CN113702636A - 血浆自身抗体标志物在乳腺癌早期诊断及其分子亚型表征中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血浆自身抗体标志物在乳腺癌早期诊断及其分子亚型表征中的应用。具体地，本发明涉及区分早期乳腺癌与良性疾病对照或健康对照或者区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌的血液分子标志物。本发明的自身抗体是利用可推广的常规ELISA方法即可检测的微创血液分子标志物，是对早期乳腺癌血液分子标志物研究的有益补充。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地涉及肿瘤诊断的血液分子标志物，特别是血浆自身抗体标志物在乳腺癌早期诊断及其分子亚型表征中的应用。
背景技术
根据GLOBOCAN 2020的最新数据，乳腺癌已超过肺癌成为发病率最高的恶性肿瘤，并且仍然是全球女性肿瘤死因的首位。中国人群的乳腺癌疾病负担重，全国乳腺癌发病人数占全球的18.4％，死亡人数占全球的13.2％。早期诊断以利于早期治疗是提高乳腺癌患者生存率的关键，据报道44％的I期乳腺癌患者的5年相对生存率接近100％。乳房X线检查是目前发现乳腺癌的主要方式，但其很难发现倾向于沿着正常乳房结构生长的乳腺癌，而且对致密性乳房而言，其检测的假阳性率高。因此，易于快速检测的、微创且经济的、可在疾病早期检测到的血液生物标志物具有诊断早期乳腺癌的潜力，可作为乳房X光检查的补充以利于乳腺癌的早期发现。
靶向肿瘤相关抗原(TAAs)的自身抗体由于其具有可同时反映癌细胞和机体免疫状态的信息、比TAAs更稳定且易于检测、可在肿瘤发生的早期先于临床症状出现前检测到的这些优点，肿瘤相关自身抗体已经成为肿瘤诊断或预后的重要血液生物标志物之一。目前，在乳腺癌中经常报道的是p53、MUC1和HER2/Neu自身抗体。抗p53是研究最多的，在各种癌症中普遍存在。抗MUC1是一种经典的自身抗体，可出现在乳腺癌和其他癌症患者血浆中，有研究报道其含量在乳腺癌患者和对照组之间没有明显差异。在一项设计严格的研究中，抗HER2自身抗体水平在乳腺癌患者诊断前和诊断时均有上升，但该研究队列相对较小。单一自身抗体的阳性率从10％到20％不等，特异性约为90％。单个自身抗体存在灵敏度较低的问题，因此多个自身抗体的组合以提高检测灵敏度，可能是更可靠地早期检测乳腺癌的方法，但即使是类似的自身抗体，自身抗体组合在不同的研究中表现也不尽相同。在欧洲队列中，针对7个TAAs(p53、c-MYC、HER2、NY-ESO-1、BRCA1、BRCA2和MUC1)的自身抗体在区分原发性乳腺癌或原位导管癌与对照组时的灵敏度达到60％或45％，特异度达到85％。最近，利用6个自身抗体组合(抗p53、CyclinB1、p16、p62、14-3-3ξ、survivin)构建的诊断分类器模型，在一个中国的队列研究中显示了69.5％-78.2％的高灵敏度，64.8％-89.0％的特异度。然而，乳腺癌的多种自身抗体组合的研究一直集中在多种癌症中常见的几种到十多种自身抗体上，但很少有研究发现鉴定新的自身抗体。Anderson等采用由4,988个抗原组成的NAPPA蛋白阵列，发现并验证了含28个自身抗体的组合，其灵敏度为80.8％，特异度为61.6％(AUC＝0.756)，但其所用的验证队列样本量较小。
此外，乳腺癌具有高度异质性，基于乳腺癌细胞的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和表皮生长因子受体ERBB2/HER2的表达具有高度的异质性可将乳腺癌分为四个分子亚型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2+型和三阴性型。然而，目前仍然没有有效的血清生物标志物来表征不同的分子亚型，仅有少数研究调查了自身抗体在某个特定亚型中的表现。
综上，目前尚缺乏利用高通量芯片技术发现新的可用于乳腺癌早期诊断以及表征不同分子亚型的自身抗体标志物。
发明内容
