CN104086640A - 一种检测肿瘤免疫标志物birc5自身抗体氨基酸序列及应用 - Google Patents

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Abstract

一种检测肿瘤免疫标志物BIRC5自身抗体的氨基酸序列及应用，属于免疫学技术领域，本发明提供了一种凋亡抑制基因BIRC5的抗原氨基酸序列。应用BIRC5多肽抗原检测肺癌患者血中相应的特异性自身抗体，这种自身抗体可作为肿瘤标志物评估肺癌发生的危险度。这种抗原多肽及其抗体可用于制备肿瘤早期诊断试剂和开发治疗肿瘤的靶向药物。

Description

一种检测肿瘤免疫标志物BIRC5自身抗体氨基酸序列及应用
 
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，是一种用于制备肿瘤早期诊断试剂和开发治疗肿瘤的靶向药物。
背景技术
大量研究表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生自身抗体, 在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此， 既可以利用抗体检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤自身抗体。 但在肿瘤发生的早期阶段，利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多，因为肿瘤抗原的表达只有在中晚期才能达到可检测水平。此外，很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而自身抗体在正常人体内含量很低，难以检测或根本不存在。 若体内自身抗体水平明显增高，则表明体内存在异常免疫反应，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加重。
近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。 是肿瘤临床诊断领域的重点发展方向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在患者血中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的自身抗体，然后与现有已知的自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。
BIRC5也被称为细胞凋亡抑制基因5，是凋亡抑制因子家族的一员，被认为是癌细胞特异性蛋白之一，在几乎所有的人类肿瘤中都处于一种不受调控的状态。BIRC5生物学行为表现为抑制细胞凋亡，增强增殖能力，促进血管生成。BIRC5在肿瘤细胞和人胚胎细胞中高表达，但是在已经分化成熟的细胞上几乎检测不到。基于BIRC5在肿瘤组织和正常组织间表达的巨大差异和其在肿瘤发展中的重要作用，BIRC5作为一个预测、预后指标和抗癌治疗靶点吸引了越来越多的关注。本发明通过自行设计的BIRC5抗原表位多肽，检测肿瘤患者血清及血浆中自身抗体水平并开发相应的试剂，预测肿瘤发生的危险性，并为肿瘤新药研究提供可靠的数据。
 
发明内容
本发明要解决的技术问题是揭示一种肿瘤免疫标志物- BIRC5自身抗体，并提供检测BIRC5自身抗体的抗原多肽。
本发明同时明确了BIRC5自身抗体的用途。
本发明提供的用于检测肿瘤标志物BIRC5自身抗体的氨基酸序列为：
H-DFLKDHRISTFKNLHHFQGLFPGATSLPVD-OH
H-DTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWLPWIEASGRSC-OH
纯度>95%，pH>7.0。
本发明所述的BIRC5抗原多肽在制备预测肿瘤早期诊断试剂盒中的应用。
本发明利用自行设计的BIRC5蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测肺癌，癌患者血清或血浆中抗BIRC5蛋白的特异性IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体内BIRC5蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肿瘤，可以预测肿瘤发生与复发的危险性，指导临床医生对肿瘤的早期诊断。
BIRC5蛋白质氨基酸序列见Tab.1
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程，蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。另外，ELISA法的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro，但有1-2个Pro利于肽链结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原(HLA)系统的限制性表位，包括HLA-DR, HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90%以上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。
基于以上抗原设计原则及BIRC5蛋白的生物学特性，本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了上述线性多肽的氨基酸序列。
法检测自身抗体：（此ELISA法已经获得专利保护，专利号：201110388134.1）
    每个血浆样本孔设2个复孔，设2个阴性对照孔（NC），设2 个gAg 抗原孔。（说明：gAg抗原为自行设计的， 且与BIRC5无关的对比抗原，目的是减小非特异性结合反应的干扰，gAg的工作浓度范围>15μg/ml）
（1）抗原多肽用包被液（pH7.0～7.4 0.01M PBS/0.1%NaN3）包被于96孔酶标板（COSTAR,美国），每孔100μl，BIRC5包被浓度7.5～12.5μg/ml，gAg包被浓度为15～20μg/ml， 4℃过夜。
（2）0.01M  PBS/0.05% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用分析液（0.01M PBS+1%BSA）将血浆1:100-1:500稀释，每孔100μl,25℃孵育 2～3h；
（3）0.01M PBS/0.005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用分析液（同前）稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG （美国，Sigma），工作范围：1:10000～1:50000，每孔加200μl，25℃孵育 2h。
（4）0.01M PBS/0.005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）为过氧化物酶的底物（Invtrogen，美国），每孔加100μl，室温避光15～30min。
（5）每孔加50μl 10% H2SO4为反应终止液，10min内使用酶标仪（BioTeck ELx800，美国）检测OD 值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
质控方法：
    各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=OD1-OD2/OD1+OD2，离散度≤0.1，为有效结果；离散度>0.1,为无效结果。取100份健康人血浆等体积混合作为质量控制（Quality control, QC）样品，代表人群的平均水平。每板均设2个QC血浆孔，以QC血浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔OD的 SD/所有批次QC孔 OD均值<20%。 
 
