CN109234432A - 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒，该引物对包含如SEQ ID NO.1所示正向引物F‑primer和如SEQ ID NO.2所示的反向引物R‑primer；该探针Probe的序列如SEQ ID NO.3所示。与传统的依据形态特征来鉴定瓜果腐霉菌的检测技术相比，本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为瓜果腐霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的高灵敏度快速检测。

Description

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探 针和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒。
背景技术
大豆猝倒病是大豆生产上的一种常见病害，其主要病原菌为瓜果腐霉菌。该病原菌主要侵染大豆幼苗的茎基部，近地表的幼茎发病初现水渍状条斑，随后病部变软缢缩，呈黑褐色，病苗很快倒折、枯死。根部受害后初呈不规则形褐色斑点，严重的引起根腐，地上部茎叶萎蔫或黄化。目前对大豆猝倒病还没有比较有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病害的最有效措施。为此应建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于大豆猝倒病造成的损失。
目前，针对瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的检测技术较少。传统的检测方法主要是依据瓜果腐霉菌的形态进行鉴定。由于腐霉生长受温度影响形态不稳定，给检测带来了巨大困难。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到瓜果腐霉菌的检测中，包括Real-time PCR技术等。虽然Real-time PCR技术在特异性和灵敏度上有了较大的提高，但是检测时间仍然比较长，同时依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。RPA反应主要依赖三种酶：重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白，这三种酶的复合物在常温下有活性，在基于实时荧光探针的RPA测定中需要引入Twist Amp exo探针，其中荧光信号的产生依赖于在RPA的扩增产物与Twist Amp exo探针结合时，exo作为一种DNA修复酶，识别内部空碱基位点(四氢呋喃，THF)并切割探针，使荧光基团和淬灭基团分离从而产生荧光。RPA技术操作方便，耗时短，特异性和灵敏度均高，能够进行定量分析，非常适合于现场检测。短短几年，该技术蓬勃发展，目前在疾病诊断，病原检测，转基因检测中等领域广泛使用，但在植物病原菌的检测报道很少。
本发明通过序列比对分析瓜果腐霉菌和其它腐霉菌在基因组序列上的差异，设计了瓜果腐霉菌特异性的引物和探针，在此基础上建立了瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的重组酶聚合酶快速检测方法。
发明内容
针对现有技术中瓜果腐霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的引物对和探针，该引物对包含如SEQ ID NO.1所示正向引物F-primer和如SEQ ID NO.2所示的反向引物R-primer；该探针Probe的序列如SEQ ID NO.3所示。
上述的引物对和探针在检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病中的应用。
上述的引物对和探针在制备用于检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的试剂盒中的应用。
一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物对和探针。
该试剂盒还包含有重组酶聚合酶扩增技术中常用的试剂。
上述试剂盒中各试剂的浓度为：29.5μL Rehydration Buffer，8.2μL DEPC处理水，正向引物和反向引物的终浓度分别为420nmol·L-1，探针的终浓度为120nmol·L-1，MgAC终浓度为14mmol·L-1，5μL DNA模板。
上述的试剂盒在检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病中的应用。
一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的方法，提取待检微生物的DNA，以待检微生物的DNA为模板，采用上述的引物对和探针进行重组酶聚合酶扩增，然后检测反应产物的荧光强度，通过反应产物荧光值，来判断瓜果腐霉菌的有无。所述重组酶聚合酶扩增的反应程序为：39℃反应扩增30min。
该方法的具体步骤为：提取待检微生物的DNA，取5μL DNA溶液作为反应模板，加入45μL试剂盒中的检测溶液进行RPA，RPA反应程序为：39℃反应扩增30min，然后使用多功能酶标仪来检测反应产物的荧光强度。
本发明的检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的方法，以提取的DNA为模板，利用所述的RPA引物和探针进行RPA反应；由于探针包含荧光基团和淬灭基团，两个基团同时存在时，探针不会发出荧光，当探针与扩增产物结合时，会识别THF位点并剪切探针，切除淬灭基团从而产生荧光，扩增产物的形成与荧光量成正比，RPA实时荧光定量检测可在荧光定量PCR仪、多功能酶标仪等仪器上进行。因此，反应结束后通过反应产物荧光值，来判断瓜果腐霉菌的有无。
本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
(1)操作方便：本发明提供的检测瓜果腐霉菌的RPA方法克服了现有技术中瓜果腐霉菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测瓜果腐霉菌的问题。本发明检测方法在39℃等温条件下，只需30min就能准确、快速、高效地检测到瓜果腐霉菌，对实验场所的要求简单，不需要复杂仪器，能较好满足对瓜果腐霉菌的现场检测。
