CN103149369B - 一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量多指标筛查食管鳞癌特异蛋白标志物的蛋白质芯片，还公开了一种配套使用的试剂盒。选用血清或血浆中的食管鳞癌差异蛋白共55种作为食管鳞癌蛋白标志物及蛋白对照制成蛋白质芯片，该蛋白质芯片由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成。试剂盒内装有配套实验试剂的检测液。应用本发明可以确定正常人群、食管鳞癌前病变人群及食管鳞癌三类人群的蛋白图谱，对食管鳞癌的早期筛查，中、晚期诊断和病情监测提供一种手段。

Description

一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物芯片技术领域，特别涉及一种蛋白质芯片。应用该蛋白质芯片及其试剂盒筛查食管鳞癌特异蛋白标志物。

背景技术

食管癌是世界上第8位最常见的恶性肿瘤之一，被认为是继胰腺癌之后第二位难以治愈的消化道恶性肿瘤。中国又是世界上食管癌发病率和死亡率较高的国家，占全世界的50%以上，每年约有25万新诊断的食管癌病例，发病率仅次于胃癌、肺癌、肝癌之后居第四位， 严重威胁着人类的生命健康。食管癌又分为食管鳞癌和腺癌，中国食管鳞癌的比例高达90%以上。食管癌的研究对降低发病率和死亡率具有非常重要的意义。目前食管癌筛查和诊断仍以食管内镜检查及食管粘膜碘染色为主，存在一定的弊端，如成本较高，检查效率低，侵入式检查使患者依从性差，还受到医生的技术水平等人为因素的影响，不适合用于早期筛查和临床检测。随着研究向分子生物学领域推进，从基因水平上研究筛查出异常基因，进行基因测序，发现突变位点，再寻找敏感的药物是一个治疗途径，但这个过程比较繁琐。随着对基因组认识的深入，人们发现药物通常是作用于基因编码的蛋白质而不是基因本身，虽然人类基因组包含了我们身体的全部遗传信息，但要经过一系列转录、翻译过程实现蛋白质表达，人体各种功能的发挥都是由蛋白质来完成的。蛋白质是生命活动的执行者和体现者,对蛋白质组的研究可以更深入、更贴近生命本质,这催生了一个新的科学领域――蛋白组学：专门研究人体大量未知的蛋白质、以及他们多样性的形态和功能。表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)技术是一种蛋白质组学研究技术,由血清与弱阳离子亲和蛋白芯片结合,用质谱仪读取血清蛋白图谱,用蛋白质指纹分析软件对质谱数据的分析而获得蛋白指纹。食管癌血清蛋白指纹由12个不同质荷比（M/Z）的蛋白质组成。但此种方法检测出的蛋白质的质荷比往往是多种蛋白质结合在一起，不能确定是哪一种蛋白质，而且有很多是人类未知的蛋白质，对后续个体化治疗和新药研制带来困难，逐渐不为人采用。选择人类已知的蛋白进行研究可以最快速度找到特异蛋白标志物。蛋白质又分为组织蛋白和血清蛋白，血清蛋白具有取样容易，样品处理简单，可反映身体即时的生理病理变化，适合作为肿瘤筛查、诊断以及病情监测的标志物。食管癌的发生发展是正常细胞经过多基因、多步骤的变化，逐渐演变成具有恶性增殖特性的癌细胞并不断转移播散的过程。食管癌细胞与增殖、凋亡、分化和转移相关的多种基因的表达都发生了改变，此种变化最终表现为细胞内各种蛋白质的表达和功能改变，从而影响细胞的生命活动。在癌变过程中发生改变的蛋白质和小肽可以经肿瘤细胞代谢、分泌释放到血液或其他体液中。因此，通过研究食管癌血清蛋白质的改变，有可能发现与食管癌相关或特异的蛋白质或肽类物质，即食管癌血清蛋白标志物。但血清蛋白的含量都是非常低的,即低丰度蛋白，所以血清蛋白检测存在一定难度。