数据分析：
    采用特异结合指数（Specific binding index， SBI) 判定BIRC5多肽抗原与血浆自身抗体的结合程度，SBI= [BIRC5 OD值 – NC OD 值]/ [gAg OD值 – NC OD 值]，NC为各样本的阴性对照。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式确定分界值或决定阈，即以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异性）为横坐标绘制曲线。ROC曲线下的面积（AUC）值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算AUC值，判定灵敏度和特异性；经过秩和（Z）检验，获得一类错误水准为a=0.05的P值。
本发明应用BIRC5抗原多肽检测肺癌患者血清及血浆中的特异性自身IgG抗体，并且该反应具有高特异性和高灵敏性。
BIRC5抗原多肽可用于制备肿瘤早期诊断试剂盒。
 
具体实施方式
实施例1
试剂盒制备
1 试剂  试剂配制见Tab.2～9。
Tab.2抗原包被缓冲液
叠氮钠0.1g
PBS(0.01M， pH7.4)        100ml   4℃保存
 
2 操作  
（1）包被：工作抗原及参比抗原用包被液稀释至工作浓度，包被于酶标板， 
4℃过夜。
（2）加血浆(一抗):酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用分析液将血浆稀释至合适浓度，一般为1:100～1:500，每孔100μl,25℃或室温孵育 2～3h；
（3）二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3～5遍，利用分析液稀释二抗标准液IgG，每孔加200μl，25℃/室温孵育 2h；
（4）显色：洗涤缓冲液清洗3～5遍，每孔加100μl底物显色液，室温避光15～30min。
（5）检测：每孔加50μl终止液，10min检测，波长为450nm，参考波长为630nm。
实施例2
肺癌患者的BIRC5自身IgG抗体检测
样本收集：收集271份肺癌患者血浆样品 (包括磷癌113例, 腺癌176例) 及227例年龄与性别完全匹配的健康人血清样本用于肺癌研究。肿瘤患者的临床诊断符合国际疾病分类标准ICD-10。健康组与肺癌组在性别、年龄匹配，具有可比性（P>0.05）
肺癌检测结果：由Tab.10可知，肺癌患者血清中BIRC5抗体IgG的ROC曲线下面积（AUC）为0.66，灵敏度为37.8%， 特异性为90.4%；患者血浆中BIRC5抗体IgG水平明显高于健康组（Z=4.74，P<0.0001）。以上数据充分表明，利用本发明所设计的抗原多肽检测得到的肺癌患者自身抗体IgG水平与正常健康组比较有显著性统计学差异。
H-DFLKDHRISTFKNLHHFQGLFPGATSLPVD-OH
H-DTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWLPWIEASGRSC-OH

Claims (3)

1.一种检测BIRC5自身抗体的氨基酸序列，其特征在于: H-DFLKDHRISTFKNLHHFQGLFPGATSLPVD-OH
H-DTIRRKNLRKLRRKCAVPSSSWLPWIEASGRSC-OH纯度>95%, pH>7.0。
2.一种能与权利要求1所述的BIRC5抗原多肽特异性结合的肿瘤免疫标志物- BIRC5自身抗体IgG。
3.根据权利要求1、2所述的肿瘤标志物BIRC5自身抗体在制备预测肺癌早期诊断试剂盒中的应用。
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