CN101603097A - 戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents
戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101603097A CN101603097A CNA2009100861635A CN200910086163A CN101603097A CN 101603097 A CN101603097 A CN 101603097A CN A2009100861635 A CNA2009100861635 A CN A2009100861635A CN 200910086163 A CN200910086163 A CN 200910086163A CN 101603097 A CN101603097 A CN 101603097A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- hepatitis
- pcr amplification
- virus
- detection kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用。本发明的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒含有4条引物，所述4条引物的核苷酸序列为序列表中序列1至序列4所示。所述试剂盒还含有2条阳性对照引物，所述阳性对照引物的核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示。本发明的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒可用于临床诊断、监测，科研及大规模的流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用。
背景技术
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的一种急性、自限性病毒性肝炎，主要经粪-口途径传播。临床表现类似甲型肝炎，但黄疸较为常见，孕妇感染后病情通常较重，死亡率达20％。我国是戊型肝炎的高发区，自1982年起发现戊型肝炎病例，至今先后已有10余次戊肝暴发流行的报道。对我国13个省市、自治区的63个疾病监测点的31,120名1～59岁研究对象进行的血清流行病学调查结果表明，HEV抗体阳性率为17％。HEV带来了沉重的经济负担，成为不可忽视的公共卫生问题。
HEV是一种RNA病毒，只有一个血清型，各地毒株间差异很大，可分为4个基因型。不同基因型致病性、地域分布等存在很大差异。很多学者证实HE是一种新发现的人兽共患传染病，猪是本病重要的贮存宿主。日本等国家已发现多起因食用半生猪肝而发生感染的报道。我们的研究表明，屠宰场、市售猪肝中均能检测出HEV。
目前还没有研制出有效疫苗，细胞培养也非常困难，加之病毒粒子很不稳定，严重制约了对HEV的研究。目前已有酶联免疫吸附试验(ELISA)法抗体检测试剂盒投入市场，可用于血清流行病学调查。但对病毒的检测，只能采用巢氏PCR法检测。现有的PCR检测法不仅费时、费力，且面临假阳性等问题，亟待对本法进行标准化，将其研发为试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用。
本发明所提供的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒含有4条引物，所述4条引物的核苷酸序列为序列表中序列1至序列4所示。
其中，所述试剂盒还含有2条阳性对照引物，所述阳性对照引物的核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示。
当然，本发明的试剂盒还含有PCR扩增所需要的其他试剂，如dNTP、PCR buffer、Taq酶等。
本发明的另一个目的是提供一种检测戊型肝炎病毒的方法，是以待测样品的cDNA为模板，以序列表中序列1和序列表中序列2所示的DNA分子为引物进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；以所述第一轮PCR扩增产物为模板，以序列表中序列3和序列表中序列4所示的DNA分子为引物进行第二论PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物；琼脂糖凝胶电泳检测所述第二轮PCR扩增产物，100-150bp之间有条带为戊型肝炎病毒阳性。
所述方法中还包括以序列表中序列5和序列6的DNA分子为引物，以待测样品的cDNA为模板，进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增产物，150-200bp之间有条带。
本发明的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒中含有的引物是根据HEV保守区域设计简并引物能检测出所有已报道的毒株。特异性、灵敏度均高于其它方法，同时扩增片段仅130bp左右，减少了扩增时间。以扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为阳性对照，防止扩增失败和假阳性的出现。本发明的检测戊型肝炎病毒的方法实现了对肝脏中病毒的快速检测，6小时左右即可获得结果进一步结合测序，可对HEV基因型、亚型进行鉴定。本发明的戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒可用于临床诊断、监测，科研及大规模的流行病学调查。
附图说明
图1为PCR鉴定戊型肝炎病毒结果。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
本发明通过对Genebank中登录HEV序进行比对，从保守区设计2对简并引物，建立RT巢氏PCR方法；以猪肝脏为样品，Trizol法提取总RNA，经逆转录后获得cDNA，以戊型肝炎病毒特异引物进行PCR扩增；以持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因表达产物为检测对象设阳性对照，另设阴性对照。
实施例1、戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒检测戊型肝炎病毒
新鲜的肝脏样品加入液氮研磨，用1.5ml离心管分装后-80℃冻存。取1管研磨的肝组织，加入1ml Trizol，轻轻混匀，裂解5min。加入0.2ml的氯仿，盖上离心管盖，剧烈混匀10秒，静止5min，4℃，12000rpm离心10min。将水相转移到新的1.5ml离心管，加入0.5ml异丙醇，室温放置5min，4℃，12000rpm离心10min沉淀RNA。弃去上清，加入1ml 75％的乙醇摇匀，4℃，1000rpm离心5min。倾去乙醇，室温放置15min挥发乙醇，加30μlDEPC处理水溶解，得到总RNA。
取0.2ml PCR管，依次加入下列试剂：DEPC处理水5.5μl、5×PCR buffer5μl、10mM dNTP 2μl、MMLV 1μl、RNA抑制剂1μl、Ol igo(16T)0.5μl、总RNA 10μl，混匀后，置PCR仪中，42℃30min，99℃5min，4℃5min，获得cDNA。
第一轮PCR扩增：
待检样品：取0.2ml PCR管，依次加入下列试剂：
ddH2O 17μl
HEV164F1 0.5μl
HEV164R1 0.5μl
dNTP 0.5μl
10×PCR buffer 2.5μl
Taq酶(2u/μl) 1μl
