;在其它优选实施方案中,此百分比为100%至约95%。类似地,核酸或扩增的核酸的区在本文中可以称作与参照核酸序列对应。本领域技术人员会理解容许与特定靶序列杂交且不引起不可接受水平的非特异性杂交的各种百分比的互补性可能需要的对杂交条件的各种变更。
如本文中使用的,提到DNA序列的短语“或其互补物,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物”(在提到的DNA序列以外)包括DNA序列的互补物,提到的DNA序列的RNA等同物,提到的DNA序列的互补物的RNA等同物,提到的DNA序列的DNA/RNA嵌合物,和提到的DNA序列的互补物的DNA/RNA嵌合物。类似地,提到RNA序列的短语“或其互补物,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物”(在提到的RNA序列以外)包括RNA序列的互补物,提到的RNA序列的DNA等同物,提到的RNA序列的互补物的DNA等同物,提到的RNA序列的DNA/RNA嵌合物,和提到的RNA序列的互补物的DNA/RNA嵌合物。
如本文中使用的,“封闭模块”是用于“封闭”寡核苷酸或其它核酸的3'端,使得它不能被核酸聚合酶有效延伸的物质。并非意图被核酸聚合酶延伸的寡聚体可以包括封闭者基团替换3'OH以在扩增反应中阻止酶介导的寡聚体延伸。例如,扩增期间存在的被封闭的扩增寡聚体和/或检测探针可以不具有功能性3'OH,而是包括一个或多个位于3'末端或附近的封闭基团。在一些实施方案中,在3'末端附近的封闭基团可以在3'末端的五个残基内且大得足以限制聚合酶结合寡聚体。在其它实施方案中,封闭基团共价附着至3'端。可以使用许多不同化学基团来封闭3'末端,例如烷基基团,非核苷酸接头,链烷-二醇双脱氧核苷酸残基,和蛹虫草菌素(cordycepin)。
“扩增寡聚体”是至少其3'末端与靶核酸互补,而且与靶核酸或其互补物杂交并参与核酸扩增反应的寡聚体。扩增寡聚体的一个例子是与靶核酸杂交且含有在扩增过程中由聚合酶延伸的3'OH末端的“引物”。扩增寡聚体的另一个例子是并不由聚合酶延伸(例如因为它具有3'被封闭的末端)但参与或推动扩增的寡聚体。例如,扩增寡核苷酸的5'区可以包括与靶核酸不互补的启动子序列(它可以称作“启动子引物”或“启动子提供者”)。本领域技术人员会理解,可以修饰发挥引物功能的扩增寡聚体以包括5'启动子序列,并如此发挥启动子引物功能。引入3'被封闭的末端进一步修饰启动子引物,它现在能够与靶核酸杂交并提供用于起始转录的上游启动子序列,但是不提供用于寡聚物延伸的引物。此类经过修饰的寡聚物在本文中称作“启动子提供者”寡聚体。扩增寡核苷酸的尺寸范围包括那些长约10至约70个nt(不包括任何启动子序列或聚A尾)且含有与靶核酸序列(或其互补链)的区互补的至少约10个连续碱基,或甚至至少12个连续碱基的。连续碱基与扩增寡聚体与之结合的靶序列至少80%,或至少90%,或完全互补。扩增寡聚体可以任选包括经过修饰的核苷酸或类似物,或参与扩增反应但不与靶核酸或模板序列互补或靶核酸或模板序列中不含有的另外的核苷酸。理解的是,当提到寡核苷酸,扩增子,或其它核酸的长度范围时,所述范围包含所有整数(例如长19-25个连续核苷酸包括19,20,21,22,23,24和25个)。
如本文中使用的,“启动子”是被DNA依赖性RNA聚合酶(“转录酶”)识别为结合核酸并在特定位点开始RNA转录的信号的特定核酸序列。
如本文中使用的,“启动子提供者”或“提供者”指包含第一和第二区且经过修饰以阻止自其3'端起始DNA合成的寡核苷酸。启动子提供者寡核苷酸的“第一区”包含与DNA模板杂交的碱基序列,其中杂交序列位于3',但是并非必须与启动子区相邻。启动子寡核苷酸的杂交部分通常长至少10个核苷酸,而且可以延伸多至长50或更多个核苷酸。“第二区”包含用于RNA聚合酶的启动子序列。改造启动子寡核苷酸,使得它不能被RNA或DNA依赖性DNA聚合酶(例如逆转录酶)延伸,优选如上所述在其3'端包含封闭模块。如本文中提到的,“T7提供者”是提供受到T7RNA聚合酶识别的寡核苷酸序列的被封闭的启动子提供者寡核苷酸。
“终止寡核苷酸”是包含与靶核酸内邻近靶区5'末端的序列基本上互补的碱基序列,从而“终止”包括引发寡核苷酸的初生核酸的引物延伸,由此为初生核酸链提供限定的3'末端的寡核苷酸。终止寡核苷酸设计成在足以为初生核酸链实现期望3'末端的位置与靶核酸杂交。终止寡核苷酸的定位是灵活的,取决于它的设计。终止寡核苷酸可以是经过修饰的或未经修饰的。在某些实施方案中,用至少一个或多个2'-O-ME核糖核苷酸合成终止寡核苷酸。这些经过修饰的核苷酸已经展现较高的互补双链体热稳定性。2'-O-ME核糖核苷酸还发挥提高寡核苷酸对外切核酸酶的抗性的功能,由此延长经过修饰的寡核苷酸的半衰期(参见例如Majlessietal.,NucleicAcidsRes.26:2224-9,1988,通过援引收入本文)。作为2'-O-Me核糖核苷酸的补充或替换,可以利用本文中其它部分描述的其它修饰。例如,终止寡核苷酸可以包含PNA或LNA(参见例如Petersenetal.,J.Mol.Recognit.13:44-53,2000,通过援引收入本文)。本发明的终止寡核苷酸通常在它的3'端包括封闭模块以阻止延伸。终止寡核苷酸还可以包含连接至寡核苷酸的蛋白质或肽,从而终止聚合酶对初生核酸链的进一步延伸。本发明的终止寡核苷酸通常长至少10个碱基,而且可以延伸到长多至15,20,25,30,35,40,50或更多个核苷酸。虽然终止寡核苷酸通常或必然包括3'-封闭模块,但是“3'被封闭的”寡核苷酸并非必然是终止寡核苷酸。
“扩增”指用于获得多个拷贝的靶核酸序列或其互补物或其片段的任何已知规程。多个拷贝可以称作扩增子或扩增产物。“片段”的扩增指生成含有少于完整的靶核酸或其互补物的扩增的核酸,例如通过使用与靶核酸的内部位置杂交并自靶核酸的内部位置起始聚合的扩增寡核苷酸生成的。已知的扩增方法包括例如复制酶介导的扩增,聚合酶链式反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),链置换扩增(SDA),和转录介导的或转录相关的扩增。复制酶介导的扩增使用自我复制性RNA分子,和复制酶诸如QB复制酶(参见例如美国专利No.4,786,600,通过援引收入本文)。PCR扩增使用DNA聚合酶,引物对,和热循环来合成dsDNA的两条互补链的多个拷贝或自cDNA合成多个拷贝(参见例如美国专利No.4,683,195;No.4,683,202;和No.4,800,159;通过援引将每一篇收入本文)。LCR扩增通过使用多个循环的杂交,连接,和变性使用四种或更多种不同寡核苷酸来扩增靶和其互补链(参见例如美国专利No.5,427,930和No.5,516,663,通过援引将每一篇收入本文)。SDA使用含有限制性内切核酸酶的识别位点的引物和在包括靶序列的半修饰的DNA双链体的一条链中产生缺刻的内切核酸酶,由此以一系列引物延伸和链置换步骤发生扩增(参见例如美国专利No.5,422,252;No.5,547,861;和No.5,648,211;通过援引将每一篇收入本文)。
“转录相关的扩增”或“转录介导的扩增”(TMA)指使用RNA聚合酶自核酸模板生成多个RNA转录物的核酸扩增。这些方法一般采用RNA聚合酶,DNA聚合酶,脱氧核糖核苷三磷酸,核糖核苷三磷酸,和包括启动子序列的模板互补性寡核苷酸,而且任选可以包括一种或多种其它寡核苷酸。TMA方法和单引物转录相关的扩增方法是本文所述用于检测HEV靶序列的扩增方法的实施方案。转录相关的扩增的变化是本领域公知的,如先前详细公开的(参见例如美国专利No.4,868,105;No.5,124,246;No.5,130,238;No.5,399,491;No.5,437,990;No.5,554,516;和No.7,374,885;和国际专利申请公开文本No.WO88/01302;No.WO88/10315;和No.WO95/03430;通过援引将每一篇收入本文)。本领域普通技术人员会领会,所公开的组合物可以用于基于聚合酶对寡聚体序列的延伸的扩增方法。
如本文中使用的,术语“实时TMA”指通过实时检测手段监测的对靶核酸的单引物转录介导的扩增(“TMA”)。
如本文中使用的,术语“扩增子”或“扩增产物”指扩增规程期间生成的与靶序列内含有的序列互补或同源的核酸分子。扩增子的互补或同源序列在本文中有时称作“靶特异性序列”。使用本发明的扩增寡聚体生成的扩增子可以包含非靶特异性序列。扩增子可以是双链或单链的,而且可以包括DNA,RNA,或二者。例如,DNA依赖性RNA聚合酶在转录介导的扩增规程期间自双链DNA转录单链扩增子。这些单链扩增子是RNA扩增子,而且可以是双链复合物的任一链,取决于扩增寡聚体是如何配置的。如此,扩增子可以是单链RNA。RNA依赖性DNA聚合酶合成与RNA模板互补的DNA链。如此,扩增子可以是双链DNA和RNA杂合体。RNA依赖性DNA聚合酶常常包括RNA酶活性,或者与RNA酶联合使用,其中RNA酶降解RNA链。如此,扩增子可以是单链DNA。RNA依赖性DNA聚合酶和DNA依赖性DNA聚合酶自DNA模板合成互补DNA链。如此,扩增子可以是双链DNA。RNA依赖性RNA聚合酶自RNA模板合成RNA。如此,扩增子可以是双链RNA。DNA依赖性RNA聚合酶自双链DNA模板合成RNA,也称作转录。如此,扩增子可以是单链RNA。扩增子和用于生成扩增子的方法是本领域技术人员知道的。为本文中方便起见,单链RNA或单链DNA可以呈现由本发明的扩增寡聚体组合生成的扩增子。此类呈现并不意味着将扩增子限于所示呈现。拥有本公开文本的技术人员会使用扩增寡聚体和聚合酶来生成众多类型的扩增子任一,它们都在本发明的精神和范围内。
如本文中使用的,“非靶特异性序列”指寡聚体序列的区,其中所述区并不在标准杂交条件下与靶序列稳定杂交。具有非靶特异性序列的寡聚体包括但不限于启动子引物和分子束。扩增寡聚体可以含有并不与靶或模板序列互补的序列;例如,引物的5'区可以包括与靶核酸不互补的启动子序列(称作“启动子引物”)。本领域技术人员会理解,可以修饰发挥引物功能的扩增寡聚体以包括5'启动子序列,如此发挥启动子引物功能。类似地,可以通过去除启动子序列或在没有启动子序列的情况下合成来修饰启动子引物,仍然发挥引物功能。3'被封闭的扩增寡聚体可以提供启动子序列并充当聚合的模板(称作“启动子提供者”)。如此,由扩增寡聚体成员诸如启动子引物生成的扩增子会包含靶特异性序列和非靶特异性序列。
“检测探针”,“检测寡核苷酸”,和“检测探针寡聚体”可互换使用,指在促进杂交的条件下与核酸中的或扩增的核酸中的靶序列特异性杂交以容许检测靶序列或扩增的核酸的核酸寡聚体。检测可以是直接的(例如与其靶序列直接杂交的探针)或间接的(例如经由中间分子结构与其靶连接的探针)。检测探针可以是DNA,RNA,其类似物或其组合(例如DNA/RNA嵌合物),而且它们可以是经过标记的或未经标记的。检测探针可以进一步包括可选主链联接,诸如例如2'-O-甲基联接。检测探针的“靶序列”一般指较大核酸序列内通过标准碱基配对与探针寡聚体的至少一部分特异性杂交的较小核酸序列区。检测探针可以包含靶特异性序列和有助于探针的三维构象的其它序列(参见例如美国专利No.5,118,801;No.5,312,728;No.6,849,412;No.6,835,542;No.6,534,274;和No.6,361,945;和美国专利申请公开文本No.20060068417;通过援引将每一篇收入本文)。
“稳定的”或“对于检测是稳定的”意味着反应混合物的温度在核酸双链体的解链温度以下至少2℃。
如本文中使用的,“标记物”指直接或间接连接至探针的受到检测或产生可检测信号的模块或化合物。直接标记可以经由将标记物连接至探针的键或相互作用(包括共价键或非共价相互作用,例如氢键,疏水和离子相互作用)或螯合物或配位复合物的形成而发生。间接标记可以经由使用桥接模块或“接头”(诸如结合对成员,抗体或另外的寡聚体)而发生,它是直接或间接标记的,而且可以放大可检测信号。标记物包括任何可检测模块,诸如放射性核素,配体(例如生物素,亲合素),酶或酶底物,反应性基团,或生色团(例如给予可检测颜色的染料,颗粒,或珠),发光化合物(例如生物发光,发磷光,或化学发光标记物),或荧光团。标记物可以是在同质测定法中可检测的,其中混合物中结合的带标记物的探针展现与未结合的带标记物的探针不同的可检测变化,例如不稳定性或差异降解特性。“同质可检测标记物”可以在没有自经过标记的或未经标记的探针的未结合形式物理去除结合形式的情况下检测(参见例如美国专利No.5,283,174;No.5,656,207;和No.5,658,737;通过援引将每一篇收入本文)。标记物包括化学发光化合物,例如吖啶酯(“AE”)化合物,包括标准AE和衍生物(参见例如美国专利No.5,656,207;No.5,658,737;和No.5,639,604;通过援引将每一篇收入本文)。合成和将标记物附着至核酸和检测标记物的方法是公知的(参见例如Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHabor,NY,1989),Chapter10,通过援引收入本文。还可参见美国专利No.5,658,737;No.5,656,207;No.5,547,842;No.5,283,174;和No.4,581,333;通过援引将每一篇收入本文)。特定探针上可以存在超过一种标记物和超过一种类型的标记物,或者检测可以使用探针混合物,其中用产生可检测信号的化合物标记每种探针(参见例如美国专利No.6,180,340和No.6,350,579,通过援引将每一篇收入本文)。
“捕捉探针”,“捕捉寡核苷酸”,和“捕捉探针寡聚体”可互换使用,指通过标准碱基配对与靶核酸中的靶序列特异性杂交且与固定化探针上的结合配偶连接以将靶核酸捕捉至支持物的核酸寡聚体。捕捉寡聚体的一个例子包括两个结合区:序列结合区(例如靶特异性部分)和固定化探针结合区,通常在同一寡聚体上,尽管两个区可以存在于通过一个或多个接头连接到一起的两个不同寡聚体上。捕捉寡聚体的另一个实施方案使用包括随机或非随机聚GU,聚GT,或聚U序列来非特异性结合靶核酸并将它连接至支持物上的固定化探针的靶序列结合区。
如本文中使用的,“固定化寡核苷酸”,“固定化探针”,或“固定化核酸”指直接或间接将捕捉寡聚体连接至支持物的核酸结合配偶。连接至支持物的固定化探针推动自样品中未结合的材料分离捕捉探针结合的靶。固定化探针的一个实施方案是连接至支持物,推动自样品中未结合的材料分离结合的靶序列的寡聚体。支持物可以包括已知材料,诸如溶液中游离的基质和颗粒,它们可以由硝酸纤维素,尼龙,玻璃,聚丙烯酸酯,混合聚合物,聚苯乙烯,硅烷,聚丙烯,金属,或其它组合物制成,其中的一个实施方案是可磁吸引颗粒。支持物可以是单分散磁性球(例如均一尺寸±5%),对其直接(经由共价联接,螯合,或离子相互作用)或间接(经由一个或多个接头)连接固定化探针,其中探针和支持物之间的联接或相互作用在杂交条件期间是稳定的。