现行的乳腺X线检查发现早期乳腺癌存在假阳性率高、针对致密性乳房以及倾向于沿着正常乳腺结构生长的乳腺癌检测能力不足的问题。肿瘤相关自身抗体具有发现早期乳腺癌的潜力，其特异度较高有望与乳房X线检查互补使用，但目前临床上尚无确切可用的乳腺癌诊断及亚型分型相关自身抗体。本研究旨在通过高通量蛋白芯片技术及多阶段验证的研究策略以期鉴定在早期乳腺癌(TNM分期0期-II期)中具有潜在诊断价值的新型自身抗体，并评估其与早期乳腺癌不同亚型的相关性。
在一个方面，本发明提供了区分早期乳腺癌与良性疾病对照或健康对照的血液分子标志物，所述血液分子标志物选自自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS、抗-CRLF3或其任何组合，特别是5个自身抗体的组合。例如，基于这5个自身抗体的组合建立的随机森林诊断分类器模型可以区分早期乳腺癌与总对照(包括乳腺良性疾病对照和健康对照)。
在一些实施方案中，本发明的血液分子标志物是自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS和抗-CRLF3的组合。
具体地，早期乳腺癌包括肿瘤TNM分期中的0期、IA期、IB期、IIA期和IIB期的乳腺癌。具体地，早期乳腺癌的分型是Luminal A、Luminal B、HER2+或三阴性亚型。具体地，良性疾病对照是乳腺良性疾病对照。
在一个方面，本发明提供了区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌的血液分子标志物，所述血液分子标志物是抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3H或其任何组合，特别是4个自身抗体的组合。例如，基于这四个自身抗体的组合建立的随机森林诊断分类器模型可以区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌。
在一些实施方案中，本发明的血液分子标志物是抗-KJ90125，其可以区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌。
在一些实施方案中，本发明的血液分子标志物是抗-CRLF3，其可以区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌。
在另一个方面，本发明提供了检测选自以下血液分子标志物的产品在制备用于区分早期乳腺癌与良性疾病对照或健康对照的工具中的应用：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS、抗-CRLF3中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了一种用于区分早期乳腺癌与良性疾病对照或健康对照的工具，所述工具包含检测选自以下血液分子标志物的产品：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS、抗-CRLF3中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述血液分子标志物是自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS和抗-CRLF3的组合。
在另一个方面，本发明提供了检测选自以下血液分子标志物的产品在制备用于区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌的工具中的应用：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了一种用于区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌的工具，所述工具包含检测选自以下血液分子标志物的产品：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述血液分子标志物是自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3的组合。
具体地，血液分子标志物的检测产品包括检测自身抗体的试剂。
在本发明的一个实施方式中，检测自身抗体的试剂包括能够定性或定量地检测自身抗体(例如抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS、抗-CRLF3)的试剂。