传统的蛋白检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、放免分析法(RIA)、免放测定法(IR-MA)和荧光免疫测定法(FIA)等,酶联免疫吸附法是目前临床用得最多的检测方法，但酶联免疫吸附试验方法需要在加入受检标本和酶标抗体时有半小时至一小时的孵育时间，中间还须经过数次洗板过程才能加入反应底物进行显色后在酶标仪上完成检测，步骤较为繁琐费时，且存在检出阳性率低、容易污染等不足，而且一次只能检测一种指标，按照这些方法对每份血清进行多项标志物的测定在人力、物力和财力上均不现实。人们希望能有一种快速、简便的，价格低廉的，可同时检测多人份的多项指标的诊断方法来提高检测的效率及准确性。蛋白芯片技术的出现，使高通量、大范围研究血清蛋白质组学成为可能。蛋白芯片法只需在反应板上依次加入封闭液、受检标本、洗涤液和胶体金标记的二抗即可。液体在自动渗滤的过程中，受检标本内的抗体及胶体金标记的第二抗体便自动完成吸附，第二抗体因胶体金标记而不需底物进行显色而呈色，可直接观测结果。蛋白质芯片是一种在固体基片表面固定蛋白质或多肽微阵列，通过免疫学原理对蛋白质样品进行检测、识别、分析和诊断，可应用于生命科学、医药学等相关领域。现有的蛋白芯片，价格昂贵，一般只含有一种或几种用于检测体液标本的标志蛋白，目前能够应用于临床检测的标志物很单一，主要检测EGFR受体来辅组诊断食管癌，假阳性率偏高，灵敏度、准确性偏低，重复性差。目前尚没有专门的食管癌筛查和诊断蛋白芯片广泛应用。例如，发明专利申请号为200510116733.2，申请日为2005.10.28，公开日为2007.05.02，公开号为CN1955737A 的“一种用于筛查食管癌癌前病变的蛋白芯片” 发明专利申请，该发明的蛋白芯片只包含了有16种蛋白标志物，而且仅有TP53这一个蛋白重合，两种蛋白芯片所检测的目标抗体不同，其得出的结论和意义也不同；实用新型申请号为200820059666.4，申请日为2008.06.13，授权公告日为2009.05.27，授权公告号为CN201247246Y的“一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片及其试剂盒”实用新型专利，其芯片只有含有7种标志物，可用于检测食管癌的标志物只有3种：CYFRA21-1、SCC-AG、CEA。这三种标志物对于食管癌的诊断准确性低，重复性低，假阳性高，且仅限于检测男性食管癌。现有技术中虽有50多种蛋白的研究，如美国Kilic A等人的《Use of novel autoantibody and cancer-related protein arrays for the detection of esophageal adenocarcionma in seru》(Thorac Cardiovasc Surg,2008)研究的蛋白芯片涉及53种肿瘤相关抗原，但其仅限于对于早期食管腺癌检测，所选蛋白标志物与本发明所选蛋白差异很大，本发明是针对食管鳞癌，重合的蛋白仅有：IL-8、EGFR、CA19-9、CA72-4、MMP-7等4种。总之，现有技术缺乏一种能够高通量筛查和检测食管鳞癌、价格能够为人们所接受的、能够在人群体检中普及推广的蛋白芯片。

发明内容

本发明旨在提供一种用于食管鳞癌检测血清蛋白标志物的蛋白芯片。本发明蛋白芯片所选择的蛋白是已知的食管鳞癌相关蛋白标志物，所检测的目标蛋白明确、应用性强，特别针对食管癌尤其是中国高发的食管鳞癌，所选标志物也属于鳞癌的标志物；选用55种食管鳞癌蛋白标志物及蛋白对照制成蛋白芯片，对食管鳞癌高发区通过胃镜检测及组织病理诊断确诊的三类人群，即：正常人群、食管鳞癌癌前病变人群及食管鳞癌人群各150例的血清或血浆的差异蛋白，从而确立该三类人群的食管鳞癌相关蛋白图谱，找出食管鳞癌发展中的特异蛋白标志物为：CA72-4、CTAG1B、Cyfra21-1、GAGE7、SERPINB4共5种蛋白，用于食管鳞癌早期筛查，中、晚期诊断和病情监测提供一种检测方法。同时为寻找敏感性药物提供了一种手段。

