CN105017404A - 一种检测肝癌标志物ezh2抗原表位氨基酸序列及应用 - Google Patents

一种检测肝癌标志物ezh2抗原表位氨基酸序列及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105017404A
CN105017404A CN201510426291.5A CN201510426291A CN105017404A CN 105017404 A CN105017404 A CN 105017404A CN 201510426291 A CN201510426291 A CN 201510426291A CN 105017404 A CN105017404 A CN 105017404A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liver cancer
ezh2
antigen
amino acid
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510426291.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王雷
王爽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Jinuo Biological Engineering Co Ltd
Original Assignee
Jilin Jinuo Biological Engineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Jinuo Biological Engineering Co Ltd filed Critical Jilin Jinuo Biological Engineering Co Ltd
Priority to CN201510426291.5A priority Critical patent/CN105017404A/zh
Publication of CN105017404A publication Critical patent/CN105017404A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一种检测肝癌标志物EZH2抗原表位的氨基酸序列及应用，属于免疫学技术领域，本发明提供了一种肝癌相关基因EZH2的抗原氨基酸序列。应用EZH2多肽抗原检测肝癌患者血中相应的特异性自身抗体，这种自身抗体可作为肝癌标志物评估肝癌发生的危险度及预后疗效。这种抗原多肽及其抗体可用于制备肝癌早期诊断、预后预测试剂和开发治疗肝癌的靶向药物。