cDNA 4μl
HE164F1：5’-CCR GCR GTG GTT TCT GGG GTG-3’(序列表中序列1)；
HE164R1：5’-TGG GMY TGG TCD CGC CAA G-3’(序列表中序列2)。
阴性对照：以灭菌水为模板，引物同待检样品。
阳性对照：以GAPDH-F和GAPDH-R为扩增引物，模板同待检样品。
GAPDH-F：5’-GTC CAC TGG TGT CTT CAC GA-3’(序列表中序列5)；
GAPDH-R：5’-GCT GAC GAT CTT GAG GGT-3’(序列表中序列6)。
PCR扩增程序：94℃2min；[94℃30s、58℃30S、72℃30S；30个循环]；72℃7min。
第二轮PCR扩增：
取2μl待检样品和阴性对照的第一轮PCR产物作为模板，以HEV137F2、HEV137R2为引物进行第二轮扩增，PCR扩增程序同第一轮PCR扩增。
HE137F2：5’-GGG YTG ATT CTC AGC CCT TCG-3’(序列表中序列3)；
HE137R2：5’-GMY TGG TCD CGC CAA GHG G-3’(序列表中序列4)。
配制2％琼脂糖凝胶，取5μl待检样品和阴性对照的第二轮产物，取5μl阳性对照的第一轮产物，与1μl上样缓冲液混合后加样，100-120V，电泳20-30min，紫外灯下观察结果。
PCR结果如图1所示，阴性对照无产物条带、阳性对照出现150bp的目标片段，待检样品中有130bp左右的条带，说明待检样品为HEV阳性。
图1中1，2泳道为阳性对照，150bp；3，4泳道为待检样品；M：DNA marker DL2000。
对扩增产物进行测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列与GenBank号AJ272108至5′末端第5315-5451位的同源性应在74％-100％，根据同源性的高低可鉴定其基因型为1，2，3或4型。其中一个PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7。
序列表
<110>中国农业大学
<120>戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用
<160>6
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<220>
<221>misc_feature
<223>r＝A或G
<400>1
ccrgcrgtgg tttctggggt g 21
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<220>
<221>misc_feature
<223>Y＝C或T；M＝A或C
<400>2
tgggmytggt cdcgccaag 19
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<220>
<221>misc_feature
<223>Y＝C或T
<400>3
gggytgattc tcagcccttc g 21
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<220>
<221>misc_feature
<223>M＝A或C；Y＝C或T；H＝A或C或T；D＝A或G或T
<400>4
gmytggtcdc gccaaghgg 19
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gtccactggt gtcttcacga 20
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gctgacgatc ttgaggg t 18
<210>7
<211>137
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
gggttgattc tcagcccttc gccctcccct atattcatcc aaccaacccc ttcgcatctg 60
acattccagc cgccgccggg actggagctc gccctcggca gccaatccgt ccactcggct 120
ccgcttggcg tgaccag 137
Claims (5)
1、戊型肝炎病毒的检测试剂盒，含有4条引物，所述4条引物的核苷酸序列为序列表中序列1至序列4所示。
2、根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有2条阳性对照引物，所述阳性对照引物的核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示。
3、一种检测戊型肝炎病毒的方法，是以待测样品的cDNA为模板，以序列表中序列1和序列表中序列2所示的DNA分子为引物进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；以所述第一轮PCR扩增产物为模板，以序列表中序列3和序列表中序列4所示的DNA分子为引物进行第二论PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物；琼脂糖凝胶电泳检测所述第二轮PCR扩增产物，100-150bp之间有条带的为戊型肝炎病毒阳性。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括以序列表中序列5和序列6的DNA分子为引物，以待测样品的cDNA为模板，进行PCR扩增。
5、权利要求1或2所述的检测试剂盒在检测戊型肝炎病毒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100861635A CN101603097A (zh) | 2009-06-15 | 2009-06-15 | 戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100861635A CN101603097A (zh) | 2009-06-15 | 2009-06-15 | 戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101603097A true CN101603097A (zh) | 2009-12-16 |
Family
ID=41468997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2009100861635A Pending CN101603097A (zh) | 2009-06-15 | 2009-06-15 | 戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101603097A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10047406B2 (en) | 2013-08-14 | 2018-08-14 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid |
-
2009
- 2009-06-15 CN CNA2009100861635A patent/CN101603097A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10047406B2 (en) | 2013-08-14 | 2018-08-14 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jeong et al. | Viable SARS-CoV-2 in various specimens from COVID-19 patients | |