“互补”意味着两条单链核酸的相似区或同一单链核酸的两个不同区的核苷酸序列具有容许单链区在严格杂交或扩增条件下在稳定双链成氢键区中杂交到一起的核苷酸碱基组成。彼此杂交的序列可以是通过标准核酸碱基配对(例如G:C,A:T,或A:U配对)与意图的靶序列完全互补或部分互补的。“足够互补”意味着连续序列能够通过在一系列互补碱基之间形成氢键而与另一序列杂交,这可以是在序列中的每个位置通过标准碱基配对互补,或者可以含有一个或多个不互补的残基,包括无碱基残基。足够互补的连续序列通常是与寡聚体意图与之特异性杂交的序列至少80%,或至少90%互补的。“足够互补”的序列容许核酸寡聚体与其靶序列在适宜杂交条件下稳定杂交,即使序列并非完全互补。当一个单链区的连续核苷酸序列能够与另一单链区的类似核苷酸序列形成一系列“规范的”成氢键碱基对,使得A与U或T配对且C与G配对时,核苷酸序列是“完全”互补的(参见例如Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989),§§1.90-1.91,7.37-7.57,9.47-9.51和11.47-11.57,特别是§§9.50-9.51,11.12-11.13,11.45-11.47和11.55-11.57,通过援引收入本文)。理解的是,百分比同一性的范围包含所有整数和分数/小数,例如至少90%包括90,91,93.5,97.687等等。
“优先杂交”或“特异性杂交”意味着在严格杂交测定法条件下,探针与它们的靶序列或其复制物杂交以形成稳定的探针:靶杂合体,同时稳定的探针:非靶杂合体的形成最小化。如此,探针与靶序列或其复制物杂交的程度比对非靶序列要足够大,使得本领域普通技术人员能够精确检测或量化扩增期间形成的靶序列的RNA复制物或互补DNA(cDNA)。适宜的杂交条件是本领域公知的,可以基于序列组成来预测,或者可以通过使用常规测试方法来确定(参见例如Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989),§§1.90-1.91,7.37-7.57,9.47-9.51和11.47-11.57,特别是§§9.50-9.51,11.12-11.13,11.45-11.47和11.55-11.57,通过援引收入本文)。
“核酸杂合体”,“杂合体”,或“双链体”意味着含有双链,成氢键区的核酸结构,其中每条链彼此互补,且其中该区在要通过包括但不限于化学发光或荧光检测,放射自显影,或凝胶电泳的手段检测的严格杂交条件下足够稳定。此类杂合体可以包含RNA:RNA,RNA:DNA,或DNA:DNA双链体分子。
“样品分离”指为了后续扩增和/或检测样品中存在的HEV核酸处理样品的任何步骤或方法。样品可以是多种成分的复杂混合物,其中靶核酸是少数成分。样品制备可以包括自较大样品体积浓缩成分(诸如微生物或核酸)的任何已知方法,诸如通过自较大体积的样品过滤空气传播或水传播的颗粒或使用标准微生物学方法自样品分离微生物。样品制备可以包括物理破坏和/或化学裂解细胞成分以将细胞内成分释放入基本上水或有机相并去除残骸,诸如通过使用过滤,离心或吸附。样品制备可以包括使用选择性或非特异性捕捉靶核酸并将它与其它样品成分分离的核酸寡核苷酸(例如如美国专利No.6,110,678和国际专利申请公开文本No.WO2008/016988中描述的,通过援引将每一篇收入本文)。
“分离”或“纯化”意味着自其它样品成分去除或分离样品的一种或多种成分。样品成分包括通常在一般是水溶液相中的靶核酸,它还可以包括细胞碎片,蛋白质,碳水化合物,脂质,和其它核酸。“分离”或“纯化”并不隐含任何程度的纯化。通常,分离或纯化自其它样品成分去除至少70%,或至少80%,或至少95%的靶核酸。
如本文中使用的,“DNA依赖性DNA聚合酶”是自DNA模板合成互补DNA拷贝的酶。例子是来自大肠杆菌的DNA聚合酶I,噬菌体T7DNA聚合酶,或来自噬菌体T4,Phi-29,M2,或T5的DNA聚合酶。DNA依赖性DNA聚合酶可以是自细菌或噬菌体分离的或重组表达的天然发生酶,或者可以是已经改造成拥有某些期望特征(例如热稳定性,或识别或自各种修饰模板合成DNA链的能力)的修饰或“进化”形式。所有已知的DNA依赖性DNA聚合酶需要互补引物来起始合成。已知在合适条件下DNA依赖性DNA聚合酶可以自RNA模板合成互补DNA拷贝。RNA依赖性DNA聚合酶通常还具有DNA依赖性DNA聚合酶活性。
如本文中使用的,“DNA依赖性RNA聚合酶”或“转录酶”是自具有启动子序列(通常是双链)的双链或部分双链DNA分子合成多个RNA拷贝的酶。RNA分子(“转录物”)以5'至3'方向合成,始于紧邻启动子下游的特定位置。转录酶的例子是来自大肠杆菌和噬菌体T7,T3,和SP6的DNA依赖性RNA聚合酶。
如本文中使用的,“RNA依赖性DNA聚合酶”或“逆转录酶”(“RT”)是自RNA模板合成互补DNA拷贝的酶。所有已知的逆转录酶还具有自DNA模板生成互补DNA拷贝的能力;如此,它们既是RNA依赖性DNA聚合酶又是DNA依赖性DNA聚合酶。RT还可以具有RNA酶H活性。用RNA和DNA模板起始合成均需要引物。
如本文中使用的,“选择性RNA酶”是降解RNA:DNA双链体的RNA部分但不降解单链RNA,双链RNA或DNA的酶。一种例示性的选择性RNA酶是RNA酶H。也可以使用与RNA酶H拥有相同或相似活性的酶。选择性RNA酶可以是内切核酸酶或外切核酸酶。大多数逆转录酶在它们的聚合酶活性以外还含有RNA酶H活性。然而,没有相关聚合酶活性的RNA酶H的其它来源是可得的。降解可导致自RNA:DNA复合物分离RNA。或者,选择性RNA酶可以仅仅在多个位置处切割RNA,使得RNA的各个部分解链或允许酶解开RNA的各个部分的缠绕。选择性降解本发明的RNA靶序列或RNA产物的其它酶对本领域普通技术人员会是明显的。
在扩增和/或检测系统的语境中,术语“特异性”在本文中用于指系统的特征,描述它区分靶和非靶序列的能力,取决于序列和测定法条件。就核酸扩增而言,特异性一般指生成的特异性特定扩增子的数目与副产物的数目的比(例如信噪比)。就检测而言,特异性一般指自靶核酸生成的信号与自非靶核酸生成的信号的比。
术语“灵敏度”在本文中用于指能检测或量化核酸扩增反应的精确度。扩增反应的灵敏度一般是在扩增系统中能可靠检测的靶核酸的最小拷贝数的度量,而且会取决于例如采用的检测测定法和扩增反应的特异性,例如特定扩增子与副产物的比。
如本文中使用的,术语“相对光单位”(“RLU”)是测量的任意单位,指示在给定波长或波长带由样品发射的光子的相对数目。RLU随用于测量的检测手段的特征而变化。
附图简述
图1显示戊型肝炎病毒(HEV)基因组的一种参照序列(SEQIDNO:1),完整序列见GenBank,登录号AB074918.2和GI:21218075。
发明详述
本发明提供用于自样品扩增和检测丙型肝炎病毒(HEV)核酸的组合物,试剂盒,和方法。优选地,样品为生物学样品。组合物,试剂盒,和方法提供识别HEV基因组的靶序列(包括HEV基因型1,2,3,和4的靶序列)或它们的互补序列的寡核苷酸序列。此类寡核苷酸可以用作扩增寡核苷酸,它们可以包括引物,启动子引物,被封闭的寡核苷酸,和启动子提供者寡核苷酸,它们的功能先前已有描述(参见例如美国专利No.4,683,195;No.4,683,202;No.4,800,159;No.5,399,491;No.5,554,516;No.5,824,518;和No.7,374,885;通过援引将每一篇收入本文)。其它寡核苷酸可以用作探针,用于检测扩增的HEV序列,或用于捕捉HEV靶核酸。
方法提供灵敏且特异性的HEV核酸检测。方法包括实施HEV靶区的核酸扩增和检测扩增产物,检测通过例如使扩增产物与核酸检测探针特异性杂交来进行,核酸检测探针提供信号以指示样品中HEV的存在。扩增步骤包括使样品与一种或多种对HEV靶核酸中的靶序列特异性的扩增寡聚体接触,如果样品中存在HEV核酸的话,生成扩增产物。通过使用至少一种核酸聚合酶和一种扩增寡聚体自模板链生成拷贝(例如通过使用模板链自引物延伸序列),扩增合成靶序列或其互补物的另外拷贝。用于检测扩增产物的一个实施方案使用如下杂交步骤,其包括使扩增产物与至少一种对由选定扩增寡聚体扩增的序列(例如侧翼为一对选定扩增寡聚体的靶序列中含有的序列)特异性的探针接触。
检测步骤可以使用多种已知技术任一实施,来检测与扩增的靶序列特异性相关的信号,诸如例如通过使扩增产物与带标记物的检测探针杂交并检测自带标记物的探针导致的信号。检测步骤还可以提供关于扩增序列的另外信息,诸如例如它的整个或部分核酸碱基序列。检测可以在扩增反应完成后实施,或者可以与扩增靶区同时实施,例如实时地。在一个实施方案中,检测步骤容许同质检测,例如在没有自混合物去除未杂交的探针的情况下检测杂交的探针(参见例如美国专利No.5,639,604和No.5,283,174,通过援引将每一篇收入本文)。
在扩增步骤结束临近时或在扩增步骤结束时检测扩增产物的实施方案中,可以使用线性检测探针来提供信号以指示探针对扩增产物的杂交。此类检测的一个例子使用带发光标记物的与靶核酸杂交的探针。然后自非杂交的探针水解发光标记物。使用光度计通过化学发光实施检测(参见例如国际专利申请公开文本No.WO89/002476,通过援引收入本文)。在使用实时检测的其它实施方案中,检测探针可以是发夹探针,诸如例如分子束,分子火炬,或杂交开关探针,它用报告模块标记,当探针结合至扩增产物时得以检测。此类探针可以包含靶杂交序列和非靶杂交序列。多种形式的此类探针先前已有描述(参见例如美国专利No.5,118,801;No.5,312,728;No.5,925,517;No.6,150,097;No.6,849,412;No.6,835,542;No.6,534,274;和No.6,361,945;和美国专利申请公开文本No.20060068417A1和No.20060194240A1;通过援引将每一篇收入本文)。
本发明的优选组合物配置成与所有四种主要HEV基因型(1,2,3,和4型)的核酸特异性杂交且具有最小的与样品中怀疑存在的其它非HEV核酸(例如其它血液传播病原体)的交叉反应性。在某些变化中,本发明的组合物进一步容许检测暂时指派属于HEV基因型6的序列。在一些方面,本发明的组合物配置成与HEV核酸特异性杂交且具有最小的与丙型肝炎病毒(HCV),人免疫缺陷病毒1(HIV1),乙型肝炎病毒(HBV),和西尼罗河病毒中一种或多种的交叉反应性。在一个方面,本发明的组合物是多重系统的一部分,多重系统进一步包括用于检测一种或多种这些生物体的成分和方法。
在本发明的某些方面,提供至少两种寡聚体的组合用于测定样品中HEV的存在或缺失。典型地,寡聚体组合包括至少两种用于扩增与SEQIDNO:1的序列对应的HEV靶核酸中的靶区的扩增寡聚体。在此类实施方案中,至少一种扩增寡聚体包含有义取向的靶杂交序列(“有义THS”)且至少一种扩增寡聚体包含反义取向的靶杂交序列(“反义THS”),其中有义THS和反义THS各自配置成与如下HEV靶序列特异性杂交,该HEV靶序列与SEQIDNO:1内含有的序列对应,且其中靶杂交序列的选择使得反义THS靶定的HEV序列位于有义THS靶定的HEV序列下游(即至少两种扩增寡聚体的定位使得它们在要扩增的靶区侧翼)。在一些变化中,寡聚体组合包括包含如下靶杂交序列的(a)(i)寡聚体,该靶杂交序列为约14至约23个连续核苷酸且与SEQIDNO:63的序列中含有的序列基本上对应或相同且至少包括SEQIDNO:26的序列,或其互补物或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在一些变化中,至少一种扩增寡聚体为包含如下靶杂交序列的(a)(ii)寡聚体,该靶杂交序列为约14至约23个连续核苷酸且与SEQIDNO:16的序列中含有的序列基本上对应或相同,或其互补物或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在一些变化中,至少一种扩增寡聚体为包含如下靶杂交序列的(b)寡聚体,该靶杂交序列为约17至约28个连续核苷酸且与SEQIDNO:47的序列中含有的序列基本上对应或相同且至少包括SEQIDNO:25的序列,或其互补物或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。在更加特定的实施方案中,至少一种用于检测HEV的扩增寡聚体包括在扩增反应混合物中提供至少一种扩增寡聚体。在一个方面,在扩增反应混合物中以约4皮摩尔/反应至约12皮摩尔/反应的浓度(含所述范围的所有整数和小数/分数,例如4,4.5,5,6.75,8,10,10.25,11,12.01)提供至少一种扩增寡聚体中的每一种。在一些变化中,至少一种扩增寡聚体为多数扩增寡聚体,以相等的浓度在扩增反应混合物中提供它们中的每一种。在一些变化中,至少一种扩增寡聚体为多数扩增寡聚体,并非必须以相等的浓度在扩增反应混合物中提供它们中的每一种(例如在扩增反应混合物中一种扩增寡聚体以另一种扩增寡聚体的两倍浓度提供)。
在包含上文(a)(i),(a)(ii),或(b)中的扩增寡聚体的变化中,寡聚体组合包括至少一种如下扩增寡聚体,其包含相反极性(有义对反义或反之亦然)的HEV特异性靶杂交序列作为(a)(i),(a)(ii),或(b)的寡聚体的靶杂交序列,使得至少两种扩增寡聚体在要扩增的靶区的侧翼。在一些此类实施方案中,寡聚体组合包括(a)(i)和/或(a)(ii)中的至少一种寡聚体,和(b)中的至少一种寡聚体,使得(a)(i)和/或(a)(ii)的寡聚体和(b)的寡聚体在要扩增的靶区的侧翼。在一些此类变化中,寡聚体组合包括至少一种(a)(i)中的扩增寡聚体,至少一种(a)(ii)中的扩增寡聚体,和至少一种(b)中的扩增寡聚体(例如两种扩增寡聚体)。在其它此类变化中,寡聚体组合包括至少两种(b)中的扩增寡聚体和至少一种(a)(i)或(a)(ii)任一中的扩增寡聚体。
在本发明的更加特定的实施方案中,用于测定样品中HEV的存在或缺失的寡聚体组合包括(1)包含与下文表1所示至少一种有义寡聚体序列基本上对应的HEV靶杂交区的至少一种扩增寡聚体,和(2)包含与表1所示至少一种反义寡聚体序列基本上对应的HEV靶杂交区的至少一种扩增寡聚体。在一些此类实施方案中,寡聚体组合包括至少两种上文(1)的扩增寡聚体和/或至少两种上文(2)的扩增寡聚体。在特定变化中,扩增寡聚体组合的有义和/或反义靶杂交序列包含选自表1的有义和/或反义序列或由其组成。
表1:用于扩增HEV靶区的例示性有义和反义扩增寡聚体靶杂交序列
1这些序列的有义/反义名称仅用于例示目的。此类名称并非必然将序列限制于伴随的名称。
2第1位处的N为C或不存在,第16位处的N为G或不存在,而第17位处的N为G或不存在。在一些实施方案中,如果第16位处的N为G且第17位处的N为不存在,那么第1位处的N为C。
在某些实施方案中,本文所述扩增寡聚体为启动子引物或启动子提供者,其进一步包含位于靶杂交序列5'且与HEV靶核酸不互补的启动子序列。例如,在本文所述用于扩增HEV靶区的寡聚体组合的一些实施方案中,上文(b)中所述扩增寡聚体(例如包含表1中所示反义靶杂交序列或由其组成的扩增寡聚体)为进一步包含5'启动子序列的启动子引物。在特定实施方案中,启动子序列为T7RNA聚合酶启动子序列,诸如例如具有SEQIDNO:73中所示序列的T7启动子序列。在特定变化中,(b)的扩增寡聚体为具有SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:18,或SEQIDNO:20中所示序列的启动子引物。
在一些实施方案中,本文所述寡聚体组合进一步包括终止寡核苷酸(本文中也称作“封闭者”寡核苷酸),其包含与靶核酸内含有的邻近靶区5'末端的序列基本上互补(例如完全互补)的碱基序列。终止寡聚体通常与例如启动子提供者扩增寡聚体组合使用,诸如例如在本文所述涉及转录介导的扩增(TMA)的某些实施方案中。