Description

一种检测肝癌标志物EZH2抗原表位氨基酸序列及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过生物信息学模拟筛选的具有检测肝癌标志物EZH2多肽片段。
背景技术
肝癌是目前我国发病率和致死率位居第二位的恶性肿瘤，每年约有30万例新发肝癌，占全球50%以上。肝癌发展迅速、易转移，是目前治疗最困难、预后最差的恶性肿瘤之一。然而，相对于乳腺癌、肺癌和前列腺癌等其他类型的恶性肿瘤，至今仍缺乏对肝癌发病相关肿瘤标志物分子认识。大量研究表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此， 既可以利用抗体检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤抗原的自身抗体，但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而肿瘤自身抗体在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内肿瘤自身抗体水平明显增高，则表明体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加重。
近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的自身抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在癌症患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的自身抗体，然后与现有已知的肿瘤相关抗原自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。
EZH2属于PcG家族成员，是1996年被发现的一种人转录调节蛋白，通过甲基化核小体组蛋白H3的9、27位赖氨酸残基来沉默下游基因。EZH2在肝癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌等恶性肿瘤中呈高表达，与肿瘤的转移和不良预后有关，是肿瘤治疗的新靶点。EZH2作为PcG蛋白的核心成分，在肿瘤的发生、发展中起到重要作用。①调控组蛋白甲基转移酶和组蛋白去酰化酶(HDAC)的活性；②诱导HDAC的活性，介导HDAC依赖性基因沉默：EZH2与EED形成复合物与HDAC作用，EZH2的SET结构域催化H3-K27甲基化而抑制靶基因的表达，触发或维持染色体的转录抑制状态，从而沉默靶基因导致肿瘤发生；③促进细胞增殖：EZH2在增殖的外套淋巴细胞瘤细胞中高表达，而在静止的细胞中则不表达或弱表达。基于EZH2在肿瘤组织和正常组织间表达的巨大差异和其在肿瘤发展中的重要作用，EZH2作为一个预测、预后指标和抗癌治疗靶点吸引了越来越多的关注。同时提示我们其在肝癌早期诊断的应用价值较好，以及作为潜在生物标志物的可能。本发明通过自行设计的EZH2抗原表位多肽，检测肿瘤患者血清及血浆中自身抗体水平并开发相应的试剂，预测肝癌发生的危险性及预后预测，并为肝癌新药研究提供可靠的数据。
本发明通过自行设计的EZH2抗原表位多肽，检测肝癌患者血清及血浆中自身抗体表达水平并开发相应的试剂，预测肝癌发生的危险性，并为制备肝癌早期诊断及预后预测试剂盒奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是公开一种检测肝癌标志物EZH2自身抗体的抗原表位序列。
本发明同时公开了EZH2抗原表位的用途。
本发明提供的一种检测肝癌标志物EZH2自身抗体的抗原表位氨基酸序列为：
H-DHRDDKESRPPRKFPCGEIISQDEADRRGKV-OH
其纯度>95%，pH>7.0。
本发明所述的EZH2抗原表位多肽在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用。
本发明利用自行设计的EZH2蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测肝癌患者血清及血浆中抗EZH2蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体内EZH2蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肝癌，可以预测肝癌发生与复发的危险性，指导临床医生对肝癌的早期诊断及预后预测。
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程，蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。此外，ELISA法的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro，但有1-2个Pro利于肽链结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原(HLA)系统的限制性表位，包括HLA-DR, HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90%以上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。基于以上抗原设计原则及EZH2蛋白的生物学特性，本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了的线性氨基酸序列。EZH2线性多肽抗原由31个氨基酸残基组成，共含10个重叠表位，可检测至少10种单克隆抗体，具有高度的特异性。
法检测抗原表位
   我们采用ELISA方法，对收集的血液进行检测，并得到各样本OD值进行分析。
质控  各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=OD1-OD2/OD1+OD2，离散度≤0.1，为有效结果；离散度>0.1，为无效结果。取100份健康人血清等体积混合作为质控血（Quality control, QC），代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血浆孔，以QC血浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔 SD/所有批次QC孔 OD均值<20%。 批内变异CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值<10%。
数据分析  采用SPSS17.0 for windows进行统计学分析。采用特异结合指数（Specific binding index， SBI)来判定EZH2抗原多肽与血浆自身抗体的结合程度，SBI= EZH2 OD值 – NC OD值/ QC OD值 – NC OD值，NC为各样本的阴性对照。利用t检验分别比较恶性肝癌组与健康对照之间SBI值之间的差异，a=0.05。
ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式（分界值或决定阈），以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AU>0.5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算曲线下面积（AU），判定灵敏度和特异度。
本发明应用EZH2抗原表位多肽检测到肝癌患者血清及血浆中的EZH2特异性自身IgG抗体，并且该反应具有高特异性和高灵敏性。
EZH2抗原表位多肽可用于制备肝癌早期诊断及预后预测试剂盒。
附图说明
    附图为肝癌患者体抗EZH2自身IgG抗体水平的ROC曲线分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例子仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
试剂盒制备
1 试剂  试剂配制见Tab.2～7。
2 操作
（1）包被：酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，工作抗原用包被液稀释至工作浓度，包被于酶标板，4℃过夜。
（2）加谷氨酸：洗涤缓冲液清洗3遍，用包被液稀释谷氨酸至浓度100μg/ml，每孔200μl,37℃或室温孵育1h；
（3）加血浆和质控对照(一抗):酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用包被液将血浆稀释至合适浓度，一般为1:100～1:500，每孔100μl,37℃或室温孵育1h；
（4）二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3遍，利用包被液稀释二抗标准液IgG，工作浓度1:20000，每孔加100μl，37℃或室温孵育1h；
（5）显色：洗涤缓冲液清洗3遍，每孔加100μl底物显色液，室温避光30～45min。
（6）检测：每孔加50μl终止液，10min内检测，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
实施例2
肝癌患者的EZH2自身IgG抗体检测
1样本收集：本研究从吉林大学第三医院、省肿瘤医院选取经放射学检查和组织学检查确诊肝癌样本103例。所有血清样本采集前未经过任何抗癌治疗，并具有全面的临床资料和信息。同时招募了健康对照组样本121例。临床访谈及影像学检查均排除肝癌患病可能。健康组与肝癌组在性别、年龄匹配，具有可比性（P>0.05）
2检测结果：EZH2的自身抗体表达水平 (Tab.8)：肝癌组与健康对照组相比存在统计学差异（t=4.312，P <0.001）。
ROC曲线分析：肝癌患者EZH2自身IgG抗体检测在ROC曲线下面积为0.723（SE=0.035, 95%CI：0.579-0.715）（附图和Tab.9）。
以上数据充分表明，利用本发明所设计的抗原表位多肽检测得到的肝癌患者自身抗体IgG水平与正常健康组比较有显著性统计学差异。
抗EZH2自身IgG抗体在肝癌患者和健康对照样本中的表达水平
Antibody a Mean±SD（n） t P b
control 0.949±0.23 (121)    
malignant 1.158±0.31 (203) 4.312 0.000
a Standard error
Tab.9  肝癌中抗EZH2自身IgG抗体的ROC曲线分析
Antibody AUC SE a 95%CI Sensitivity (%) Specificity (%)
malignant 0.647 0.035 0.579-0.715 24.8 90
a Standard error
H-DHRDDKESRPPRKFPCGEIISQDEADRRGKV-OH
其纯度>95%，pH>7.0。
 