本发明的食管鳞癌标志物蛋白质芯片，由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，以物理固定方法，即在涂布有偶氮聚合物的玻璃基片上点样抗原等蛋白质。用光线照射后，偶氮聚合物产生顺式异构体-反式异构体的交替变换，蛋白质逐渐陷入偶氮聚合物内部。停止光照后，偶氮聚合物重新凝固成固体，蛋白质就实现了物理固定在基片上面，基片是玻璃片基或塑料片基。蛋白检测指标包括：AnnexinI、AnnexinⅡ、BIRC5、CA19-9、CA72-4、CCNB1、CCND1、CCNE1、CDC25A、CDC25B、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A(A)、CDKN2A(B)、CDKN2A(C)、Clu、CTAG1B、Cyfra 21-1、E2F1、EGFR(A)、EGFR(B)、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCR1、HOOK2、ID-1、IGF2BP3、IL-8、MGMT、MMP-7、MSH2、MVD、MYC、NFKB1、polβ、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR-b、S100A4、SERPINB4、Smad3、SOD2、SQSTM1、SURF-1、TACSTD2(A)、TACSTD2(B)、TGF-b1、TP53、TP63共 55种肿瘤标志物，与样品对照、阳性对照、阴性对照和试剂对照构成阵列式点样涂层，同时点阵于一张基片上，每个阵列重复16组。

上述基片的一个优选例是醛基化玻片。

上述的对照检测涂层包括：样品对照、阳性对照、阴性对照和试剂对照。样品对照为人血清抗原；阳性对照为人IgG抗体；阴性对照为抗原点样所用的稀释液；试剂对照为生物素标记的人IgG抗体。

上述芯片涂层上的每个阵列中每个蛋白检测指标有3个重复点，对照指标也有3个重复点。阵列的多少和大小与蛋白标志物的多少、基片大小、以及点样的大小直接有关。

上述蛋白检测指标与检测阵列的优选例是：当蛋白检测指标点直径为0.01mm时，点间距0.01mm,阵列大小为0.56mm×0.6mm，可在硝酸纤维素膜蛋白芯片上设置16个阵列。

检测食管鳞癌的蛋白质芯片试剂盒包括：浸润液（3），样本稀释液(4)，金交联试剂稀释液(5)，浓缩洗涤液(6)，检测液A(7)，检测液B(8)，牛血清蛋白溶液(9)，金交联试剂(10)，生物素标记的人IgG抗体(11)，抗生物素标记的金交联试剂(12)。各液体为瓶装，用纸质模版固定于包装盒内。各部分由纸质模版固定于一包装盒内，不限放置方式，检查时配套使用。

上述试剂盒的样本稀释液4是一种蛋白稳定剂(Gentel Dilution Buffer TM, 产品号：No.B255) ；可以由3% BSA和0.05%洗涤剂（pH=7.3）配置而成。

上述浓缩洗涤剂6(10×Gentel Wash Buffer TM, 产品号：No.2-1016)) 是一种中性缓冲液，由洗涤剂配制而成（pH=6.8）。

上述的生物素标记的人IgG抗体11配制是由20mg/mL牛血清蛋白稀释液稀释到100倍，进一步由样本稀释液稀释到50,000倍。

上述的抗生物素标记的金交联试剂12是由200mg SilverQuant Reagent C (Gentel，产品号：No.10-2135)用200mL SilverQuant Conjugate Buffers (Gentel，产品号：No.10-2134)配制成金交联试剂，再进一步用抗生物素的金交联试剂(Gentel， SilverQuant Anti-biotin Gold Conjugate，产品号：No.10-1031)配制而成。