在一些实施方案中,本文所述寡聚体组合进一步包含至少一种捕捉探针寡聚体,其包含与SEQIDNO:1的互补物中含有的序列基本上对应的靶杂交序列,其中靶杂交序列共价附着至结合固定化探针的序列或模块。在特定变化中,靶杂交序列包含与选自SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:42基本上对应或相同的序列或由其组成,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物的序列。在更加特定变化中,捕捉探针寡聚体具有选自SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。寡聚体组合可以包括至少两种(例如三种)上文所述捕捉探针寡聚体。在更加特定的实施方案中,至少一种捕捉探针寡聚体包括在靶捕捉反应混合物中提供至少一种捕捉探针寡聚体。在一个方面,以约3皮摩尔/反应至约6皮摩尔/反应(含所述范围的所有整数和小数/分数,例如4,4.75,5.12,5.98,6)的浓度在靶捕捉反应混合物中提供至少一种捕捉探针寡聚体中的每一种。如本文所述,当在靶捕捉反应中使用多数至少一种捕捉探针寡聚体时,每种捕捉探针寡聚体的浓度可以与其它的浓度相等,或者可以有不同的浓度。
在某些变化中,本文所述寡聚体组合进一步包含至少一种检测探针寡聚体,其配置成与使用第一和第二扩增寡聚体可扩增的HEV靶序列(例如侧翼为第一和第二扩增寡聚体的靶杂交序列的HEV靶序列)特异性杂交。在特定实施方案中,检测探针寡聚体包括如下靶杂交序列,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。特别合适的检测探针寡聚体包括例如包含与选自SEQIDNO:37,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71的序列基本上对应或相同的靶杂交序列的寡聚体,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。检测探针寡聚体可以在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。在一些变化中,寡聚体组合包括至少两种检测探针寡聚体。在更加特定的实施方案中,至少一种检测探针寡聚体包括在扩增检测反应混合物中提供至少一种检测探针寡聚体。在一个方面,以约2.0E+06RLU/反应至约6.0E+06RLU/反应(含所述范围的所有整数和小数/分数,例如2.0E+06,2.138E+06,3.385E+06RLU)在检测反应混合物中提供至少一种检测探针寡聚体中的每一种。如本文所述,当在检测反应中使用多数至少一种检测探针寡聚体时,每种检测寡聚体的浓度可以与其它的浓度相等,或者可以有不同的浓度。
典型地,依照本发明的检测探针寡聚体进一步包括标记物。特别合适的标记物包括发射可检测光信号的化合物,例如能在同质混合物中检测的荧光团或发光(例如化学发光)化合物。特定探针上可以存在超过一种标记物和超过一种类型的标记物,或者检测可以依赖于使用探针混合物,其中用产生可检测信号的化合物标记每种探针(参见例如美国专利No.6,180,340和No.6,350,579,通过援引将每一篇收入本文)。标记物可以通过各种手段附着至探针,包括共价联接,螯合,和离子相互作用,但是优选地,标记物是共价附着的。例如,在一些实施方案中,检测探针具有附着的化学发光标记物,诸如例如吖啶酯(AE)化合物(参见例如美国专利No.5,185,439;No.5,639,604;No.5,585,481;和No.5,656,744;通过援引将每一篇收入本文),其在典型变化中通过非核苷酸接头附着至探针(参见例如美国专利No.5,585,481;No.5,656,744;和No.5,639,604,特别是第10栏第6行至第11栏第3行,和实施例8;通过援引将每一篇收入本文)。在其它实施方案中,检测探针包含发荧光标记物和淬灭剂二者,这是在荧光共振能量转移(FRET)测定法中特别有用的组合。此类检测探针的特定变化包括例如TaqMan检测探针(RocheMolecularDiagnostics)和“分子束”(参见例如Tyagietal.,NatureBiotechnol.16:49-53,1998;美国专利No.5,118,801和No.5,312,728;通过援引将每一篇收入本文)。
依照本发明的检测探针寡聚体可以进一步包括非靶杂交序列。此类检测探针的特定实施方案包括例如形成通过分子内杂交保持的构象的探针,诸如通常称作发夹的构象。特别合适的发夹探针包括“分子火炬”(参见例如美国专利No.6,849,412;No.6,835,542;No.6,534,274;和No.6,361,945,通过援引将每一篇收入本文)和“分子束”(参见例如Tyagietal.,见上文;美国专利No.5,118,801和No.5,312,728,见上文)。用于使用此类发夹探针的方法是本领域公知的。
在还有其它实施方案中,检测探针为线性寡聚体,它们基本上不形成通过分子内键保持的构象。在特定变化中,线性检测探针寡聚体包括化学发光化合物作为标记物,优选吖啶酯(AE)化合物。
在还有其它变化中,用于检测HEV核酸的寡聚体组合进一步包含与检测探针寡聚体基本上互补的探针保护寡聚体。探针保护寡聚体可以与基本上互补的带标记物的检测探针寡聚体(例如用化学发光化合物标记的探针)杂交以在贮藏期间稳定带标记物的探针。在特定的实施方案中,探针保护寡聚体具有与选自SEQIDNO:36和SEQIDNO:40的序列基本上对应或相同的序列。
本发明还提供本文所述检测探针寡聚体,捕捉探针寡聚体,和探针保护寡聚体。
在另一个方面,本发明提供使用本文所述寡聚体组合测定样品中HEV的存在或缺失的方法。此类方法一般包括(1)使样品与至少两种用于扩增与HEV靶核酸对应的HEV核酸靶区的寡聚体接触,其中寡聚体包括至少两种上文所述扩增寡聚体;(2)实施体外核酸扩增反应,其中使用样品中存在的任何HEV靶核酸作为模板来生成扩增产物;并(3)检测扩增产物的存在或缺失,由此测定样品中HEV的存在或缺失。依照本发明的检测方法通常进一步包括获得要与至少两种寡聚体接触的样品的步骤。在某些实施方案中,“获得”要在步骤(1)-(3)中使用的样品包括例如在实施所述方法的一个或多个步骤的测试机构或其它场所接收样品,和/或在实施所述方法的一个或多个步骤的机构内自某场所(例如自贮藏或其它保藏处)取回样品。
在某些实施方案中,方法进一步包括在接触步骤之前自样品中的其它成分纯化HEV靶核酸。此类纯化可以包括自其它样品成分分离和/或浓缩样品中含有的生物体的方法。在特定实施方案中,纯化靶核酸包括捕捉靶核酸以自其它样品成分特异性或非特异性分离靶核酸。非特异性靶捕捉方法可以涉及自基本上含水的混合物选择性沉淀核酸,使核酸粘附至支持物并清洗以去除其它样品成分,或自含有HEV核酸和其它样品成分的混合物物理分离核酸的其它手段。
在一些实施方案中,通过使HEV靶核酸特异性杂交至捕捉探针寡聚体,自其它样品成分选择性分离HEV靶核酸。捕捉探针寡聚体包含配置成与HEV靶序列特异性杂交的靶杂交序列,从而形成靶序列:捕捉探针复合物,与样品成分分离。合适的捕捉探针靶杂交序列包括与选自SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,和SEQIDNO:42的序列基本上对应或相同的序列,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。在一种优选变化中,特异性靶捕捉使HEV靶:捕捉探针复合物结合固定化探针以形成靶:捕捉探针:固定化探针复合物,与样品分离,并任选清洗以去除非靶样品成分(参见例如美国专利No.6,110,678;No.6,280,952;和No.6,534,273;通过援引将每一篇收入本文)。在此类变化中,捕捉探针寡聚体进一步包含使捕捉探针与其结合的靶序列一起结合附着至固体支持物的固定化探针的序列或模块,由此允许杂交的靶核酸与其它样品成分分离。
在更加特定的实施方案中,捕捉探针寡聚体包括尾部分(例如3'尾),它不与HEV靶序列互补,但是与固定化探针上的序列特异性杂交,由此充当容许靶核酸与其它样品成分分离的模块,诸如先前在例如美国专利No.6,110,678中描述的,通过援引收入本文。尾区中可以使用任何序列,它一般长约5至50个nt,而且优选实施方案包括约10至40个nt(例如A10至A40),更优选约14至33个nt(例如A14至A30或T3A14至T3A30)的基本上同聚的尾,它结合附着至固体支持物(例如基质或颗粒)的互补的固定化序列(例如聚T)。例如,在包含3'尾的捕捉探针的特定实施方案中,捕捉探针具有选自SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。
靶捕捉通常在含有一种或多种在杂交条件(通常处于比尾序列:固定化探针序列双链体的Tm要高的温度)下与HEV靶序列特异性杂交的捕捉探针寡聚体的溶液相混合物中发生。对于包含捕捉探针尾的实施方案,如下捕捉HEV靶:捕捉探针复合物,即调节杂交条件,使得捕捉探针尾与固定化探针杂交,然后将固体支持物上的整个复合物与其它样品成分分离。可以将支持物与附着的固定化探针:捕捉探针:HEV靶序列一起清洗一次或多次以进一步去除其它样品成分。优选实施方案使用颗粒固体支持物,诸如顺磁性珠,使得颗粒与附着的HEV靶:捕捉探针:固定化探针复合物一起可以在清洗溶液中悬浮并自清洗溶液取回,优选通过使用磁吸引。为了限制操作步骤的数目,HEV靶核酸可以通过简单混合支持物上的复合物中的HEV靶序列与扩增寡聚体并继以扩增步骤来扩增。
扩增HEV靶序列利用如下体外扩增反应,其使用至少两种在要扩增的靶区侧翼的扩增寡聚体。在特定实施方案中,要扩增的靶区基本上与SEQIDNO:1约核苷酸第5230位至约核苷酸第5379位对应。对于扩增这些靶区特别合适的扩增寡聚体组合在本文中有描述(见例如段落[4]-[14]和[87]-[90],见上文)。合适的扩增方法包括例如复制酶介导的扩增,聚合酶链式反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),链置换扩增(SDA),和转录介导的或转录相关的扩增(TMA)。此类扩增方法是本领域公知的(参见例如段落[59]和[60],见上文),而且容易依照本发明方法使用。
例如,使用TMA扩增的一些扩增方法包括下述步骤。简言之,作为单链核酸(例如ssRNA或ssDNA)提供含有要扩增的序列的靶核酸。本领域技术人员会领会,可以使用双链核酸(例如dsDNA)的常规解链来提供单链靶核酸。启动子引物在其靶序列处与靶核酸特异性结合,并且逆转录酶(RT)延伸启动子引物的3'末端,使用靶链作为模板创建靶序列链的cDNA拷贝,产生RNA:DNA双链体。RNA酶消化RNA:DNA双链体的RNA链,并且第二引物与其位于cDNA链上在启动子引物末端下游的靶序列特异性结合。RT通过延伸第二引物的3'末端合成新DNA链,使用第一cDNA模板创建含有功能性启动子序列的dsDNA。然后对启动子序列特异性的RNA聚合酶启动转录以生成RNA转录物,它们是反应中的初始靶链的约100至1000个扩增拷贝(“扩增子”)。当第二引物与其在每个扩增子中的靶序列特异性结合并且RT自扩增子RNA模板创建DNA拷贝以生成RNA:DNA双链体时,扩增继续。反应混合物中的RNA酶消化来自RNA:DNA双链体的扩增子RNA,并且启动子引物与其在新合成的DNA中的互补序列特异性结合。RT延伸启动子引物的3'末端以创建含有功能性启动子的dsDNA,RNA聚合酶与该功能性启动子结合以转录另外的与靶链互补的扩增子。生成更多扩增子拷贝的自我催化循环在反应过程期间重复,导致样品中存在的靶核酸扩增约10亿倍。可以在扩增期间实时地或在扩增反应结束时检测扩增产物,通过使用与扩增产物中含有的靶序列特异性结合的探针来进行。对结合的探针产生的信号的检测指示样品中靶核酸的存在。
在一些实施方案中,方法利用“逆向”TMA反应。在此类变化中,初始或“正向”扩增寡聚体为与邻近靶区3'末端的靶核酸杂交的引发寡核苷酸。逆转录酶(RT)通过延伸引物的3'末端来合成cDNA链,使用靶核酸作为模板。第二或“反向”扩增寡聚体为具有配置成与合成的cDNA链内含有的靶序列杂交的靶杂交序列的启动子引物或启动子提供者。在第二扩增寡聚体为启动子引物的情况中,RT使用cDNA链作为模板延伸启动子引物的3'末端以创建靶序列链的第二cDNA拷贝,由此创建含有功能性启动子序列的dsDNA。然后扩增基本上如上文段落[105]关于利用RNA聚合酶自启动子序列起始转录所述继续。或者,在第二扩增寡聚体为启动子提供者的情况中,通常利用与邻近靶区5'末端的靶序列杂交的终止寡核苷酸来终止引发寡聚体在终止寡核苷酸3'末端处的延伸,由此为通过自引发寡聚体延伸而合成的初始cDNA链提供限定的3'末端。然后启动子提供者的靶杂交序列与初始cDNA链的限定的3'末端杂交,并且延伸cDNA链的3'末端以添加与启动子提供者的启动子序列互补的序列,导致双链启动子序列形成。然后使用识别双链启动子并自其起始转录的RNA聚合酶,使用初始cDNA链作为模板来转录多个与不包括启动子部分的初始cDNA链互补的RNA转录物。然后每一个这些RNA转录物均可用来充当模板,用于自第一引发扩增寡聚体进一步扩增。
对扩增产物的检测可以通过多种方法来实现。核酸可以与表面联合,导致物理变化,诸如可检测电变化。可以如下检测扩增的核酸,即在基质中或上浓缩它们并检测核酸或与它们相关的染料(例如插入剂,诸如溴化乙啶或cyber绿),或检测溶液相中与核酸相关的染料的增多。其它检测方法可以使用配置成与扩增产物中的序列特异性杂交的核酸检测探针并检测探针:产物复合物的存在,或者使用可以放大与扩增产物相关的可检测信号的探针的复合物(例如美国专利No.5,424,413;No.5,451,503;和No.5,849,481;通过援引将每一篇收入本文)。直接或间接标记的与扩增产物特异性联合的探针提供可检测信号,指示样品中靶核酸的存在。特别地,扩增产物会含有HEV基因组RNA中的序列中的或与其互补的靶序列,而且探针会直接或间接结合扩增产物中含有的序列以指示测试样品中HEV核酸的存在。
与互补的扩增序列杂交的检测探针的优选实施方案可以是DNA或RNA寡聚体,或含有DNA和RNA核苷酸的组合的寡聚体,或用经过修饰的主链合成的寡聚体,例如包括一个或多个2'-甲氧基取代的核糖核苷酸的寡聚体。用于检测扩增的HEV序列的探针可以是未标记的并间接检测(例如通过另一结合配偶对探针上的模块的结合),或者可以用各种可检测标记物标记。适合依照本发明方法使用的检测探针的特定实施方案在本文中有进一步描述(参见例如段落[15],[16],和[31]-[33],见上文)。在用于检测HEV序列的方法的一些优选实施方案中,诸如在使用转录介导的扩增(TMA)的某些实施方案中,检测探针为线性的带化学发光标记物的探针,更优选线性的带吖啶酯(AE)标记物的探针。
并非意图由核酸聚合酶延伸的寡聚体优选包括封闭者基团替换3'OH以阻止扩增反应中酶介导的寡聚体延伸。例如,扩增期间存在的被封闭的扩增寡聚体和/或检测探针优选不具有功能性3'OH,而是包括一个或多个位于3'末端或附近的封闭基团。3'末端附近的封闭基团优选在3'末端五个残基内,而且大得足以限制聚合酶结合寡聚体,而且其它优选实施方案含有共价附着至3'端的封闭基团。可以使用许多不同化学基团来封闭3'末端,例如烷基基团,非核苷酸接头,链烷-二醇双脱氧核苷酸残基,和蛹虫草菌素。