具体地，能够定性或定量地检测自身抗体的试剂包括能够特异性地结合该自身抗体的物质(例如蛋白或其片段)。
在本发明的一个实施方式中，所述工具可以为试剂盒、芯片或试纸等。其可以包含检测自身抗体的试剂，例如能够定性或定量地检测自身抗体的试剂(例如特异性地结合自身抗体的蛋白或多肽以及特异性的标记二抗)。
在本发明的另一个实施方式中，所述工具可以是用于高通量蛋白质平台和/或ELISA方法的工具，以使用定性或定量地检测自身抗体的试剂(例如特异性蛋白或肽段以及特异性的标记二抗)对自身抗体进行检测。
具体地，检测自身抗体的试剂/产品可以基于使用蛋白的已知方法来发挥其功能：例如，蛋白质组芯片技术、ELISA、多肽芯片等。
具体地，早期乳腺癌包括肿瘤TNM分期中的0期、IA期、IB期、IIA期和IIB期的乳腺癌。具体地，早期乳腺癌的分型是Luminal A、Luminal B、HER2+或三阴性亚型。具体地，良性疾病对照是乳腺良性疾病对照。
具体地，用于所述检测的生物样品可以使用例如从受试者获得的血液标本，例如，血液、血浆、血清等或其级分或经过处理的样本及材料；特别是，受试者的血液或其组成部分(例如血浆)。在本发明的一个实施例中，上述样本为血浆。
具体地，受试者可以为哺乳动物，例如，人、猴、犬、兔、鼠等，特别是人。
在又一个方面，本发明提供了确定用于区分早期乳腺癌及分子亚型的血液分子标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)高通量蛋白质芯片筛选步骤：利用高通量蛋白质芯片检测包含Luminal A、Luminal B、HER2+或三阴性亚型的早期乳腺癌以及包括良性疾病对照和健康对照的总对照的血浆样本，每个亚型及对照样本的例数各自在20例以上，以筛选符合以下条件的自身抗体：在早期乳腺癌组与良性疾病对照组/健康对照组的Fisher确切检验中符合P<0.05，早期乳腺癌组灵敏度至少大于20％，特异度至少大于70％且早期乳腺癌血浆样本中阳性率高于对照阳性率；或者在早期乳腺癌的不同亚型之间两两进行Fisher确切检验符合P<0.05且亚型之间阳性率的比值按降序排列时的排名约前30％。
2)定制芯片初步验证步骤：利用在步骤1)中筛选的自身抗体定制的低通量蛋白质芯片，在扩大的200例以上早期乳腺癌及100例以上的总对照样本中进行初步验证，在早期乳腺癌与总对照比较中利用Wilcoxon检验选择P<0.05的差异性自身抗体。
3)ELISA验证步骤：利用ELISA方法在200例以上早期乳腺癌及100例以上总对照的独立队列中验证以得到最终的自身抗体标志物。
附图说明
图1示出高通量蛋白质芯片筛选-定制芯片初步验证-ELISA验证的三阶段研究方法的设计流程图。
图2示出了定制芯片阶段中18个自身抗体在乳腺癌组合对照组的差异(Wilcoxon检验)。
图3示出了ELISA阶段5个自身抗体在分组间的差异(Wilcoxon检验)。
图4示出了ELISA阶段5个自身抗体在乳腺癌组和对照组的阳性率。
图5示出了ELISA阶段5个自身抗体在三阴性和非三阴性间的差异(Wilcoxon检验)。
图6示出了ELISA阶段5个自身抗体在亚型间的阳性率。
具体实施方案
1.研究对象和样本
选择在北京中国医学科学院肿瘤医院被诊断为乳腺癌并经手术活检确认的患者。从2016年5月到2020年7月，中国的乳腺癌患者被依次纳入本研究中。根据美国癌症联合委员会第八版的乳腺癌分期系统，共有574名乳腺癌患者被诊断为早期阶段，包括0、IA、IB、IIA、IIB的TNM阶段。所有ES-乳腺癌患者根据免疫组化染色中ER、PR、HER2、Ki-67的表达状态被分为四个亚型。4项指标的阳性定义标准遵守《肿瘤学临床实践指南》中的生物标志物检测原则国家综合癌症网络(NCCN)。对于HER2染色不明确的″+″至″++″结果，应以荧光原位杂交(FISH)检测的HER2基因扩增结果作为最终结论。共有126名良性乳腺疾病(BBD)患者，包括118名乳腺纤维腺瘤和乳腺腺病以及8名乳腺增生患者。所有ES-乳腺癌和BBD患者都是未接受治疗的，血清样本是在诊断时获得的。正常人对照组是定期体检的健康人，没有异常的实验室和影像检查。所有血清样本在实验前均保存在-80℃，血清样本的使用经中国医学科学院肿瘤医院/国家癌症临床研究中心伦理委员会批准(许可号：19-019/1804)，符合伦理文件。