上述的牛血清蛋白溶液9由 20 mg/mL 牛血清蛋白配制而成（pH=7.4）

上述的检测液A、检测液B指配套使用的两种试剂，一种含有硝酸银试剂，另一种含有柠檬酸。

一张芯片可同时检测16个样本，不仅具有更高的灵敏度，同时大大降低成本并提高检测效率，克服了以往蛋白芯片价格昂贵、难以推广普及的弊端。

附图说明

图1为安装和检测芯片装置的外观平面示意图。有4张芯片，1代表一张芯片；每张芯片包含16个阵列，2代表一个阵列，一个阵列可检测一个样本。

图2是点样阵列示意图。由14×15点样组成。

图3为点样阵列示意图的标志物点样位置图。4个角A1-A3、A13-A15、N1-N3、N13-N15为样本对照，各有3个重复点样；B1-D1、K15-M15是阳性对照，各有3个重复点样；E1-G1是阴性对照，有3个重复点样；K1-M1、B15-D15是试剂对照，各有3个重复点样；其余各行分别为蛋白检测指标点样AnnexinI、AnnexinⅡ、BIRC5、CA19-9、CA72-4、CCNB1、CCND1、CCNE1、CDC25A、CDC25B、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A(A)、CDKN2A(B)、CDKN2A(C)、Clu、CTAG1B、Cyfra 21-1、E2F1、EGFR(A)、EGFR(B)、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCR1、HOOK2、ID-1、IGF2BP3、IL-8、MGMT、MMP-7、MSH2、MVD、MYC、NFKB1、polβ、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR-b、S100A4、SERPINB4、Smad3、SOD2、SQSTM1、SURF-1、TACSTD2(A)、TACSTD2(B)、TGF-b1、TP53、TP63每行最多4个指标，各有3个重复点样。

图4是试剂盒示意图。3代表浸润液；4代表样本稀释液；5代表金交联试剂稀释液；6代表浓缩洗涤液；7代表检测液A；8代表检测液B；9代表牛血清蛋白溶液；10代表金交联试剂；11代表生物素标记的人IgG抗体；12代表抗生物素标记的金交联试剂。

图5为检测血清结果示意图，其中样本对照、阳性对照和试剂对照信号较强，阴性对照信号较弱，实验结果可信；13为CA72-4信号较强，其余指标信号较弱。

图6-图10为正常人群、食管鳞癌癌前病变人群及食管鳞癌病人三类人群的上述55种蛋白指标血清蛋白图谱示意图；白色柱状图代表正常人群蛋白图谱；网格柱状图代表食管鳞癌癌前病变人群蛋白图谱；黑色代表食管鳞癌蛋白图谱。

具体实施方式

实施例1：

一种检测食管鳞癌的蛋白芯片的制备

其步骤主要是：（1）准备基质硝酸纤维素膜；（2）设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；（3）点样针吸出抗原采用喷射点样，电子电压喷雾技术同时喷点到一张玻璃基片上，（4）装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。

上述用于检测食管鳞癌多种血清抗体标志物的蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤：

1.食管鳞癌标志物检测抗原抗体的来源

（1）检测指标抗原的确定：

所有抗原购自北京傲锐东源生物科技有限公司（OriGene）、台湾亚诺法生技公司（Abnova）和美国MyBioSource公司。

（2）检测指标抗体的确定：

所采用的检测抗体对均为小鼠杂交瘤单克隆抗体对，其检测精度和准确度明显优于多克隆抗体。

2.点样制备检测指标涂层的膜芯片

用晶芯微阵列芯片点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗原喷点与硝酸纤维素膜上，点阵形式为14×15矩形阵列，如图2所示。当点直径为0.01mm时，点间距0.01mm, 抗原阵列大小为0.56mm×0.6mm,点样后贴膜，封闭；最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。

3.蛋白芯片组装

用具有分隔反应区域的器皿将反应区域固定，组装方式是先将芯片槽螺丝旋松，取出芯片正面向上放在芯片槽内，旋紧螺丝使芯片固定在芯片槽中，将垫圈厚壁卡进另一侧设备中，薄壁接触芯片，将芯片槽放在垫圈上，螺丝固定设备，(具体见Gentel的 SIMplex 64 Multi-Array System说明，产品号4-1025)。组装完成后示意图如图1所示。

实施例2：

试剂盒的制备

一种用于检测食管鳞癌的血清和/或血浆标志物的试剂盒，如图4所示，由样本稀释液4，浓缩洗涤液6，牛血清蛋白溶液9，生物素标记的人IgG抗体11，抗生物素标记的金交联试剂12，检测液AB（7、8）。各液体为瓶装，4℃低温保存，检查时配套使用。