(2)准确性高：由于传统瓜果腐霉菌检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，而瓜果腐霉菌的生长受温度影响形态不稳定，同时受到相近种的影响，很难准确鉴定出来。而本发明根据瓜果腐霉菌的基因组序列，利用Blast软件将瓜果腐霉菌的基因组序列与其它腐霉的基因组序列进行比较，选取了瓜果腐霉菌特有的一段序列并设计特异性的RPA引物和探针。RPA的引物比较长，因此其特异性比较高。
(3)灵敏度高：本发明建立的瓜果腐霉菌的RPA检测方法，灵敏度非常高，可以达到3.75fg DNA，表明该检测方法足以在DNA浓度较低情况下准确快速地检测出瓜果腐霉菌。
附图说明
图1为瓜果腐霉菌RPA引物和探针的特异性验证结果：
使用瓜果腐霉菌的RPA特异性引物和探针对不同病原菌进行RPA检测，结果显示：只有瓜果腐霉菌的反应产物荧光值随着时间延长而不断上升，而其他腐霉菌在整个反应过程中的荧光值没有任何变化。
图2为瓜果腐霉菌RPA检测方法的灵敏度验证结果：
基于反应产物的荧光强度检测RPA方法的灵敏度，设置瓜果腐霉菌的模板浓度范围为37.5ng-3.75fg。结果显示：随着RPA反应不断进行，所设不同DNA浓度的荧光值都随着时间延长而不断上升，而且荧光强度随着DNA模板量的降低而降低。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例做进一步的说明，但并非仅限用于这些例子。
实施例1：利用RPA方法检测瓜果腐霉菌
用于检测瓜果腐霉菌的RPA引物和探针：正向引物F-primer如SEQ ID NO.1所示，反向内引物R-primer如SEQ ID NO.2所示，探针Probe如SEQ ID NO.3所示。
检测瓜果腐霉菌的RPA试剂盒中总体积为50μL，各试剂浓度为：29.5μLRehydrationBuffer，8.2μL DEPC处理水，正向引物和反向引物的终浓度为420nmol·L-1，探针的终浓度为120nmol·L-1，MgAC终浓度为14mmol·L-1，5μL DNA模板。
RPA检测方法：提取待检微生物的DNA，取5μL DNA溶液作为反应模板，加入45μL试剂盒中的检测溶液进行RPA，RPA反应程序为：39℃反应扩增30min，然后使用多功能酶标仪来检测反应产物的荧光强度。
为了验证RPA方法的特异性，以终极腐霉菌、刺腐霉、旋柄腐霉和畸雌腐霉为供试材料，RPA检测结果显示瓜果腐霉的反应产物荧光值随着时间延长而不断上升，而其他腐霉菌在整个反应过程中的荧光值没有任何变化，说明RPA方法能特异性地检测到瓜果腐霉菌(图1)。
实施例2：瓜果腐霉菌RPA反应的灵敏度试验
为了确定RPA检测方法的灵敏度，将提取的瓜果腐霉菌的DNA用分光光度计测定浓度后进行10倍比稀释，设置DNA浓度范围为37.5ng-3.75fg，分别取稀释后的各浓度DNA稀释液5μL作为模板，加入45μL试剂盒溶液进行RPA反应，反应程序为：39℃反应扩增30min。结果显示：随着RPA反应不断进行，所设不同DNA浓度的荧光值都随着时间延长而不断上升，而且荧光强度随着DNA模板量的降低而降低，说明当DNA浓度为3.75fg时就足以用RPA方法检测出来(图2)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taccgatgga gtgacagaag agacgagtga 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctttgtgtc tttcttgcct cctgcctttg 30
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taagaccaag accaagacga gtgaggcggg aagcagcgag ggctcaag 48

Claims (9)

1.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的引物对和探针，其特征在于，该引物对包含：如SEQ ID NO.1所示正向引物F-primer和如SEQ ID NO.2所示的反向引物R-primer；该探针Probe的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的引物对和探针在检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病中的应用。
3.权利要求1所述的引物对和探针在制备用于检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的试剂盒中的应用。
4.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1所述的引物对和探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包含有重组酶聚合酶扩增技术中常用的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中各试剂的浓度为：29.5μLRehydration Buffer，8.2μL DEPC处理水，正向引物和反向引物的终浓度分别为420nmol·L-1，探针的终浓度为120nmol·L-1，MgAC终浓度为14mmol·L-1，5μL DNA模板。
7.权利要求4、5或6中所述的试剂盒在检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病中的应用。
8.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测瓜果腐霉菌引起的大豆猝倒病的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA，以待检微生物的DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对和探针进行重组酶聚合酶扩增，然后检测反应产物的荧光强度。
9.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：重组酶聚合酶扩增的反应程序为：39℃反应扩增30min。
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