3'末端通常是被封闭的–且在使用转录介导的扩增的某些实施方案中特别合适的–寡聚体的例子是启动子提供者。如先前所述,启动子提供者包含第一靶杂交区和位于第一区5'的第二区,其包含用于RNA聚合酶的启动子序列。启动子提供者寡核苷酸经过修饰以阻止DNA合成自其3'端启动,诸如通过包括上文所述封闭者基团。
典型地,3'被封闭的寡聚体的另一个例子是上文先前所述终止(“封闭者”)寡核苷酸。终止寡聚体通常与例如启动子提供者扩增寡聚体组合使用,诸如例如在本文所述涉及转录介导的扩增(TMA)的某些实施方案中。终止寡聚体与靶核酸内含有的邻近靶区5'末端的序列杂交,从而“终止”包括引发寡核苷酸的初生核酸的引物延伸,由此为初生核酸链提供限定的3'末端。
使用转录介导的扩增的其它实施方案利用启动子引物,其包含第一靶杂交区和位于第一区5'的第二区,其包含用于RNA聚合酶的启动子序列,但是没有经过修饰以阻止DNA合成自其3'端起始。在一些实施方案中,依照检测方法使用的启动子引物包含具有与选自SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,SEQIDNO:49,SEQIDNO:50,SEQIDNO:51,SEQIDNO:56的序列基本上对应或相同的序列的靶杂交序列。在包含SEQIDNO:56中的靶杂交序列的启动子引物的某些变化中,SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G);在其它变化中,启动子引物在SEQIDNO:56的第1位处具有简并性,使得在包含SEQIDNO:56的一群寡聚体内此位置被胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)任一占据。在更加特定变化中,依照检测方法使用的启动子引物具有SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,或SEQIDNO:20中所示序列。
用于检测HEV核酸的测定法可以任选包括非HEV内部对照(IC)核酸,它在相同测定法反应混合物中通过使用对IC序列特异性的扩增和检测寡聚体来扩增和检测。IC核酸序列可以是RNA模板序列(例如体外转录物),掺入样品中的合成核酸序列,或者IC核酸序列可以是细胞成分。作为细胞成分的IC核酸序列可以来自相对于标本而言的外源细胞来源或内源细胞来源。在这些情况中,内部对照核酸与HEV核酸在扩增反应混合物中共扩增。内部对照扩增产物和HEV靶序列扩增产物可以独立检测。在下文所述规程中采用了两种不同内部对照系统。
内部对照系统的第一种安排对于监测扩增和检测反应的完整性是有用的,其采用配对的引物套组和在引物结合位点之间的位置与扩增产物或其互补物杂交的寡核苷酸探针。在下文实施例下描述的测定法中使用了这种安排。在一种简单的应用中,可以在充当探针结合位点的碱基序列处区分内部对照模板核酸与分析物模板核酸。这些碱基可以是乱序的(scrambled),用无关碱基序列替换的,或仅是含有充足数目的点突变以导致差异探针结合的。这样,源自分析物核酸扩增的核酸产物能通过分析物特异性探针而非内部对照特异性探针来检测。类似地,源自内部对照核酸扩增的扩增子能通过内部对照特异性探针而非分析物特异性探针来检测。这种配置容许可以使用相同引物或引物套组来扩增分析物和内部对照核酸模板二者。
在某些实施方案中,如果对意图的靶HEV核酸没有获得信号的话(例如对于HEV测试呈阴性的样品),对来自扩增的IC序列的信号的放大和检测证明测定法试剂,条件,和测定法步骤的性能在测定法中是恰当使用的。在期望定量结果时,IC还可以用作测定法的内部校准物,即使用自IC扩增和检测获得的信号来设定基于对扩增的HEV靶序列获得的信号量化样品中HEV核酸的量的算法中使用的参数。IC对于监测测定法中的一个或多个步骤的完整性也是有用的。合成IC核酸序列的一个优选实施方案是自天然发生来源衍生的随机化的序列(例如以随机方式重排的HIV序列)。另一种优选IC核酸序列可以是自天然发生来源分离的或体外合成的RNA转录物,诸如通过自克隆的随机化的序列生成转录物,使得可以精确测定测定法中包括的IC的拷贝数。用于IC靶序列的引物和探针通过使用任何公知方法来配置和合成,前提是引物和探针发挥使用与用于扩增和检测HEV靶序列基本上相同的测定法条件扩增IC靶序列和检测扩增的IC序列的功能。在包括基于靶捕捉的纯化步骤的优选实施方案中,优选测定法中的靶捕捉步骤中包括对IC靶特异性的靶捕捉探针,使得IC在测定法中在所有测定法步骤中以与意图的HEV分析物类似的方式得到处理。
在用于测定样品中HEV的存在或缺失的方法的某些实施方案中,方法进一步包括使用本文所述探针保护寡聚体来调节测定法灵敏度。
本发明还提供用于测定样品中HEV靶核酸的存在或缺失的反应混合物。依照本发明的反应混合物至少包含下述一项或多项:本文所述用于扩增HEV靶核酸的寡聚体组合;本文所述用于纯化HEV靶核酸的捕捉探针寡聚体;本文所述用于测定HEV扩增产物的存在或缺失的检测探针寡聚体;和本文所述用于解调用于检测HEV靶核酸的测定法的灵敏度的探针保护寡聚体。反应混合物可以进一步包括一些任选成分,诸如例如捕捉探针核酸的阵列。对于扩增反应混合物,反应混合物通常会包括其它适合于实施体外扩增的试剂,诸如例如缓冲液,盐溶液,适宜的核苷酸三磷酸酯(例如dATP,dCTP,dGTP,dTTP,ATP,CTP,GTP和UTP),和/或酶(例如逆转录酶和/或RNA聚合酶),而且通常会包括测试样品成分,其中可以存在或不存在HEV靶核酸。另外,对于包括检测探针以及扩增寡聚体组合的反应混合物,用于反应混合物的扩增寡聚体和检测探针寡聚体的选择通过共同靶区联系起来(即反应混合物会包括与通过反应混合物的扩增寡聚体组合可扩增的序列结合的探针)。
本发明还提供用于实践本文所述方法的试剂盒。依照本发明的试剂盒至少包含下述一项或多项:本文所述用于扩增HEV靶核酸的扩增寡聚体组合;本文所述用于纯化HEV靶核酸的捕捉探针寡聚体;本文所述用于测定HEV扩增产物的存在或缺失的检测探针寡聚体;和本文所述用于解调用于检测HEV靶核酸的测定法的灵敏度的探针保护寡聚体。试剂盒可以进一步包括一些任选成分,诸如例如捕捉探针核酸的阵列。试剂盒中可以存在的其它试剂包括适合于实施体外扩增的试剂,诸如例如缓冲液,盐溶液,适宜的核苷酸三磷酸酯(例如dATP,dCTP,dGTP,dTTP,ATP,CTP,GTP和UTP),和/或酶(例如逆转录酶和/或RNA聚合酶)。本文所述寡聚体可以以多种不同实施方案包装,而且本领域技术人员会领会本发明涵盖许多不同试剂盒配置。例如,试剂盒可以包括仅仅针对HEV基因组的一个靶区的扩增寡聚体,或者它可以包括针对多个HEV靶区的扩增寡聚体。另外,对于包括检测探针以及扩增寡聚体组合的试剂盒,用于试剂盒的扩增寡聚体和检测探针寡聚体的选择通过共同靶区联系起来(即试剂盒会包括与通过试剂盒的扩增寡聚体组合可扩增的序列结合的探针)。在某些实施方案中,试剂盒进一步包括一套关于实践依照本发明的方法的说明书,其中说明书可以与包装插页和/或试剂盒或其成分的包装相关。
本发明通过下述非限制性实施例进一步例示。
实施例
实施例1
此实施例描述使用各种引物套组来扩增HEV靶区的扩增反应。下文表2列出了此测定法中使用的所有扩增寡聚体。
表2:HEV扩增寡聚体
测试了表2中列出的T7和非T7引物的每种可能组合。以15和0个拷贝/反应使用HEV体外转录物(IVT),在转录介导的扩增(TMA)反应中测试了引物。转录介导的扩增(TMA)反应本质上如Kacian等人在美国专利No.5,399,491(上文通过援引已经收录了此美国专利的公开内容)所述进行。使用约5至10皮摩尔/反应每种T7引物和非T7引物,对各种引物组合进行了扩增反应。使用带AE标记物的检测探针(具有SEQIDNO:67中所示核碱基序列),通过杂交保护测定法(HPA)检测了扩增产物。通过将在15个拷贝的HEVIVT观察到的RLU值除以在0个拷贝的HEVIVT观察到的背景RLU值,为每种引物对计算了信噪比。结果显示于下文表3。
展现出至少10或更大的信号背景比的引物对被认为对于至少低至15个拷贝/反应的HEV靶核酸的扩增是成功的,而那些展现出不及10的比的引物对被认为是不成功的。超出10的比在表3中以粗体显示。
实施例2
此实施例描述使用不同寡聚体组合实施的HEV扩增和检测测定法。这些实验中使用的试剂,寡核苷酸,和样品列举于下文表4-6。
表4:HEV测定法试剂
表5:HEV特异性寡核苷酸
表6:测试的样品
样品 | 描述 |
阳性样品 | IC缓冲液中的HEV体外转录物(IVT) |
阴性样品 | HEV阴性血清 |
实施的步骤
规程的原理
HEV测定法涉及三个主要步骤,它们在一个管中发生:样品制备;通过转录介导的扩增(TMA)进行的HEVRNA靶扩增;和通过杂交保护测定法(HPA)进行的扩增产物(扩增子)检测。
在样品制备期间,经由靶捕捉的使用,自标本分离RNA。用去污剂处理标本以使病毒颗粒溶解,使蛋白质变性和使病毒基因组RNA释放。使与HEV的高度保守区同源的寡核苷酸(“捕捉寡核苷酸”)杂交至测试标本中的HEVRNA靶,如果存在的话。然后将杂交的靶捕捉到磁性微粒上,在磁场中与标本分开。利用清洗步骤自反应管去除外加成分。磁分离和清洗步骤是用靶捕捉系统实施的。
靶扩增经由TMA发生,它是一种基于转录的核酸扩增方法,利用两种酶,MMLV逆转录酶和T7RNA聚合酶。使用逆转录酶来生成靶RNA序列的DNA拷贝(含有用于T7RNA聚合酶的启动子序列)。T7RNA聚合酶自DNA拷贝模板生成多个拷贝的RNA扩增子。HEV测定法利用TMA方法来扩增HEVRNA的区。
检测是使用具有化学发光标记物的与扩增子互补的单链核酸探针通过HPA实现的。带标记物的核酸探针与扩增子特异性杂交。通过灭活未杂交的探针上的标记物,选择试剂区分杂交的和未杂交的探针。在检测步骤期间,通过光度计测量由杂交的探针生成的化学发光信号,并作为相对光单位(RLU)报告。
经由工作靶捕捉试剂,将内部对照添加至每份测试标本和测定法校准物。HEV测定法中的内部对照(IC)用作标本加工,扩增和检测步骤的对照。内部对照信号与HEV信号的区别在于来自具有不同标记物的探针的光发射的差异动力学。使用具有快速光发射(闪光体(flasher)信号)的探针检测内部对照特异性扩增子。使用具有动力学相对较慢的光发射(辉光体(glower)信号)的探针检测对HEV特异性的扩增子。双重动力学测定法(DKA)是一种用于区分来自闪光体和辉光体标记物的信号的方法。
步骤的次序
靶捕捉:除了使用具有本文中给出的序列的戊型肝炎病毒靶捕捉寡核苷酸来捕捉模板以外,本质上依照已公布的国际专利申请No.PCT/US2000/18685中公开的规程,核酸在扩增之前经历标本加工和靶捕捉。注意,捕捉寡核苷酸不参与测定法的扩增或检测反应。将含有病毒的样品与靶捕捉试剂组合以推动核酸释放并杂交至部署在磁珠上的捕捉寡核苷酸。实施温育以自样品捕捉HEV核酸。温育后,将磁珠和任何捕捉靶核酸转移至磁清洗站,清洗步骤10-20分钟。然后在扩增反应中测定捕捉的靶核酸。
转录介导的扩增(TMA)反应本质上如实施例1中所述进行。将分离的靶核酸与引物在扩增试剂中组合(表2),加热至60℃达10分钟,然后冷却至42℃以推动引物退火。然后将酶试剂添加至混合物,并进行扩增反应,这会是本领域普通技术人员熟悉的。
检测:于42℃温育1小时后,采用如下探针对扩增反应体系进行杂交测定法,该探针使用本领域普通技术人员熟悉的技术用化学发光化合物内部标记,然后以等同于每种探针约2E+06至约6E+06RLU的量在杂交反应中使用(参见例如美国专利No.5,585,481和No.5,639,604,通过援引收录这些专利的公开内容)。杂交反应后添加一份0.15M四硼酸钠(pH8.5)和1%TRITONX-100(UnionCarbideCorporation;Danbury,CT)。首先将这些混合物于60℃温育10分钟以灭活连接至未杂交的探针的化学发光标记物,并短暂冷却至室温(即15-30℃),之后读取杂交信号。使用商品化仪器(Gen-ProbeIncorporated;SanDiego,CA)测定每份样品中杂交探针所致的化学发光,该仪器配置成注射1mM柠檬酸和0.1%(v/v)过氧化氢,之后注射含有1N氢氧化钠的溶液。以相对光单位(RLU)测量化学发光反应的结果。在此规程中,信/噪值对应于由与特异性杂交的探针相关的标记物产生的化学发光信号(以RLU测量)除以在靶核酸缺失下测量的背景信号。
结果和讨论
实验I–组合扩增系统
目的是测试T7和非T7对,以及一些个体,从而确认哪些不同引物组合展现更好的性能及哪些个体引物在功能上性能最好。使用SEQIDNO:76作为靶捕捉寡聚体实施靶捕捉反应。使用SEQIDNO:67作为带AE标记物的检测探针寡聚体实施检测反应。扩增寡聚体组合显示于下文表7。在确定SEQIDNO:29+SEQIDNO:65和SEQIDNO:12引物在先前的实验中运转最好后,这项实验大部分聚焦于这些特定引物。还测试了提高一些引物的浓度以评估在该系统中的性能和功能。对每种扩增系统测试处于20个拷贝/mLHEVIVT的小组(8份复制品)和BI0052阴性血清(2份复制品)。
表7:实验I的实验设计
*在除了6,7,8,9,16和17以外的所有扩增系统中,以彼此大致相同的浓度使用非T7引物和T7引物。在扩增系统6,7,8,9,16和17中,分别以反应中其它引物的2倍浓度使用下述引物成员:65,29,12,15,65和15。
表8显示实验I的汇总。在与SEQIDNO:12配对时,SEQIDNO:65的性能比SEQIDNO:29要好,如更高的均值RLU和更低的%CV值所示(扩增系统1和2)。在与SEQIDNO:29+SEQIDNO:65配对时,SEQIDNO:12的性能比SEQIDNO:15要好,如更高的均值RLU和更低的%CV值所示(扩增系统3和4)。正如对扩增系统5看到的,与扩增系统3相比,添加SEQIDNO:15改善RLU信号。将SEQIDNO:29+SEQIDNO:65二者保持于5pmol/反应显示比在扩增系统6中提高SEQIDNO:65至10pmol/反应要好的RLU和%CV性能(扩增系统5)。在比较扩增系统8和9时,将SEQIDNO:12自5提高至10pmol/反应显示比提高SEQIDNO:15要好的性能。扩增系统10至14比较哪种非T7会有更高RLU和较低%CV的性能。基于标准,SEQIDNO:66和SEQIDNO:64显示最高的RLU和最低的%CV。扩增系统15至17将系统中非T7或T7任一的浓度自5提高至10pmol/反应。比较扩增系统15和16,这些数据显示提高SEQIDNO:65改善性能(扩增系统16),而另一方面提高SEQIDNO:15较低性能(扩增系统17)。
表8:实验I的结果的汇总
RLU=相对光单位;SD=标准偏差;CV=变异系数;S/CO=信号对截留比;%R=%反应性。
实验II–确认最佳性能引物对组合
目的是在扩增试剂中测试T7和非T7对和不同引物组合。以每种扩增系统5份复制品测试处于20c/mLHEVIVT的小组。