样本稀释液4是一种蛋白稳定剂；可以由3% BSA和0.05%洗涤剂（pH=7.3）配置而成。购自Gentel公司（Gentel Dilution Buffer TM，产品号：No.B255）。提供1瓶，500ml。用于稀释血清样本（体积比1：500或1000）。

浓缩洗涤液6是一种中性缓冲液(10×Gentel Wash Buffer TM, 产品号：No.2-1016)；可以由洗涤剂配制而成（pH=6.8）。提供250mL,一瓶。使用时用25mL稀释到225mL超纯水中，混匀。

牛血清蛋白溶液9由20mg/mL 牛血清蛋白配制而成（pH=7.4 ）。

生物素标记的人IgG抗体11为二抗，由以下方法配制而成：由20mg/mL牛血清蛋白稀释液稀释到100倍，进一步由样本稀释液稀释到50,000倍。提供50ul，一管。

抗生物素标记的金交联试12包含SilverQuant Reagent C (Gentel，产品号：No.10-2135)200mg，SilverQuant Conjugate Buffers (Gentel，产品号：No.10-2134) 200mL，SilverQuant Anti-biotin Gold Conjugate (Gentel，产品号：No.10-1031)100uL。由以下方法配制而成： 200mg SilverQuant Reagent C (Gentel，产品号：No.10-2135)加入到200mL SilverQuant Conjugate Buffers(Gentel，产品号：No.10-2134)中配制成金交联试剂，取8mL再加入80uL抗生物素的金交联试剂(Gentel，产品号：No.10-1031),混匀。

检测液A、B使用Gentel公司的SilverQuant Reagent A (产品号10-2132) 和SilverQuant Reagent B (产品号10-2112)作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶10mL。

实施例3：

蛋白芯片及试剂盒的应用及检测

本发明所述的用于检测食管鳞癌标志物抗原的蛋白芯片的应用，主要采用抗原-抗体-二抗-纳米金结合-银沉积方法检测人血液中的食管鳞癌标志物抗原，方法是将人血清加于芯片表面，样本中的抗体分别于固定在芯片上的相应的抗原结合，甩干后加入二抗反应，洗去未结合的二抗，加入金交联试剂，与二抗结合，洗去未结合的纳米金，加入硝酸银，纳米金促银沉积在金表面，扫描并收集信号，样本点的灰度与血清中抗体的浓度成正比。

在上述用于检测食管鳞癌标志物抗原的蛋白芯片试剂盒的应用中，其抗原抗体反应及检测的具体使用方法如下：

1. 对喷点抗原、阳性对照、阴性对照、试剂对照的芯片用3% BSA溶液封闭，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点；

2. 甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥；

3. 在芯片的反应区域，加入经1：500稀释的人血清样品；每孔加75ul，置于恒温反应中22℃，振荡反应1小时，并且用1倍洗涤液洗涤5次；

4. 甩出液体，每孔加入二抗75ul，在室温下，置于恒温反应仪中22℃，在震荡器上以160转/分钟转速孵育蛋白1小时。并且用1倍稀释的缓冲液洗涤5次；

5. 甩出液体，将200毫克的aliquot Silver Quant试剂C(Gentel产品号10 - 2135)加入到200毫升的Silver Quant亲和缓冲液中(Gentel，产品号10 - 2134)。取8mL再加入80uL抗生物素的金交联试剂(Gentel，产品号：No.10-1031),混匀。每孔加75µL金亲和试剂，室温下震荡培养45分钟（160转/分钟）；

6. 甩出液体，将Gentel公司的Silver Quant试剂A (Gentel，产品号10 - 2132)和Silver Quant试剂B (产品号10 - 2112)混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列加100µL，氧化变色；

7. 用Gentel 检测系统（Gentel Proteomics Multi-System TM 产品号10-1030）进行扫描并收集信号，芯片扫描图见图1为一张芯片，图2为一个阵列，依据食管鳞癌芯片分析软件（AthenaQuant® Analysis Software v1.6）对扫描结果进行分析。

