CN113721030B - 用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用 - Google Patents

用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用，该生物标志物为MAP9、IRF9、PLEKHO2、NPM3、DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1相关自身抗体中至少一种。其中，用于桥本甲状腺炎肝气郁结证特征性自身抗体检测的生物标志物为MAP9、IRF9两种相关自身抗体；用于桥本甲状腺炎阴虚火旺证特征性自身抗体检测的生物标志物为PLEKHO2、NPM3两种相关自身抗体；用于桥本甲状腺炎脾肾阳虚证特征性自身抗体检测的生物标志物为DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种相关自身抗体。这些血清相关自身抗体标志物能反映桥本甲状腺炎的证候特征，使中医辨证精准化，有利于揭示桥本甲状腺炎的证候实质和分子内涵。

Description

用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志 物及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学技术、血清抗体组学技术领域，更具体地，本发明涉及用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用。
背景技术
桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis,HT)又称桥本氏病(Hashimoto'sdisease,HD)或慢性淋巴细胞性甲状腺炎(Chronic lymphocytic thyroiditis,CLT)，是目前最常见的器官特异性自身免疫性疾病，临床表现为甲状腺弥漫性肿大、血清甲状腺自身抗体水平升高，是导致甲状腺功能减退最常见的原因，据报道约20％-30％的患者会出现甲状腺功能减退。当前HT发病率逐年快速增加，已成为严重威胁人们健康、工作、生活的一类常见疾病。据文献报道HT全球年发病率约为每1000人0.3-1.5例，女性患病率为男性的4-10倍。我国目前尚缺乏大规模的HT流行病学调查资料，对不同地方的HT患病率相关报道1.03-23.08％不等。HT常起病隐匿，早期无特异临床症状，因此易被漏诊、误诊，多数病例以甲状腺结节、甲状腺肿大、甲状腺功能减退或合并其他形式的自身免疫性疾病而首次就诊，而且大部分患者处于未知晓状态，多在常规体检时被发现。此外，HT易发生癌变，其合并甲状腺癌的发病率国外为0.5-38％，国内为0.6-29.4％。目前对HT治疗固有地缺少有效药物，尤其发病早期缺少有效的治疗药物。
辨证论治是中医治疗疾病的优势，近年来有关中医药治疗HT的报道明显增加，在改善症状、降低甲状腺自身抗体方面具有显著疗效。证候作为中医辨证论治的基础和核心，既包含宏观的症状、体征表观，又包含脏腑、器官、组织、细胞、分子等微观物质基础的变化。随着基因组、蛋白组、转录组、代谢组等组学的发展，近年来有不少研究者运用组学技术进行生物标记物的筛选、分析、鉴定与验证，研究中医证的分子内涵，这对于从分子水平揭示证的实质，提高证候诊断的精准性，从而精确寻找到证候分子病机和治疗的靶点，为疾病诊断和治疗具有重要意义。HT患者中医证候分布规律研究发现，在HT病理过程中，初期甲状腺功能正常阶段常见肝气郁结证，在甲状腺功能亢进阶段主要是阴虚火旺证，在甲状腺功能减退阶段常见脾肾阳虚证。但目前尚未有运用组学技术研究HT的证候特征和分子病机及中医辨证论治HT的分子机制。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用，该抗体标志物能够反映桥本甲状腺炎的证候特征。
为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：