表9显示实验设计。除了测试的扩增系统以外,所有条件保持相同。使用SEQIDNO:76实施靶捕捉,并使用带AE标记物的SEQIDNO:67作为检测探针实施检测。如实验I中所示,扩增系统1显示较好的性能,将其设为对照。扩增系统2至4测试只与SEQIDNO:15配对时每种非T7彼此的比较如何。由于SEQIDNO:66,SEQIDNO:64,和SEQIDNO:62在实验I中显示较好的RLU和%CV性能,因此以扩增系统5至7中所示引物配对组合测试这些非T7中的每一种。
表9:实验II的实验设计
表10显示实验II的汇总。在比较扩增系统2至4时,SEQIDNO:64以与SEQIDNO:66和SEQIDNO:62相比要高的均值RLU显示最好的性能。在比较扩增系统1和6时,SEQIDNO:29与SEQIDNO:64配对的性能比SEQIDNO:29+SEQIDNO:65要好。尽管在与扩增系统6和7相比时扩增系统5显示最高的RLU性能,基于序列比对选择扩增系统6用于进一步研究。
表10:实验II的结果的汇总
系统 | 小组 | RLU均值 | RLU SD | RLU%CV | S/CO | %R |
扩增1 | 20c/mL | 1,054,954 | 455,280 | 43.16 | 107.77 | 100 |
扩增2 | 20c/mL | 108,457 | 79,457 | 73.26 | 11.08 | 100 |
扩增3 | 20c/mL | 386,281 | 308,958 | 79.98 | 39.46 | 100 |
扩增4 | 20c/mL | 166,652 | 96,680 | 58.01 | 17.02 | 100 |
扩增5 | 20c/mL | 1,251,195 | 73,533 | 5.88 | 127.82 | 100 |
扩增6 | 20c/mL | 1,219,780 | 130,591 | 10.71 | 124.61 | 100 |
扩增7 | 20c/mL | 1,242,616 | 54,910 | 4.42 | 126.94 | 100 |
RLU=相对光单位;SD=标准偏差;CV=变异系数;S/CO=信号对截留比;%R=%反应性。
实验III–筛选新探针对
目的是测试新探针寡聚物对及评估性能。还个别测试每种探针以评估性能。分别作为测定法的阴性和阳性校准物测试处于0(IC仅缓冲液)和1,000个拷贝/mLHEVIVT的小组。以每种7份复制品作为样品测试处于20个拷贝/mLHEVIVT的小组和BI0052阴性血清。对每种探针条件测试每种小组类型。
表11显示实验设计。除了测试的7种探针系统以外,所有条件保持相同。还将内部对照(IC)探针添加至表中列出的7种探针中的每一种。
表11:实验III的实验设计
[#,#]名称指对于SEQIDNO:55而言化学发光标记物位于它们之间的核碱基残基(自5’至3’计数)。
*以与SEQIDNO:12,15和29每种相比的2倍浓度/反应测试SEQIDNO:64。
表12显示实验III的汇总。在查看含有探针对(探针5,6,和7)的探针试剂时,探针5和6显示较低的背景(阴性校准物和BI0052阴性血清中的低分析物RLU),和阳性校准物和处于20c/mL的HEVIVT中较高的分析物RLU信号。探针7也显示类似的结果。在三种探针(探针5,6,和7)中,探针5具有最高的阳性样品中的分析物RLU信号。对于个别探针性能(探针1至4),SEQIDNO:67显示最高的阳性样品中的分析物RLU信号,但相对较高的阴性样品中的背景信号。
表12:实验III的结果的汇总–ICRLU和分析物RLU
RLU=相对光单位;SD=标准偏差;CV=变异系数;CI=置信区间
表13显示实验III的均值分析物S/CO值的汇总,包括反应性,和有效性。
表13:实验III的结果的汇总–分析物S/CO,反应性,和有效性
S/CO=信号对截留比;SD=标准偏差;CV=变异系数;CI=置信区间;
NR=非反应性的;R=反应性的;%R=%反应性
实施例3
此实施例描述HEV扩增和检测测定法的分析灵敏度,交叉反应性,特异性,和进一步的探针配制剂的评估。试剂就是先前实施例2中描述的。下文表14和15列出了这些实验中使用的寡核苷酸和样品。
表14:HEV特异性寡核苷酸和内部对照闪光体探针和PPO
1小写=甲氧基RNA;大写=DNA
表15:测试的样品
实施的步骤
如实施例2中所述实施测定法步骤。
结果和讨论
分析灵敏度
使用用于HEVRNA基于核酸扩增技术(NAT)的测定法的第一世界卫生组织(WHO)国际标准品(IS)(PEI代码6329/10)测定HEV测定法的分析灵敏度。WHOIS基于自最初由PaulEhrlichInstitute(Langen,Germany)自北海道红十字会[日本红十字会(JRC)的分会]获得的一份临床分离物(GenBank登录号AB630970)衍生的HEV基因型3a。
对于HEVWHOIS,灵敏度以95%检测水平测定为8.4个国际单位(IU)/mL。
表16:用于HEV的WHO标准品的分析灵敏度
*使用SAS9.2概率值正态模型
HEV测定法在各种HEV基因型IVT间的分析灵敏度。为主要已知HEV基因型1-4中的每一种制备RNAIVT,包括HEV-3的三种基因亚型,即HEV-3a,HEV-3b和HEV-3f。使用HEV-3aIVT作为HEV测定法阳性校准物。另外,还为假定的HEV基因型6生成RNAIVT。处于95%检测水平时,对每种主要HEV基因型/基因亚型IVT的灵敏度测定为在10-19c/mL的范围中。例外是假定的HEV基因型6,其中HEV测定法的灵敏度与HEV基因型1-4IVT的平均灵敏度要低约5倍。假定的HEV基因型6株在HEV测定法中的较低检测因下述事实得到减轻,即只有一种株(wbJOY_06;GenBank登录号AB602441)与假定的基因型6相关,它是在日本的一头野猪中找到的,而且它尚未与任何已知人HEV病例联系起来(TakahashiMetal.,J.Gen.Virol.92:902-908,2011)。
表17:在HEV基因型IVT间的分析灵敏度
a基于GenBank登录号NC001434(1),M74506(2),AB630970(3a),AB630971(3b),FJ956757(3f),AB161717(4c)和AB602441(6)
b推定的HEV基因型
c使用SAS9.2概率值正态模型
交叉反应性
除了丙型肝炎病毒(HCV)以外,HEV特异性寡聚物的计算机(insilico)BLAST分析没有显示与其它血液传播病原体的序列匹配。HEV寡聚物SEQIDNO:64显示与HCV包膜基因一部分(GenBank登录号JQ063881中的第199-213位)的100%同一性。预期这不会引起任何假阳性问题,因为在HCV基因组序列中没有找到所有其余HEV特异性寡聚物序列(整个或部分)。这通过测试在HEV测定法中显示非反应性的HCV阳性样品得到支持。测试的其它血液传播病毒(人免疫缺陷病毒1,乙型肝炎病毒,和西尼罗河病毒)对于HEV测定法也是非反应性的。
表18:血液传播病原体的HEV交叉反应性
*S/CO(信号对截留)>或=1.0认为是反应性的
特异性
对于2,100份无联系的冷冻血浆标本,HEV测定法的特异性测定为99.95%(95%ScoreCI:99.73%-99.99%)。数据显示HEV测定法在冷冻血浆标本中卓越的特异性。
表19:冷冻血浆标本的HEV特异性
*CI=使用Score方法的置信区间
探针设计
对于HEV-3f,HEV探针寡聚物SEQIDNO:71显示相对于SEQIDNO:55[12,13]升高的检测信号,提高HEV3f灵敏度,95%LOD自12.4c/mL提高至10.2c/mL,而且RLU信号提高至与测试的其它HEV基因型更加相当的水平。
实施例4
此实施例描述血液捐献者中的HEVRNA流行率的测定和使用上文所述寡核苷酸的HEV扩增和检测测定法的性能特征。
方法
进行了研究来显示对HEVWHO国际标准品(PaulEhrlichInstitute(PEI)代码6329/10)和所有四种临床相关HEV基因型(1-4)的RNA转录物的分析灵敏度,和上文所述HEV测定法(“HEV测定法”)的临床特异性。自约10,000名无联系的自愿全血捐献者收集血浆(用于核酸测试)。在自动化Panther系统(Hologic,Inc.,产品目录号303095)上使用HEV测定法对HEVRNA测试样品。使用TMA呈重复反应性的样品通过PCR和序列分析得到确认。
结果
HEV测定法在使用WHO标准品时显示7.9IU/mL的95%检测极限(LOD),在使用与HEVWHO标准品具有相同序列的HEV3aRNA转录物时为14.4个拷贝/mL(见表20和21)。使用HEV1,2,3a,3b,3f和4c的RNA转录物,测定法以范围为7.9至17.7个拷贝/mL的95%LOD检测出所有四种HEV基因型(见表23)。使用TMA测定法对HEVRNA筛选了总共9,998份血液捐献。鉴定出三份TMA重复反应性的捐献,并通过用PCR测试独立小样确认了阳性。一份样品通过序列分析测定为基因型3f。基于这项研究,这些血液捐献中的HEVRNA流行率估算为3,333中1或0.03%,而且HEV测定法的临床特异性测定为99.99%(见表22和表24)。
表20:HEVWHO国际标准品(PEI)代码6329/10的分析灵敏度
WHO,n=162,体外转录物(IVT)和阴性,n=81
百分比反应性结果上方的行中的值90,30,10,3,1和0指TMA反应中HEVWHO标准品的IU/mL,而且指TMA反应中HEV3aIVT的拷贝/mL。
表21:HEVWHO国际标准品(PEI)代码6329/10的分析灵敏度
表22:血液捐献间的HEVRNA流行率
表23:HEV基因型1-4体外转录物的分析灵敏度
1基于GenBank登录号NC001434(1),M74506(2),AB630970(3a),AB630971(3b),FJ956757(3f),AB161717(4c)
2使用Gompertz模型的SASEnterpriseGuide5.1概率值分析
表24:血液捐献的HEV测定法特异性测试结果
讨论/结论
结果显示HEV测定法是灵敏的且特异的,而且检测所有四种临床相关HEV基因型。测试这项研究的接近10,000名个体血液捐献者产生三份HEVRNA确认阳性捐献,结果是HEVRNA流行率为0.03%。基于在这项研究中展现的性能,HEV测定法对于对血液捐献筛选HEVRNA会是有用的。
序列
表25:例示性寡聚体序列,参照序列,和区
注意,本文中和序列表中以DNA显示扩增子和部分扩增子序列,然而,普通技术人员理解,TMA反应期间生成的扩增产物是RNA或DNA任一,取决于扩增循环中的阶段。本文中提供DNA名称,仅仅是出于方便,并非限制。1第1位处的N为C或不存在,第16位处的N为G或不存在,而第17位处的N为G或不存在。在一些实施方案中,如果第16位处的N为G且第17位处的N不存在,那么第1位处的N为C。
根据上文会领会的是,虽然本文中已经出于例示目的描述了本发明的具体实施方案,但是可以进行各种更改而不背离本发明的精神和范围。因而,本发明不受除所附权利要求书以外的限制。据此通过援引完整收录本文中引用的所有出版物,专利,和专利申请用于所有目的。
Claims (146)
1.用于测定样品中戊型肝炎病毒(HEV)的存在或缺失的至少两种寡聚体的组合,所述寡聚体组合包含:
至少两种用于扩增HEV靶核酸的靶区的扩增寡聚体,其中
(a)至少一种扩增寡聚体选自下组:
(i)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:63的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:26的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(ii)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;且
(b)至少一种扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:47的序列中含有的约17至约28个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:25的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
2.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:13的序列中含有的约14至约20个核苷酸。
3.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,SEQIDNO:54,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
4.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
5.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29和SEQIDNO:64,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
6.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
7.权利要求6的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
8.权利要求6的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
9.权利要求8的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
10.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:31,SEQIDNO:62,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
11.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,SEQIDNO:49,SEQIDNO:50,SEQIDNO:51,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
12.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
13.权利要求11或12的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
14.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:46,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
15.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
16.权利要求1至15任一项的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含(a)(i)中的扩增寡聚体和(a)(ii)中的扩增寡聚体。
17.权利要求16的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(i)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