8.使用该方法检测食管鳞癌高发区的正常人群、食管鳞癌癌前病变人群及食管鳞癌新发病例各上百例，图6-图10为三类人群的食管鳞癌发生相关蛋白图谱。纵坐标代表蛋白分子量，单位为道尔顿，横坐标为蛋白质，共55种。图6中显示了AnnexinI、AnnexinⅡ、BIRC5、CA19-9、CA72-4、CCNB1、CCND1、CCNE1、CDC25A、CDC25B、CDK1，图7中显示了CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A(A)、CDKN2A(B)、CDKN2A(C)、Clu、CTAG1B、Cyfra 21-1，图8中显示了E2F1、EGFR(A)、EGFR(B)、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCR1、HOOK2、ID-1、IGF2BP3、IL-8，图9中显示了MGMT、MMP-7、MSH2、MVD、MYC、NFKB1、polβ、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR-b，图10中显示了S100A4、SERPINB4、Smad3、SOD2、SQSTM1、SURF-1、TACSTD2(A)、TACSTD2(B)、TGF-b1、TP53、TP63, 共 55种蛋白质。三类人群的蛋白图谱有统计学差异，可用来筛查和诊断受检者。将受检者得出的图谱与这三类蛋白图谱进行比对，并进行统计分析，从而判断属于哪一类人群。

本发明的蛋白芯片正是一种能够同时检测多个样本，从而降低检测成本，检测的灵敏度和准确性也大大提高，同时根据食管鳞癌发生不同时期蛋白图谱及特异蛋白标志物来达到筛查和诊断的目的。

经过比对验证，在食管鳞癌高发区随机抽取经内窥镜及组织病理学诊断确诊为食管鳞癌病人、食管鳞癌癌前病变病人和正常人各10例，抽取血样并由其他人做好标记，不让实验操作者知道。然后将各组血样打乱由操作人进行蛋白质芯片盲法检测，在检测、分析数据及诊断时不知道该血样属于哪类人群。将检测出的蛋白质含量及图谱与之前得出的食管鳞癌、食管鳞癌癌前病变及正常人各类人群蛋白含量平均值和蛋白图谱进行比对，诊断标准为蛋白含量与某类人群蛋白含量均值比较无统计学差异则认定为该类人群。做出诊断后再与标记进行核对，确定诊断是否正确。本验证结果共检出癌症9例，癌前11例，正常9例,其中癌症未检出1例，正确率为90%；癌前检错1例，正确率为90%，正常人未检出1例，正确率为90%，故本蛋白芯片诊断正确率为90%。表2为抽检的人群蛋白均值与食管鳞癌、食管鳞癌前病变及正常人蛋白均值比较无差异 （p＞0.05），说明抽检的人群分别属于食管鳞癌、食管鳞癌前病变及正常人群。

表1.抽检人群蛋白均值与食管鳞癌、食管鳞癌前病变及正常人蛋白均值比较（p ）

	CA72-4	CTAG1B	Cyfra21-1	GAGE7	SERPINB4
						正常人	0.814	0.248	0.337	0.681	0.054
食管鳞癌	0.719	0.092	0.710	0.313	0.310
						癌前	0.985	0.238	0.706	0.722	0.186

本发明针对涵盖了食管鳞癌早中晚期检测的蛋白芯片，将食管鳞癌相关的55种肿瘤相关抗原放置在一张芯片上，蛋白种类大大增多，所有蛋白购自Origene、 Abnova、MyBioSource公司，包含3个天然蛋白(Cyfra 21-1、 CA72-4 、 CA19-9)、46个纯化重组蛋白、2个重组蛋白溶解物（CTAG1B 、GAGE7）；依据蛋白存在形式选择了血液中广泛存在的细胞周期蛋白、血清蛋白、自身抗体。

采用硝酸纤维素膜为介质的表面化学(Nitrocellulose-based Surface Chemistry)技术固定蛋白能够保持蛋白质的活性及稳定性，减少非特异性结合，采用金颗粒促银沉积法，此法使灵敏度比ELISA法提高9倍,重现性也比荧光技术高9倍，可以提高检测的准确性和科学性，降低假阳性，确诊率可达90%以上。采用Silver Quant®的检测平台在大约10微米分辨率来扫描芯片，具有高度的敏感性，可同时分析高密度和高通量图像格式，大大提高了检测效率并降低了成本，本芯片每张芯片上有16个阵列，每个阵列有192个抗原，一张芯片可同时检测16个样本，芯片检测设备上可同时放置4张芯片，可同时检测64个样本，大大提高了检测效率。而常用的检测方法,如荧光和比色检测无法提供足够的灵敏度和精度定量分析多种蛋白质。本发明可快速发现、验证和筛选标记从而提高临床检测速度，还能够定量检测微阵列中蛋白含量，有利于疾病发展中的分期诊断。