用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物，该生物标志物为MAP9、IRF9、PLEKHO2、NPM3、DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1相关自身抗体中至少一种。
进一步，用于桥本甲状腺炎肝气郁结证特征性自身抗体检测的生物标志物为MAP9、IRF9两种相关自身抗体中至少一种；优选的，为两种相关自身抗体的组合。
用于桥本甲状腺炎阴虚火旺证特征性自身抗体检测的生物标志物为PLEKHO2、NPM3两种相关自身抗体中至少一种；优选的，为两种相关自身抗体的组合。
用于桥本甲状腺炎脾肾阳虚证特征性自身抗体检测的生物标志物为DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种相关自身抗体中至少一种；优选的，为五种相关自身抗体的组合。
本发明的技术方案之一是：一种上述生物标志物在制备桥本甲状腺炎治疗药物中的应用。
本发明的技术方案之一是：一种上述生物标志物在制备桥本甲状腺炎证候特征性自身抗体检测相关试剂、试剂盒中的应用。
本发明的技术方案之一是：一种检测桥本甲状腺炎肝气郁结证特征性自身抗体试剂盒，包括MAP9、IRF9人重组蛋白中至少一种，该试剂盒用于检测血清中MAP9、IRF9两种相关自身抗体中至少一种。
本发明的技术方案之一是：一种检测桥本甲状腺炎阴虚火旺证特征性自身抗体试剂盒，包括PLEKHO2、NPM3人重组蛋白中至少一种，该试剂盒用于检测血清中PLEKHO2、NPM3两种相关自身抗体中至少一种。
本发明的技术方案之一是：一种检测桥本甲状腺炎脾肾阳虚证特征性自身抗体试剂盒，包括DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种人重组蛋白中至少一种，该试剂盒用于检测血清中DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种相关自身抗体中至少一种。
进一步，该试剂盒还包括人源IgG标准品、辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG以及ELISA技术常用的试剂。
本发明的有益效果：
为了研究HT不同证候相关自身抗体改变和证候特征性蛋白标志物及分子病机，本发明在HT甲状腺功能正常、亢进和减退的不同甲状腺功能状态病人中，分别选取肝气郁结、阴虚火旺和脾肾阳虚典型证候，运用HuProtTM人类蛋白质组芯片技术(包含>20000个新测序的重组人源蛋白质，对应16152个独特的蛋白编码基因，覆盖率高达81％，是迄今为止世界上最高通量的人重组蛋白质组芯片)对HT不同证候患者和健康对照血清进行血清抗体组学分析，筛选HT证候相关自身抗体，继而采用间接ELISA法在较大样本中对桥本甲状腺炎不同证候患者血清中潜在的特征性自身抗体进行验证检测，以获得能反映桥本甲状腺炎证候的特征性蛋白，更加清楚的揭示证的分子内涵，使中医辨证精准化，有助于从分子层面指导中医辨证，也将为桥本甲状腺炎证候实质研究提供新的参考依据。
具体地说，本发明技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：系统收集完整的桥本甲状腺炎患者基本信息、中医证候四诊信息和临床病例资料，以标准操作程序采集符合标准的血液样本。(2)从桥本甲状腺炎甲状腺功能正常、亢进和减退的不同甲状腺功能状态病人中，分别选取肝气郁结、阴虚火旺和脾肾阳虚典型证候患者血清样本。(3)运用高通量HuProtTM人类蛋白质组芯片技术分析不同证候桥本甲状腺炎患者和正常对照人群中差异表达的血清相关自身抗体，运用统计学和生物信息学方法筛选差异表达的有意义的证候特征性相关自身抗体。(4)进一步在不同证候桥本甲状腺炎患者、其他甲状腺疾病患者和正常对照者中进行大样本验证，明确这些证候特征性相关自身抗体在辨别桥本甲状腺炎不同证候蛋白中的灵敏性、特异性。(5)证候特征性相关自身抗体检测试剂盒的研制：根据不同证候桥本甲状腺炎与正常人群血清中差异表达的特征性相关自身抗体开发证候特征性蛋白检测试剂盒，使其能够反映桥本甲状腺炎证候特征，使中医辨证精准化，为桥本甲状腺炎证候实质研究提供新的参考依据。