Claims (2)

1.一种检测肝癌标志物EZH2抗原表位多肽，其特征在于：氨基酸序列为
  H-DHRDDKESRPPRKFPCGEIISQDEADRRGKV-OH
其纯度>95%，pH>7.0。
2.根据权利要求1所述的检测肝癌标志物EZH2抗原表位多肽在制备肝癌早期诊断及预后预测试剂盒中的应用。
CN201510426291.5A 2015-07-20 2015-07-20 一种检测肝癌标志物ezh2抗原表位氨基酸序列及应用 Pending CN105017404A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510426291.5A CN105017404A (zh) 2015-07-20 2015-07-20 一种检测肝癌标志物ezh2抗原表位氨基酸序列及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510426291.5A CN105017404A (zh) 2015-07-20 2015-07-20 一种检测肝癌标志物ezh2抗原表位氨基酸序列及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105017404A true CN105017404A (zh) 2015-11-04

Family

ID=54407748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510426291.5A Pending CN105017404A (zh) 2015-07-20 2015-07-20 一种检测肝癌标志物ezh2抗原表位氨基酸序列及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105017404A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110580956A (zh) * 2019-09-19 2019-12-17 青岛市市立医院 一组肝癌预后标志物及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104768555A (zh) * 2012-04-13 2015-07-08 Epizyme股份有限公司 用于治疗癌症的联合治疗

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104768555A (zh) * 2012-04-13 2015-07-08 Epizyme股份有限公司 用于治疗癌症的联合治疗

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JC STEELE 等: "The polycomb group proteins，BMI-1 and EZH2，are tumour-associated antigens", 《BRITISH JOURNAL OF CANCER》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110580956A (zh) * 2019-09-19 2019-12-17 青岛市市立医院 一组肝癌预后标志物及其应用
CN110580956B (zh) * 2019-09-19 2022-03-11 青岛市市立医院 一组肝癌预后标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Nipple discharge of CA15-3, CA125, CEA and TSGF as a new biomarker panel for breast cancer
CN103293308B (zh) 一种检测肿瘤标志物p16抗原表位氨基酸序列及应用
CN102585000B (zh) 一种肿瘤标志物cd25自身抗体及应用
AU2011241174B2 (en) Method and kit for cancer diagnosis
CN109765378A (zh) 一种新的肝硬化或肝纤维化标志物
CN104086640A (zh) 一种检测肿瘤免疫标志物birc5自身抗体氨基酸序列及应用
CN109342727A (zh) 食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型及其应用
CN102603892B (zh) 一种肿瘤标志物foxp3抗原多肽及应用
CN104277102A (zh) 一种检测乳腺癌标志物Annexin A1抗原表位氨基酸序列及应用
Hu et al. High RSF-1 expression correlates with poor prognosis in patients with gastric adenocarcinoma
CN103923212A (zh) Ehd2抗体及其在制备乳腺癌免疫组化检测试剂中的应用
CN105037534B (zh) 一种检测肺癌标志物myc抗原表位氨基酸序列及应用
CN104262467B (zh) 一种检测乳腺癌标志物epr-1抗原表位氨基酸序列及应用
CN104558147B (zh) 一种检测宫颈癌标志物cdkn2a抗原表位多肽及应用
CN105017404A (zh) 一种检测肝癌标志物ezh2抗原表位氨基酸序列及应用
CN105111297B (zh) 一种检测肝癌标志物imp1抗原表位氨基酸序列及应用
CN105017405B (zh) 一种检测肝癌标志物bmi1抗原表位氨基酸序列及应用
CN102532298B (zh) 与自身抗体特异性结合的abcc3抗原多肽及应用
CN105218656A (zh) 一种检测宫颈癌标志物Survivin抗原表位氨基酸序列及应用
CN105753960B (zh) 一种肿瘤标志物及其应用
CN104892746B (zh) 一种检测宫颈癌标志物-foxp3自身抗体表位氨基酸序列及应用
CN110431236A (zh) 肿瘤组织的免疫分析
CN108152496B (zh) Mest蛋白在制备肺癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒中的应用
Liu et al. Comparative study of BRAF gene mutations in ovarian serous tumors by immunohistochemistry and DNA sequencing
CN105111299A (zh) 一种检测乳腺癌标志物TGF-β1抗原表位氨基酸序列及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151104