18.权利要求17的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
19.权利要求17的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(i)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:62,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
20.权利要求16至19任一项的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(ii)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,和SEQIDNO:54,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
21.权利要求16至19任一项的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(ii)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
22.权利要求16的至少两种寡聚体的组合,其中
(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
23.权利要求16的至少两种寡聚体的组合,其中
(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29或SEQIDNO:31的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
24.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含(a)(ii)中的第一扩增寡聚体和(a)(ii)中的第二扩增寡聚体。
25.权利要求24的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(ii)中的第一和第二扩增寡聚体均包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
26.权利要求25的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(ii)的第一和第二扩增寡聚体均包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
27.权利要求25的至少两种寡聚体的组合,其中(a)(ii)的第一和第二扩增寡聚体均包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
28.权利要求27的至少两种寡聚体的组合,其中
(a)(ii)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(a)(ii)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
29.权利要求1至28任一项的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含(b)中的第一扩增寡聚体和(b)中的第二扩增寡聚体。
30.权利要求29的至少两种寡聚体的组合,其中(b)中的第一扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
31.权利要求29的至少两种寡聚体的组合,其中(b)中的第一扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
32.权利要求29的至少两种寡聚体的组合,其中
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
33.权利要求30或32的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
34.权利要求29的至少两种寡聚体的组合,其中
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:23或SEQIDNO:51的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:45的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
35.权利要求1至15任一项的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含(a)(i)中的扩增寡聚体,(a)(ii)中的扩增寡聚体,(b)中的第一扩增寡聚体,和(b)中的第二扩增寡聚体。
36.权利要求35的至少两种寡聚体的组合,其中
(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
37.权利要求35的至少两种寡聚体的组合,其中
(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
38.权利要求36或37的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
39.权利要求1至15任一项的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含(a)(ii)中的第一扩增寡聚体,(a)(ii)中的第二扩增寡聚体,(b)中的第一扩增寡聚体,和(b)中的第二扩增寡聚体。
40.权利要求39的至少两种寡聚体的组合,其中
(a)(ii)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(a)(ii)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:46的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
41.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中
(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;且
(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
42.权利要求41的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含一套第一,第二,和第三扩增寡聚体,它们分别包含一套第一,第二,和第三靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:24,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(ii)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(iii)SEQIDNO:29,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(iv)SEQIDNO:66,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(v)SEQIDNO:65,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;和
(vi)SEQIDNO:62,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
43.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:54,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:52,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xiii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiv)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
44.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:54,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,45,46,或47,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,56,48,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,24,45,56,或50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,24,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiii)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
45.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:48,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,52,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(x)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
46.权利要求1的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,61,62,64,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:33,34,35,62,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:54,62,或64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(ix)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,33,34,35,53,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
47.权利要求41至46任一项的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
48.权利要求1至47任一项的至少两种寡聚体的组合,其中(b)中的至少一种扩增寡聚体为启动子引物,其进一步包含位于靶杂交序列5'的启动子序列。
49.权利要求48的至少两种寡聚体的组合,其中所述启动子序列为T7启动子序列。
50.权利要求49的至少两种寡聚体的组合,其中所述T7启动子序列具有SEQIDNO:73中所示序列。
51.权利要求1至50任一项的至少两种寡聚体的组合,其进一步包含至少一种包含如下靶杂交序列的检测探针寡聚体,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。
52.权利要求51的至少两种寡聚体的组合,其中所述检测探针靶杂交序列选自下组:SEQIDNO:37,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
53.权利要求51的至少两种寡聚体的组合,其中所述检测探针靶杂交序列选自下组:SEQIDNO:37,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
54.权利要求51至53任一项的至少两种寡聚体的组合,其中所述至少一种检测探针寡聚体在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
55.权利要求1至50任一项的至少两种寡聚体的组合,其进一步包含至少两种包含如下靶杂交序列的检测探针寡聚体,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。
56.权利要求55的至少两种寡聚体的组合,其中每种检测探针靶杂交序列个别选自下组:SEQIDNO:37,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
57.权利要求55的至少两种寡聚体的组合,其中所述至少两种检测探针寡聚体包含
第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:55或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
58.权利要求55或56的至少两种寡聚体的组合,其中所述寡聚体组合包含至少三种检测探针寡聚体。
59.权利要求58的至少两种寡聚体的组合,其中所述至少三种检测探针寡聚体包含
第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:37或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
第三检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:71或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
60.权利要求55至59任一项的至少两种寡聚体的组合,其中每种检测探针寡聚体在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
61.权利要求1至60任一项的至少两种寡聚体的组合,其进一步包含包含如下靶杂交序列的捕捉探针寡聚体,该靶杂交序列共价附着至结合固定化探针的序列或模块,其中所述靶杂交序列选自下组:SEQIDNO:4和SEQIDNO:42,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
62.权利要求61的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:4第20位处的核碱基为腺嘌呤(A)。
63.权利要求62的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:4第19位处的核碱基为胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。
64.权利要求61的至少两种寡聚体的组合,其中所述捕捉探针寡聚体具有选自下组的序列:SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43。