本发明所述的应用可以检测桥本甲状腺炎中医证候特征性血清相关自身抗体，这些血清相关自身抗体标志物能反映桥本甲状腺炎的证候特征，使中医辨证精准化，有利于揭示桥本甲状腺炎的证候实质和分子内涵。
附图说明
图1为蛋白质芯片检测原理。
图2为芯片扫描质量评估结果(蛋白点样)。
注：图A为芯片扫描图：分别展示为整体扫描(左)和局部放大图(右)，其中从左至右第1-4个箭头所指为阳性对照(GST，浓度从左至右分别为10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL)，最右侧箭头为阴性对照(BSA蛋白)；图B为芯片制备重复性评价结果。
图3为桥本甲状腺炎肝气郁结证组具有显著差异的59个相关自身抗体的SNR聚类分析。
注：横向为样本，纵向为该样本对应的蛋白(IgG或IgM响应类型)。
图4为桥本甲状腺炎阴虚火旺证组具有显著差异的147个相关自身抗体的SNR聚类分析。
注：横向为样本，纵向为该样本对应的蛋白(IgG或IgM响应类型)。
图5为桥本甲状腺炎脾肾阳虚证组具有显著差异的152个相关自身抗体的SNR聚类分析。
注：横向为样本，纵向为该样本对应的蛋白(IgG或IgM响应类型)。
图6为桥本甲状腺炎不同证候组特征性相关自身抗体Venn图分析。
注：左下：HT0105：桥本甲状腺炎肝气郁结证(甲状腺功能正常)，左上：HT0610：桥本甲状腺炎阴虚火旺证(甲状腺功能亢进)，右上：HT1115：桥本甲状腺炎脾肾阳虚证(甲状腺功能减退)，右下：HT：桥本甲状腺炎整体组。
图7为桥本甲状腺炎肝郁气滞证特异性相关自身抗体的散点图和ROC曲线图。
注：HT：桥本甲状腺炎肝郁气滞证组，C：正常对照组，OTD：其他甲状腺疾病组。
图8为MAP9、IRF9两种相关自身抗体单独检测和联合检测ROC曲线图。
图9为桥本甲状腺炎阴虚火旺证特异性相关自身抗体的散点图和ROC曲线图。
注：HT：桥本甲状腺炎阴虚火旺证组，C：正常对照组，OTD：其他甲状腺疾病组。
图10为PLEKHO2、NPM3两种相关自身抗体单独检测和联合检测ROC曲线图。
图11为桥本甲状腺炎脾肾阳虚证特异性相关自身抗体的散点图和ROC曲线图。
注：HT：桥本甲状腺炎脾肾阳虚证组，C：正常对照组，OTD：其他甲状腺疾病组。
图12为DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种相关自身抗体单独检测和联合检测ROC曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、蛋白质芯片筛选桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体
1、血清标本来源
2017年1月至2019年12月从河南中医药大学第一附属医院、第三附属医院、郑州大学第一附属医院收集门诊和住院初诊的未经治疗的桥本甲状腺炎患者的静脉血清样本。从中选取15例桥本甲状腺炎不同证候患者(肝郁气滞证—甲状腺功能正常、阴虚火旺证—甲状腺功能亢进、脾肾阳虚证—甲状腺功能减退患者各5例)作为HuProtTM蛋白质组芯片检测样本，各组患者性别、年龄比较均无统计学差异。
选取5例正常(健康)对照者的静脉血清样本，正常对照者来自2017年1月至2019年12月中国人民解放军第988医院健康体检中心健康人群。正常对照者的选取要求符合以下标准：不符合桥本甲状腺炎患者诊断标准中的任何一条，甲状腺超声、TPOAb、TGAb、FT3、FT4、TSH实验室检查都正常；无重大疾病史；本人或直系亲属无自身免疫性疾病。正常对照组与桥本甲状腺炎病例按性别、年龄匹配。
2、蛋白芯片实验主要仪器设备
