CN104558147B - 一种检测宫颈癌标志物cdkn2a抗原表位多肽及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽及应用，属于属于生物技术领域。检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述，所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。优点是通过自行设计的CDKN2A的抗原表位多肽，检测宫颈癌患者血清及血浆中自身抗体表达水平并开发相应的试剂，预测宫颈癌发生的危险性，并为制备宫颈癌早期诊断试剂奠定基础。

Description

一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过生物信息学模拟筛选的具有检测宫颈癌标志物CDKN2A多肽片段，人群流行病学检测验证了其检测敏感度及特异度，为进一步用于制备宫颈癌早期诊断试剂盒奠定基础。
背景技术
大量研究表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此，既可以利用抗体检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤抗原的自身抗体，但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而肿瘤自身抗体在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内肿瘤自身抗体水平明显增高，则表明体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加重。
近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的自身抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50％以上。其主要原因是由于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在癌症患者中的阳性检测率平均在10％左右。如何提高诊断试剂敏感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的自身抗体，然后与现有已知的肿瘤相关抗原自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。
多重肿瘤抑制基因CDKN2A，又名p16，定位于人类染色体9p21的抑癌基因，直接参与细胞周期调控，它编码一种分子量为15845Da的蛋白质，内含有一个的开放阅读框架，由148个氨基酸组成。CDKN2A基因可直接作用于细胞周期，抑制细胞的分裂；CDKN2A蛋白可抑制细胞周期依赖性激酶4和6，阻止细胞从G1期进入S期，从而抑制癌细胞成长。当CDKN2A基因失活，引起G1期缩短，细胞周期加速，特别是DNA在没有修复前过早进入S期，这可能是细胞恶化的关键。
CDKN2A蛋白位于细胞浆和细胞核内。除脑、骨骼和肌肉外，广泛地表达于各种组织器官。当患者接受化疗、放疗后，肿瘤细胞死亡会释放出大量的CDKN2A蛋白的碎片，诱导免疫系统产生自身抗体。
发明内容
本发明提供一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽及应用。
本发明采取的技术方案是：
一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述。
H-DWLATAAARGRVEEVRGALPNAPNSYGRRPDC-OH
其纯度>95％，pH>7.0。
本发明所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
本发明利用自行设计的CDKN2A蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测宫颈肿瘤患者血清及血浆中抗CDKN2A蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体内CDKN2A蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性宫颈癌，可以预测宫颈癌发生与复发的危险性，指导临床医生对宫颈癌的早期诊断。
本发明优点是通过自行设计的CDKN2A的抗原表位多肽，检测宫颈癌患者血清及血浆中自身抗体表达水平并开发相应的试剂，预测宫颈癌发生的危险性，并为制备宫颈癌早期诊断试剂奠定基础。
附图说明
图1是宫颈癌患者体内抗CDKN2A的IgG抗体水平的ROC曲线分析图。
具体实施方式
一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽的氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所述。
H-DWLATAAARGRVEEVRGALPNAPNSYGRRPDC-OH
其纯度>95％，pH>7.0。
本发明所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程，蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。另外，ELISA法的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
本发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro，但有1-2个Pro利于肽链结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原(HLA)系统的限制性表位，包括HLA-DR,HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90％以上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。基于以上抗原设计原则及CDKN2A蛋白的生物学特性，本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了的线性氨基酸序列。CDKN2A线性多肽抗原由30个氨基酸残基组成，共含11个重叠表位，可检测至少11种单克隆抗体，具有高度的特异性。
下面结合具体实验例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例子仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
ELISA法检测抗原表位
采用ELISA方法，对收集的血液进行检测，并得到各样本OD值进行分析。
质控：各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度＝OD1-OD2/OD1+OD2，离散度≤0.1，为有效结果；离散度>0.1,为无效结果。取100份健康人血清等体积混合作为质控血(Quality control,QC)，代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血浆孔，以QC血浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV＝所有批次QC孔SD/所有批次QC孔OD均值<20％。批内变异CV＝每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值<10％。
数据分析：采用SPSS17.0for windows进行统计学分析。采用特异结合指数(Specific binding index，SBI)来判定CDKN2A抗原多肽与血浆自身抗体的结合程度，SBI＝CDKN2A OD值–NC OD值/QC OD值–NC OD值，NC为各样本的阴性对照。利用t检验分别比较恶性肿瘤与健康对照之间SBI值之间的差异，a＝0.05。
ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AU>0.5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算曲线下面积(AU)，判定灵敏度和特异度。
本发明应用CDKN2A抗原多肽检测到宫颈肿瘤患者血清及血浆中的特异性自身IgG抗体，并且该反应具有高特异性和高灵敏性。
CDKN2A抗原表位多肽可用于制备宫颈癌早期诊断试剂盒。
实施例1、试剂盒制备
1、试剂：试剂配制见表1～6。
表1抗原包被缓冲液(400ml体积)
表2洗涤缓冲液(400ml体积)
表3终止缓冲液(100ml体积)
表4工作抗原
表5二抗标准液
表6底物显色液
2、操作
(1)包被：酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，工作抗原用包被液稀释至工作浓度，包被于酶标板，4℃过夜。
(2)加谷氨酸：洗涤缓冲液清洗3遍，用包被液稀释谷氨酸至浓度100μg/ml，每孔200μl,37℃或室温孵育1h；
(3)加血浆和质控对照(一抗):酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用包被液将血浆稀释至合适浓度，一般为1:100～1:500，每孔100μl,37℃或室温孵育1h；
(4)二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3遍，利用包被液稀释二抗标准液IgG，工作浓度1:20000，每孔加100μl，37℃或室温孵育1h；
(5)显色：洗涤缓冲液清洗3遍，每孔加100μl底物显色液，室温避光30～45min。
(6)检测：每孔加50μl终止液，10min内检测，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
实施例2、宫颈患者的CDKN2A自身IgG抗体检测
1、样本收集：从吉林大学第二医院、省肿瘤医院选取经放射学检查和组织学检查确诊宫颈肿瘤恶性样本203例。所有血清样本采集前未经过任何抗癌治疗，并具有全面的临床资料和信息。同时招募了健康对照组样本154例。临床访谈及影像学检查均排除宫颈其它患病可能。健康组与宫颈癌组在性别、年龄匹配，具有可比性(P>0.05)
2、检测结果：CDKN2A的自身抗体表达水平(见表7)：宫颈癌组与健康对照组相比存在统计学差异(t＝-4.480，P<0.001)。
ROC曲线分析：宫颈癌组曲线下面积为0.637(SE＝0.030,95％CI：0.579-0.695)(见图1和表8)。
以上数据充分表明，利用本发明所设计的抗原多肽检测得到的宫颈肿瘤患者自身抗体IgG水平与正常健康组比较有显著性统计学差异。
表7抗CDKN2A的IgG抗体在宫颈癌患者和健康对照样本中的表达水平
抗体a是自身抗体表达水平SBI值，b是Student’s t检验(双边)
表8宫颈癌中抗CDKN2A的IgG抗体的ROC曲线(curve)分析

Claims (2)

1.一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所述。
2.如权利要求1所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
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