| Lin et al. | Basal core‐promoter mutant of hepatitis B virus and progression of liver disease in hepatitis B e antigen‐negative chronic hepatitis B | |
| Christdas et al. | Genotypes of hepatitis C virus in the Indian sub-continent: A decade-long experience from a tertiary care hospital in South India | |
| Soetjipto et al. | Differential prevalence of hepatitis C virus subtypes in healthy blood donors, patients on maintenance hemodialysis, and patients with hepatocellular carcinoma in Surabaya, Indonesia | |
| Sung et al. | Comparative evaluation of three homogenization methods for isolating Middle East respiratory syndrome coronavirus nucleic acids from sputum samples for real-time reverse transcription PCR | |
| Liu et al. | A generic real-time TaqMan assay for specific detection of lapinized Chinese vaccines against classical swine fever | |
| Chen et al. | Occult HBV infection in patients with autoimmune hepatitis: a virological and clinical study | |
| Gan et al. | The relationship between serum exosome HBV-miR-3 and current virological markers and its dynamics in chronic hepatitis B patients on antiviral treatment | |
| Yu et al. | Identification of a novel cosavirus species in faeces of children and its relationship with acute gastroenteritis in China | |
| Xu et al. | As the SARS-CoV-2 virus evolves, should Omicron subvariant BA. 2 be subjected to quarantine, or should we learn to live with it? | |
| Yao et al. | Role of human papillomavirus and associated viruses in bladder cancer: An updated review | |
| Sun et al. | Isolation, identification, and pathogenicity of porcine epidemic diarrhea virus | |
| Treso et al. | Molecular epidemiology of hepatitis C virus genotypes and subtypes among injecting drug users in Hungary | |
| Tanaka et al. | African origin of GB virus C/hepatitis G virus | |
| Chaudhuri et al. | Molecular epidemiology of HCV infection among acute and chronic liver disease patients in Kolkata, India | |
| McPhee et al. | Impact of preexisting hepatitis C virus genotype 6 NS3, NS5A, and NS5B polymorphisms on the in vitro potency of direct-acting antiviral agents | |
| Verma et al. | Genotypic characterization of hepatitis C virus and its significance in patients with chronic liver disease from Northern India | |
| Us et al. | The distribution of hepatitis C virus genotypes of patients with chronic hepatitis C infection in the Eskisehir region of Turkey | |
| CN101603097A (zh) | 戊型肝炎病毒的快速检测试剂盒及其应用 | |
| Toan et al. | Identification of BK virus genotypes in recipients of renal transplant in Vietnam | |
| Wang et al. | Development of a triplex real-time RT-PCR assay for detection and differentiation of three US genotypes of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus | |
| Chandra et al. | Genotyping of Hepatitis C virus (HCV) in infected patients from South India | |
| Tao et al. | Genomic characterization of an enterovirus 97 strain isolated in Shandong, China | |
| Hamoudi et al. | Hepatitis B genotypic and serologic characteristics in Jordan | |
| Kuntzen et al. | A set of reference sequences for the hepatitis C genotypes 4d, 4f, and 4k covering the full open reading frame |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20091216 |