120090型晶芯SlideWasherTM芯片洗干仪(北京博奥晶典生物技术有限公司)、晶芯LuxScanTM 10K-A型微阵列芯片扫描仪(北京博奥晶典生物技术有限公司)、CyTM3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG(美国Jackson公司)、Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Human IgM(美国Jackson公司)、Multifuge X1R冷冻高速离心机(美国Thermo公司)。
3、蛋白质芯片检测原理
每一个样品使用1张HuProtTM蛋白质芯片进行检测，特异性的抗体(包括IgG、IgM或其它类型抗体)与固定于芯片上的蛋白进行结合，清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质，再通过荧光标记二抗Anti-human IgM(cy5标记，波长635nm)和Anti-human IgG荧光二抗(cy3标记，波长532nm)并借助荧光扫描仪数据化信号。信号的强弱与抗体的亲和力、数量呈正相关。芯片检测原理图如图1所示。
4、蛋白芯片质量控制
在高通量芯片实验前通过对芯片进行质量检测以保证标志物筛选的可靠性。蛋白芯片上的蛋白N端均带有用于该蛋白纯化的GST(谷胱甘肽S-转移酶)标签，因此利用抗GST抗体与蛋白质芯片杂交可以评估高密度蛋白质组芯片的质量。蛋白融合GST进行表达纯化，纯化后制备成芯片，并且每个蛋白重复2个点。芯片制备完成后通过Anti-GST进行芯片质量检测，蛋白点样结果展示如图2所示。从图2可知，以重复蛋白Anti-GST杂交产生的前景值为对象，通过散点图分析，线性拟合后的R2为0.98，说明芯片制备整体重复性良好；以Anti-GST杂交产生的信噪比为计算对象，通过阴性对照来评价蛋白点的检出率，由结果可知，蛋白检出率>99％，说明芯片制备合格。
5、蛋白芯片检测实验步骤
(1)封闭：将保存的蛋白芯片从-80℃取出，置于侧摆摇床，加入封闭液，室温封闭3h；
(2)血清样本孵育：弃尽封闭液，迅速加入血清孵育液(血清用孵育液稀释200倍)，置于侧摆摇床，4℃过夜孵育；
(3)清洗：用镊子将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于水平摇床，清洗液室温清洗3次，10min/次；
(4)二抗孵育：置于侧摆摇床，二抗孵育液(二抗用孵育液稀释1000倍)室温孵育1h(从此步骤开始，注意避光操作)；
(5)清洗：置于水平摇床，清洗液室温清洗3次，10min/次，完成后用超纯水室温清洗2次，10min/次；
(6)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥；
(7)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。设置参数为：Power 90％，PMTvalue650，若存在爆点，调节PMT或者Power至扫描无爆点。
6、蛋白芯片实验数据处理与统计分析
通过GenePix Pro v6.0软件读取芯片扫描结果，获取原始数据。运用R语言limma程序包对芯片数据进行处理。为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景校正方法进行处理。实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(Signal Noise Ratio,信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值。为了减少不同样品、不同芯片之间及实验操作等系统性差异带来的误差，在数据比对前对样本SNR进行归一化处理，基于归一化后的数据进行统计学分析以筛选出实验组区分于对照组的特异性响应抗体。