65.权利要求1至60任一项的至少两种寡聚体的组合,其进一步包含至少两种包含如下靶杂交序列的捕捉探针寡聚体,该靶杂交序列共价附着至结合固定化探针的序列或模块,其中每种靶杂交序列个别选自下组:SEQIDNO:4和SEQIDNO:42,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
66.权利要求65的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:4第20位处的核碱基为腺嘌呤(A)。
67.权利要求66的至少两种寡聚体的组合,其中SEQIDNO:4第19位处的核碱基为胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。
68.权利要求65的至少两种寡聚体的组合,其中所述寡聚体组合包含至少三种捕捉探针寡聚体。
69.权利要求68的至少两种寡聚体的组合,其中所述三种捕捉探针寡聚体包含
第一捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:2或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
第二捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:6或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
第三捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:42或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
70.权利要求69的至少两种寡聚体的组合,其中所述第一,第二,和第三捕捉探针寡聚体分别具有SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。
71.一种试剂盒,其包含权利要求1至70任一项的至少两种寡聚体的组合。
72.一种反应混合物,其包含权利要求1至70任一项的至少两种寡聚体的组合。
73.一种用于测定样品中戊型肝炎病毒(HEV)的存在或缺失的方法,所述方法包含:
(1)使样品与至少两种用于扩增HEV靶核酸的靶区的寡聚体接触,所述样品怀疑含有HEV,所述寡聚体组合包含
(a)至少一种选自下组的扩增寡聚体:
(i)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:63的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:26的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(ii)包含如下靶杂交序列的寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的约14至约23个连续核苷酸,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;和
(b)至少一种包含如下靶杂交序列的扩增寡聚体,该靶杂交序列为SEQIDNO:47的序列中含有的约17至约28个连续核苷酸且至少包括SEQIDNO:25的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(2)实施体外核酸扩增反应,其中使用所述样品中存在的任何HEV靶核酸作为模板来生成扩增产物;并
(3)检测扩增产物的存在或缺失,由此测定所述样品中HEV的存在或缺失。
74.权利要求73的方法,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:13的序列中含有的约14至约20个核苷酸。
75.权利要求73的方法,其中(1)(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,SEQIDNO:54,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
76.权利要求73的方法,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66。
77.权利要求73的方法,其中(1)(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29和SEQIDNO:64,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
78.权利要求73的方法,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
79.权利要求78的方法,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
80.权利要求78的方法,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
81.权利要求80的方法,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
82.权利要求73的方法,其中(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:31,SEQIDNO:62,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
83.权利要求73的方法,其中(1)(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:24,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,SEQIDNO:49,SEQIDNO:50,SEQIDNO:51,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
84.权利要求73的方法,其中(1)(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
85.权利要求83或84的方法,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
86.权利要求73的方法,其中(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:46,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
87.权利要求73的方法,其中(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
88.权利要求73至87任一项的方法,其中所述至少两种用于扩增HEV靶区的寡聚体包含(1)(a)(i)中的扩增寡聚体和(1)(a)(ii)中的扩增寡聚体。
89.权利要求88的方法,其中(1)(a)(i)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:61,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
90.权利要求89的方法,其中(1)(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
91.权利要求89的方法,其中(a)(i)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:62,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
92.权利要求88至91任一项的方法,其中(1)(a)(ii)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:32,SEQIDNO:52,SEQIDNO:53,和SEQIDNO:54,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
93.权利要求92的方法,其中(1)(a)(ii)中的扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
94.权利要求88的方法,其中
(1)(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(1)(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
95.权利要求88的方法,其中
(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29或SEQIDNO:31的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
96.权利要求73的方法,其中所述至少两种用于扩增HEV靶区的寡聚体包含(a)(ii)中的第一和第二扩增寡聚体。
97.权利要求96的方法,其中(a)(ii)中的第一和第二扩增寡聚体均包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列为SEQIDNO:16的序列中含有的15至17个核苷酸且至少包括SEQIDNO:27的序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
98.权利要求97的方法,其中(a)(ii)的第一和第二扩增寡聚体均包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,和SEQIDNO:32,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
99.权利要求97的方法,其中(a)(ii)的第一和第二扩增寡聚体均包含SEQIDNO:28的靶杂交序列,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
100.权利要求99的方法,其中
(a)(ii)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(a)(ii)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
101.权利要求73至100任一项的方法,其中所述至少两种用于扩增HEV靶区的寡聚体包含(1)(b)中的第一和第二扩增寡聚体。
102.权利要求101的方法,其中(1)(b)中的第一扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
103.权利要求101的方法,其中(b)中的第一扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQIDNO:45,SEQIDNO:46,和SEQIDNO:51,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
104.权利要求101的方法,其中
(1)(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(1)(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
105.权利要求102或104的方法,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
106.权利要求101的方法,其中
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:23或SEQIDNO:51的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:45的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
107.权利要求73至87任一项的方法,其中所述至少两种用于扩增HEV靶区的寡聚体包含(1)(a)(i)中的扩增寡聚体,(1)(a)(ii)中的扩增寡聚体,(1)(b)中的第一扩增寡聚体,和(1)(b)中的第二扩增寡聚体。
108.权利要求107的方法,其中
(1)(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:64的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(1)(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(1)(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(1)(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
109.权利要求107的方法,其中
(a)(i)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(a)(ii)中的扩增寡聚体包含SEQIDNO:65的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:56的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
110.权利要求108或109的方法,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
111.权利要求73至87任一项的方法,其中所述至少两种用于扩增HEV靶区的寡聚体包含(a)(ii)中的第一扩增寡聚体,(a)(ii)中的第二扩增寡聚体,(b)中的第一扩增寡聚体,和(b)中的第二扩增寡聚体。
112.权利要求111的方法,其中
(a)(ii)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:29的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(a)(ii)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:32的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(b)中的第一扩增寡聚体包含SEQIDNO:24的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;且
(b)中的第二扩增寡聚体包含SEQIDNO:46的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
113.权利要求73的方法,其中