Claims (7)

1.一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片，包括：由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，蛋白检测指标涂层包括多种食管鳞癌标志物，对照检测指标涂层包括样品对照标志物、阳性对照标志物、阴性对照标志物、试剂对照标志物；

其特征在于：蛋白检测指标涂层至少包括：AnnexinI、AnnexinⅡ、BIRC5、CA19-9、CA72-4、CCNB1、CCND1、CCNE1、CDC25A、CDC25B、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A-A、CDKN2A-B、CDKN2A-C、Clu、CTAG1B、Cyfra 21-1、E2F1、EGFR-A、EGFR-B、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCR1、HOOK2、ID-1、IGF2BP3、IL-8、MGMT、MMP-7、MSH2、MVD、MYC、NFKB1、polβ、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR-b、S100A4、SERPINB4、Smad3、SOD2、SQSTM1、SURF-1、TACSTD2-A、TACSTD2-B、TGF-b1、TP53、TP63共55种肿瘤标志物；

样品对照标志物为人血清抗原，阳性对照标志物为人IgG抗体，阴性对照标志物为抗原点样所用的稀释液，试剂对照标志物为生物素标记的人IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片，其特征在于：基片是玻璃片基或塑料片基，每种肿瘤标志物重复多次点样，每种对照标志物重复多次点样，每个阵列重复多次，多个食管鳞癌标志物蛋白质芯片处在1张基片上。

3.根据权利要求2所述的一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片，其特征在于：每种肿瘤标志物重复3次点样，每种对照标志物重复3次点样，每个芯片阵列重复16次，16个食管鳞癌标志物蛋白质芯片处于一张基片上。

4.根据权利要求3所述的一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片，其特征在于：当蛋白检测指标点直径为0.01mm，点间距0.01mm,一个阵列大小为0.56mm×0.6mm，一张基片的大小为25mm×75mm。

5.一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，其包括：浸润液(3)，样本稀释液(4)，金交联试剂稀释液(5)，浓缩洗涤液(6)，检测液A(7)，检测液B(8)，牛血清蛋白溶液(9)，金交联试剂(10)，生物素标记的人IgG抗体(11)，抗生物素标记的金交联试剂(12)；各液体为瓶装，用纸质模版固定于包装盒内，各部分由纸质模版固定于一包装盒内，不限放置方式，检查时配套使用；

其特征在于还包括有：一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片，该芯片包括：由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，蛋白检测指标涂层包括多种食管鳞癌标志物，对照检测指标涂层包括样品对照标志物、阳性对照标志物、阴性对照标志物、试剂对照标志物；蛋白检测指标涂层至少包括：AnnexinI、AnnexinⅡ、BIRC5、CA19-9、CA72-4、CCNB1、CCND1、CCNE1、CDC25A、CDC25B、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A-A、CDKN2A-B、CDKN2A-C、Clu、CTAG1B、Cyfra 21-1、E2F1、EGFR-A、EGFR-B、ERBB2、GAGE7、GJA8、HAVCR1、HOOK2、ID-1、IGF2BP3、IL-8、MGMT、MMP-7、MSH2、MVD、MYC、NFKB1、polβ、PRDX6、PTK2、PTK2abnova、RAR-b、S100A4、SERPINB4、Smad3、SOD2、SQSTM1、SURF-1、TACSTD2-A、TACSTD2-B、TGF-b1、TP53、TP63共55种肿瘤标志物。

6.根据权利要求5所述的一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，其特征是：所述的牛血清蛋白溶液(9)由20mg/mL牛血清蛋白配制而成，ph值为7.4。

7.根据权利要求6所述的一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，其特征是：检测液A(7)和检测液B(8)指配套使用的两种试剂，检测液A(7)是一种含有硝酸银试剂，检测液B(8)是一种含有柠檬酸试剂。