采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理与统计分析。对连续型变量采用Kolomogorov-Smirnov test进行正态性检验，符合正态分布的变量用表示；对于符合正态分布的连续型变量，采用t检验或单因素方差分析进行组间比较，多组间的两两比较采用Dunnett检验；对于非正态分布的连续型变量，两组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验，分类变量间比较采用χ2检验，不满足χ2检验条件的资料采用Fisher精确检验。检验水准ɑ＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。
7、抗体标志物筛选
每个芯片的23034的蛋白位点，去除芯片上ND、Control点，保留23032个蛋白位点。以归一化后的SNR值为计算对象，基于统计学方法筛选潜在的特异性高响应抗体标志物，具体分析如下：
(1)对于任意一个蛋白，假设需要比对的样本来自完全相同的两个总体，并通过Mann-Whitney U秩和检验，单尾，进行检验，并以p-value进行表征。定义，当p-value<0.05时，拒绝原假设，即两者存在显著性差异。
(2)对于任意一个蛋白，计算疾病组与健康对照组的差异表达倍数，即foldchange＝疾病组均值/健康对照组均值，用以表示疾病组高于健康对照组的程度；定义，fold change≥1.5即为潜在差异，一般认为差异倍数越大，两组间区别越明显。
(3)对于不同样本组，为避免出现阴性蛋白之间的比较，在进行样本比对前，根据归一化之后芯片上蛋白点信号SNR值的分布设置阳性蛋白判断阈值，定义IgG-SNR>4、IgM-SNR>5时判断该蛋白为阳性蛋白。在此基础上，以对照组在该蛋白上的SNR为计算对象设定cutoff阈值(cutoff-IgG≥4，cutoff-IgM≥5)，分别计算疾病组与健康对照组的阳性率，并定义疾病组最低阳性率为50％，即在该蛋白上疾病组的阳性样本个数不低于3/5或8/15个；健康对照组的最高阳性率为0％，即在该蛋白上健康对照组阳性样本个数0/5个，分别计算疾病组的阳性率(sensitivity)和健康对照组的阳性率(1-specificity)。
8、结果
8.1桥本甲状腺炎肝气郁结证相关自身抗体
通过比较桥本甲状腺炎肝气郁结证(甲状腺功能正常，HT0105)与正常健康对照组(NC)，共筛选出具有显著差异的相关自身抗体59个，其中IgG响应类型43个，IgM响应类型16个(fold change≥1.5，p-value<0.05)。其中fold change≥2的33个相关自身抗体见表1。
表1桥本甲状腺炎肝气郁结证(HT0105)与健康对照组(NC)比较具有显著差异的相关自身抗体
对筛选出的具有显著差异的59个相关自身抗体进行SNR聚类分析如图3，从无监督学习聚类结果来看，HT0105组样本与NC组样本能通过一步聚类被区分。因此，可知所筛选出的蛋白在整体的区分桥本甲状腺炎肝气郁结证组与健康对照组中，分类正确率为100％。
8.2桥本甲状腺炎阴虚火旺证相关自身抗体
通过比较桥本甲状腺炎阴虚火旺证(甲状腺功能亢进，HT0610)与正常健康对照组(NC)，共筛选出具有显著差异的相关自身抗体147个，其中IgG响应类型53个，IgM响应类型94个(fold change≥1.5，p-value<0.05)。其中fold change≥2的78个相关自身抗体见表2。
表2桥本甲状腺炎阴虚火旺证(HT0610)与健康对照组(NC)比较具有显著差异的相关自身抗体
对筛选出的具有显著差异的147个相关自身抗体进行SNR聚类分析如图4，从无监督学习聚类结果来看，HT0610组样本与NC组样本能通过一步聚类被区分。因此，可知所筛选出的蛋白在整体的区分桥本甲状腺炎阴虚火旺证组与健康对照组中，分类正确率为100％。
8.3桥本甲状腺炎脾肾阳虚证相关自身抗体
通过比较桥本甲状腺炎脾肾阳虚证(甲状腺功能减退，HT1115)与正常健康对照组(NC)，共筛选出具有显著差异的相关自身抗体152个，其中IgG响应类型91个，IgM响应类型61个(fold change≥1.5，p-value<0.05)。其中fold change≥2的73个相关自身抗体见表3。