(a)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:29,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,和SEQIDNO:66,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;且
(b)的至少一种扩增寡聚体包含选自下组的靶杂交序列:SEQIDNO:24和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
114.权利要求113的方法,其中所述组合包含一套第一,第二,和第三扩增寡聚体,它们分别包含一套第一,第二,和第三靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:24,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(ii)SEQIDNO:65,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(iii)SEQIDNO:29,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(iv)SEQIDNO:66,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;
(v)SEQIDNO:65,SEQIDNO:24,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物;和
(vi)SEQIDNO:62,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:56,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物。
115.权利要求73的至少两种寡聚体的组合,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:54,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,24,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:52,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xiii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiv)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,22,23,24,45,56,48,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
116.权利要求73的方法,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:54,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:53,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,49,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:30,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:21,56,48,50,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:65,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,56,或51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,24,45,56,或50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:62,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,23,24,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(x)(A)SEQIDNO:35,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xi)(A)SEQIDNO:34,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(xii)(A)SEQIDNO:33,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:23,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(xiii)(A)SEQIDNO:61,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:22,45,或56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
117.权利要求73的方法,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:48,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,52,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ix)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(x)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,31,33,34,35,53,54,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
118.权利要求73的方法,其中所述组合包含一套第一和第二扩增寡聚体,它们分别包含一套第一(A)和第二(B)靶杂交序列,其中该套靶杂交序列选自下组:
(i)(A)SEQIDNO:49,包括其RNA等同物和DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(ii)(A)SEQIDNO:50,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29或31,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iii)(A)SEQIDNO:51,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,31,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(iv)(A)SEQIDNO:21,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(v)(A)SEQIDNO:22,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,61,62,64,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vi)(A)SEQIDNO:23,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:33,34,35,62,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(vii)(A)SEQIDNO:24,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:54,62,或64,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
(viii)(A)SEQIDNO:56,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:29,30,33,34,35,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
(ix)(A)SEQIDNO:45,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物,和
(B)SEQIDNO:31,33,34,35,53,61,62,64,65,或66,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
119.权利要求113至118任一项的方法,其中SEQIDNO:56第1位处的核碱基为鸟嘌呤(G)。
120.权利要求73至119任一项的方法,其中(1)(b)中的至少一种扩增寡聚体为启动子引物,其进一步包含位于靶杂交序列5'的启动子序列。
121.权利要求120的方法,其中所述启动子序列为T7启动子序列。
122.权利要求121的方法,其中所述T7启动子序列具有SEQIDNO:73中所示序列。
123.权利要求73至122任一项的方法,其进一步包含在步骤(1)之前自样品中的其它成分纯化HEV靶核酸。
124.权利要求123的方法,其中所述纯化步骤包含使所述样品与至少一种包含如下靶杂交序列的捕捉探针寡聚体接触,该靶杂交序列共价附着至结合固定化探针的序列或模块,其中所述靶杂交序列选自下组:SEQIDNO:4和SEQIDNO:42,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
125.权利要求124的方法,其中SEQIDNO:4第20位处的核碱基为腺嘌呤(A)。
126.权利要求125的方法,其中SEQIDNO:4第19位处的核碱基为胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。
127.权利要求124的方法,其中所述纯化步骤包含使所述样品与至少三种捕捉探针寡聚体接触。
128.权利要求127的方法,其中所述三种捕捉探针寡聚体包含
第一捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:2的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
第二捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:6的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
第三捕捉探针寡聚体,其包含SEQIDNO:42的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
129.权利要求128的方法,其中所述第一,第二,和第三捕捉探针寡聚体分别具有SEQIDNO:3,SEQIDNO:7,和SEQIDNO:43的序列。
130.权利要求73至129任一项的方法,其中所述检测步骤(3)包含使所述体外核酸扩增反应与至少一种配置成在测定扩增产物的存在或缺失的条件下与扩增产物特异性杂交的检测探针寡聚体接触,由此测定所述样品中HEV的存在或缺失。
131.权利要求130的方法,其中所述至少一种检测探针寡聚体包含如下靶杂交序列,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。
132.权利要求131的方法,其中所述检测探针靶杂交序列选自下组:SEQIDNO:37,SEQIDNO:41,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
133.权利要求131的方法,其中所述检测探针靶杂交序列选自下组:SEQIDNO:37,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
134.权利要求131至133任一项的方法,其中所述至少一种检测探针寡聚体在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
135.权利要求130的方法,其中所述检测步骤包含使所述体外核酸扩增反应与至少两种包含如下靶杂交序列的检测探针寡聚体接触,该靶杂交序列长约14至约28个核苷酸且配置成与SEQIDNO:39或其互补物内含有的靶序列特异性杂交。
136.权利要求135的方法,其中每种检测探针靶杂交序列个别选自下组:SEQIDNO:37,SEQIDNO:41,SEQIDNO:55,SEQIDNO:67,和SEQIDNO:71,包括其互补物,DNA等同物,和DNA/RNA嵌合物。
137.权利要求135的方法,其中所述至少两种检测探针寡聚体包含
第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:55或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其RNA等同物或DNA/RNA嵌合物。
138.权利要求135或136的方法,其中所述检测步骤包含使所述体外核酸扩增反应与至少三种检测探针寡聚体接触。
139.权利要求138的方法,其中所述至少三种检测探针寡聚体包含
第一检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:37或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;
第二检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:67或其互补物的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA嵌合物;和
第三检测探针寡聚体,其包含SEQIDNO:71的靶杂交序列,或其DNA等同物或DNA/RNA等同物。
140.权利要求135至139任一项的方法,其中每种检测探针寡聚体在核酸主链中的一个或多个联接处含有2'-甲氧基主链。
141.权利要求130至140任一项的方法,其中所述至少一种检测探针寡聚体包含选自下组的标记物:
(a)化学发光标记物;
(b)发荧光标记物;
(c)淬灭剂;和
(d)(a),(b),和(c)中一项或多项的组合。
142.权利要求141的方法,其中所述至少一种检测探针寡聚体包含化学发光标记物。
143.权利要求141的方法,其中所述检测步骤(3)在同质检测系统中检测至少一种带标记物的检测探针寡聚体与扩增产物的杂交。
144.权利要求143的方法,其中所述标记物为在所述至少一种检测探针寡聚体的两个核碱基之间连接的化学发光吖啶(acridinium)酯(AE)化合物。
145.权利要求73至144任一项的方法,其中步骤(2)处的扩增反应为等温扩增反应。
146.权利要求145的方法,其中所述等温扩增反应为转录介导的扩增(TMA)反应。
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