表3桥本甲状腺炎脾肾阳虚证(HT1115)与健康对照组(NC)比较具有显著差异的相关自身抗体
对筛选出的具有显著差异的152个相关自身抗体进行SNR聚类分析如图5，从无监督学习聚类结果来看，HT1115组样本与NC组样本能通过一步聚类被区分。因此，可知所筛选出的蛋白在整体的区分桥本甲状腺炎脾肾阳虚证组与健康对照组中，分类正确率为100％。
9、桥本甲状腺炎不同证候特征性相关自身抗体筛选
由上述结果可知桥本甲状腺炎肝气郁结证组(甲状腺功能正常)筛选出59个相关自身抗体，阴虚火旺证组(甲状腺功能亢进)筛选出147个相关自身抗体，脾肾阳虚证组(甲状腺功能减退)筛选出152个相关自身抗体，利用Venn图分析得出桥本甲状腺炎不同证候组特征性相关自身抗体，四组取交集，其中本证候组有，其他证候组没有的为本证候组特征性相关自身抗体，结果见图6。由图6可以看出，桥本甲状腺炎肝气郁结证组有29个特征性自身抗体，桥本甲状腺炎阴虚火旺证组有103个特征性自身抗体，桥本甲状腺炎脾肾阳虚证组有104个特征性自身抗体。选取各证候组fold change≥5的特征性自身抗体见表4-6。
表4桥本甲状腺炎肝气郁结证特征性自身抗体(fold change≥5)
表5桥本甲状腺炎阴虚火旺证特征性自身抗体(fold change≥5)
表6桥本甲状腺炎脾肾阳虚证特征性自身抗体(fold change≥5)
从上述选取的桥本甲状腺炎不同证候组特征性相关自身抗体中，进一步选取foldchange差异倍数在5倍以上，且经GenBank数据库检索在甲状腺组织和细胞中均高表达的相关自身抗体，在较多血清样本中进行验证。肝气郁结证组待验证相关自身抗体为TNRC6C、MAP9、IRF9；阴虚火旺证组待验证相关自身抗体为PLEKHO2、NPM3；脾肾阳虚证组待验证相关自身抗体为DR1、CTDP1、KDM1A、BRMS1L、PCGF2、GPCPD1、IGBP1。
实施例2、间接ELISA实验验证筛选出的桥本甲状腺炎不同证候特征性相关自身抗体
选取待验证肝气郁结证组相关自身抗体TNRC6C、MAP9、IRF9；阴虚火旺证组相关自身抗体PLEKHO2、NPM3；脾肾阳虚证组相关自身抗体DR1、CTDP1、KDM1A、BRMS1L、PCGF2、GPCPD1、IGBP1，通过间接ELISA实验在大样本中检测上述相关自身抗体的含量，验证相关自身抗体作为检测桥本甲状腺炎不同证候特征的生物标志物的特异性、灵敏性。
2.1血清标本来源
运用PASS 15.0软件估算所需的样本量。根据本研究需求，桥本甲状腺炎患者组是正常对照组的样本量的2倍，按α＝0.05，1-β＝0.90，患者组sensitivity最低证型p1＝70％，正常对照组sensitivity p2＝10％，将正常对照组均值+2SD作为截断值，根据截断值计算研究因素在桥本甲状腺炎组与正常对照组的阳性率，二者差值应大于10％。计算得桥本甲状腺炎组约需216例病人，正常对照组约需108例，考虑脱落及失访病例，需增加10％病例，最终桥本甲状腺炎组约需240例病人，正常对照组约需120例。
所选病例均为2017年1月至2019年12月河南中医药大学第一附属医院内分泌科、第三附属医院内分泌科、郑州大学第一附属医院甲状腺外科门诊和住院初诊的未经药物或其他治疗的桥本甲状腺炎患者。从收集到的各证型桥本甲状腺炎患者中选取甲状腺功能正常的肝气郁结证患者95例、甲状腺功能亢进的阴虚火旺证患者60例、甲状腺功能减退的脾肾阳虚证患者85例，各证型患者性别、年龄比较均无统计学差异。另收集非桥本甲状腺炎的甲状腺疾病患者60例。正常对照者来自同期中国人民解放军第988医院健康体检中心的健康人群。各组病例按性别、年龄匹配。
2.2实验步骤
(1)从生物公司购买的TNRC6C、MAP9、IRF9、PLEKHO2、NPM3、DR1、CTDP1、KDM1A、BRMS1L、PCGF2、GPCPD1、IGBP1商品化人重组蛋白分别用蛋白稀释液稀释至250μg/ml，用包被液将各重组蛋白按照表7所示分别稀释至合适的浓度，用移液枪加入至96孔酶标板中，100μl/孔，加样时要注意避免气泡并避免液体粘附于孔壁。另用包被液将人源IgG标准品稀释8个梯度浓度(640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、0ng/ml)作为质控用来调节板与板之间的差异，100μl/孔，用封板膜封好后置于4℃冰箱，包被过夜。
(2)封闭：弃去酶标板中包被液，在吸水纸上拍干，每孔内加入200μl 2％BSA进行封闭，用封板膜封好后置于4℃冰箱，封闭过夜。
(3)洗板：将封闭过夜的酶标板取出，甩去板内封闭液，拍干，用96孔全自动洗板机上1×PBST溶液洗板3次，拍干。
(4)一抗(血清)孵育：用含1％BSA的1×PBST抗体稀释液以1：100(v/v)的比例在96孔深孔板中稀释血清样本(现用现稀释)，用12孔道移液枪把稀释好的血清样本加入酶标板内，100μl/孔，空白对照孔加入100μl不含血清的抗体稀释液，封板膜封口，在37℃恒温水浴锅中半水浴孵育1h。
(5)洗板：弃去酶标板内的血清稀释液，拍干，用96孔全自动洗板机上1×PBST溶液洗板5次，并在吸水纸上拍干酶标板。
(6)二抗孵育：用含1％BSA的1×PBST抗体稀释液以1:10000(v/v)的比例稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗(现配现用)，用12孔道移液枪向酶标板内加入稀释好的二抗，100μl/孔，封板膜封好后，37℃半水浴孵育1h。
(7)洗板：弃去酶标板每孔内的二抗稀释液，拍干，用96孔全自动洗板机上1×PBST溶液洗板5次，并在吸水纸上拍干酶标板。
(8)显色反应：提前30min打开酶标仪预热，设置好标本布局和测量双波长(450nm和620nm)。取出4℃冰箱里的底物液A和底物液B按1:1(v/v)比例混匀(现用现配)，用12孔道移液枪向酶标板加入显色液，100μl/孔，室温避光反应5-10min。
(9)终止反应：肉眼观察出现颜色变化后，及时用12孔道移液枪向酶标板内加入终止液，50μl/孔，使反应终止，终止完全后放入酶标仪内检测，保存实验数据。
表7各蛋白包被浓度
2.3数据处理与统计分析
使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 8.0对获取的实验数据进行统计学分析。通过ROC曲线计算各相关自身抗体的AUC、灵敏度、特异度以及95％置信度区间(95％CI)，筛选标准定义为AUC>0.5且P<0.05。选取特异度大于90％时的最大约登指数(灵敏度+特异度-1)并定义为截断值。所有分析均采取双侧检验，当P值小于0.05时，认为差异具有统计学意义。
2.4结果
2.4.1桥本甲状腺炎肝气郁结证特征性相关自身抗体
通过间接ELISA实验检测桥本甲状腺炎肝气郁结证(甲状腺功能正常)相关自身抗体在一组血清标本(桥本甲状腺炎肝气郁结证95例，正常对照120例，非桥本甲状腺炎的其他甲状腺疾病60例)中的含量。在肝气郁结证组，如表8所示，根据AUC>0.5且P<0.05，剔除TNRC6C，其在桥本甲状腺炎患者血清和正常对照血清中的浓度差异无统计学意义，其余2种相关自身抗体MAP9、IRF9在桥本甲状腺炎患者血清中的抗体浓度均显著高于正常对照血清中的水平，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
表8 3种桥本甲状腺炎肝气郁结证相关自身抗体的检测
MAP9、IRF9两种特征性相关自身抗体在肝气郁结证桥本甲状腺炎患者、非桥本甲状腺炎的其他甲状腺疾病患者和健康对照者中表达的散点图和ROC曲线图见图7。由图7可知，HT肝气郁结证组相关自身抗体表达量显著高于健康对照组和其他甲状腺疾病患者组。
经ELISA验证得出的MAP9、IRF9两种特征性相关自身抗体在肝气郁结证桥本甲状腺炎患者中，单个抗体检测和两种抗体联合检测的ROC曲线图见图8，可以看出两种相关自身抗体联合检测的AUC值最高(0.941)，表明MAP9、IRF9两种相关自身抗体联合检测具有更高的证候特征辨识度。
2.4.2桥本甲状腺炎阴虚火旺证特征性相关自身抗体
通过间接ELISA实验检测桥本甲状腺炎阴虚火旺证(甲状腺功能亢进)相关自身抗体在一组血清标本(桥本甲状腺炎阴虚火旺证60例，正常对照120例，非桥本甲状腺炎的其他甲状腺疾病60例)中的含量。在阴虚火旺证组，如表9所示，PLEKHO2和NPM3 2种相关自身抗体在桥本甲状腺炎患者血清中的抗体浓度均显著高于正常对照血清中的水平，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
表9 2种桥本甲状腺炎阴虚火旺证相关自身抗体的检测
PLEKHO2、NPM3两种特征性相关自身抗体在阴虚火旺证桥本甲状腺炎患者、非桥本甲状腺炎的其他甲状腺疾病患者和健康对照者中表达的散点图和ROC曲线图见图9。由图9可知，HT阴虚火旺证组相关自身抗体表达量显著高于健康对照组和其他甲状腺疾病患者组。
经ELISA验证得出的PLEKHO2、NPM3两种特征性相关自身抗体在阴虚火旺证桥本甲状腺炎患者中，单个抗体检测和两种抗体联合检测的ROC曲线图见图10，可以看出两种相关自身抗体联合检测的AUC值最高(0.884)，表明PLEKHO2、NPM3两种相关自身抗体联合检测具有更高的证候特征辨识度。
2.4.3桥本甲状腺炎脾肾阳虚证特征性相关自身抗体
通过间接ELISA实验检测桥本甲状腺炎脾肾阳虚证(甲状腺功能减退)相关自身抗体在一组血清标本(桥本甲状腺炎脾肾阳虚证85例，正常对照120例，非桥本甲状腺炎的其他甲状腺疾病60例)中的含量。在脾肾阳虚证组，如表10所示，根据AUC>0.5且P<0.05，剔除CTDP1、BRMS1L 2种自身抗体，其在桥本甲状腺炎患者血清和正常对照血清中的浓度差异无统计学意义，其余5种相关自身抗体DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1在桥本甲状腺炎患者血清中的抗体浓度均显著高于正常对照血清中的水平，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
表10 7种桥本甲状腺炎脾肾阳虚证相关自身抗体的检测
DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种特征性相关自身抗体在脾肾阳虚证桥本甲状腺炎患者、非桥本甲状腺炎的其他甲状腺疾病患者和健康对照者中表达的散点图和ROC曲线图见图11。由图11可知，HT脾肾阳虚证组相关自身抗体表达量显著高于健康对照组和其他甲状腺疾病患者组。
经ELISA验证得出的DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种特征性相关自身抗体在脾肾阳虚证桥本甲状腺炎患者中，单个抗体检测和五种抗体联合检测的ROC曲线图见图12，可以看出五种相关自身抗体联合检测的AUC值最高(0.852)，表明DR1、KDM1A、PCGF2、GPCPD1、IGBP1五种相关自身抗体联合检测具有更高的证候特征辨识度。

Claims (3)

1.一种生物标志物在制备检测桥本甲状腺炎肝气郁结证的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物为 MAP9 和IRF9两种自身抗体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括MAP9和IRF9人重组蛋白，该试剂盒用于检测血清中MAP9和IRF9两种自身抗体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括人源IgG标准品、辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG以及ELISA技术常用的试剂。
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