2.高通量蛋白质芯片的构建和血浆自身抗体检测
高通量蛋白质芯片，即HuProtTM，由CDI Laboratories,Inc提供，用于发现阶段的3.0版本。HuProtTM文库克隆来自公共开放阅读框(ORF)或独立合成，通过酵母表达系统表达成带有GST-His6标签的蛋白质。HuProtTM V.3.0包含21888个非冗余蛋白质，涵盖了人类蛋白质图谱定义的81％的典型表达的蛋白质，所有的蛋白质和2304个阳性或阴性对照被打印成24个区块在玻片上。每个区块包含1056个探针，其中2个相邻的平行点被指定为复孔，并被排列成32x31的阵列。
自身抗体分析的实验过程参考已发表的研究，简而言之即是用5％的牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，在室温下封闭芯片1.5小时。丢弃封闭的BSA后，将芯片与准备好的血清样品以1:1000倍的比例在PBS中稀释，孵育1小时。然后，使用含0.1％吐温的PBST洗液清洗芯片后，加入Alexa fluor 647山羊抗人IgG(Jackson，美国)与5％BSA以1:1000倍的比例稀释，在室温下黑暗中孵育1小时。用PBST彻底清洗后，芯片自然干燥，用GenePix 4000B芯片扫描仪(Grace Bio-Labs，USA)用635nm激发激光(功率＝95，光电倍增管＝700)进行扫描。GenePix Pro V.6.0(Molecular Devices，美国)用于获得前景信号除以背景信号的信号强度(F/B)。阳性命中被定义为平均信号强度高于截断值(cutoff)，即每块芯片中所有信号点的平均值+6SD，经过区块校正和信号强度的Z-core归一化。
3.定制芯片的构建和血浆自身抗体的检测
从HuProtTM和文献中挑选出候选蛋白的克隆来制作靶向定制芯片，通过14腔橡胶垫圈(GraceBio Corp,Bend,OR)分离将其分为2x7个子阵列。除了封闭步骤改为3％BSA，后续过程与高通量蛋白质芯片检测相似。定制芯片的扫描和F/B数据的获取也与HuProtTM相似。
4.酶联免疫吸附试验(ELISA)
使用带有GST和His6标签的重组蛋白(CDI，美国)来测试血清自身抗体。简而言之，将50ng重组蛋白包被于96孔板上(Corning，USA)，4℃过夜。用5％的脱脂牛奶封闭2小时，用0.2％的PBST洗涤后，在每孔中加入50ul 1:100倍稀释的血浆样品，在37℃下孵育1小时。随后加入50ul 1:20000倍稀释的过氧化物酶山羊抗人IgG抗体(Jackson,USA)，37℃培养1小时，加入75ul四甲基联苯胺(TMB)，室温下进行15分钟的发色反应，然后加入75ul H2SO4停止反应。最后，用Multiskan GO自动微板阅读器(Thermo,USA)对每个ELISA板进行一次性扫描，得到每个孔的光密度值(OD)，减去空白对照的OD值后得到每个孔的最终OD值。
5.统计学分析
数据处理和分析在R Version.4.0.2(R Foundation for StatisticalComputing；www.r-project.org)软件中进行。使用卡方检验和Fisher's exact检验来比较各组的阳性率。Wilcoxon检验用于比较不同组别中AAbs的水平。使用Pearson分析和Spearman分析评估相关关系。P<0.05被认为具有统计学意义，必要时可通过Bonferroni校正调整。在使用DMwR 0.4.1版软件包(http://www.dcc.fc.up.pt/～ltorgo/DataMiningWithR)中的SMOTE功能进行过采样后，使用caret软件包6.0-86版(https://github.com/topepo/caret/)进行随机森林建模分析。
实施例
首先，我们利用涵盖人蛋白质组约20K蛋白质的高通量蛋白质芯片在80例包含了四个分子亚型的早期乳腺癌(Luminal A型20例，Luminal B型20例，HER2+20例，三阴性型20例)及39例对照(20例乳腺良性疾病对照及19例健康对照)的血浆样本中初步筛选了79个乳腺癌诊断及亚型相关的自身抗体，其中37个为早期乳腺癌诊断相关性自身抗体，其筛选原则为：1.早期乳腺癌组与良性疾病组/健康对照组的分别进行Fisher确切检验时符合P<0.05选出；2.灵敏度大于30％，且特异度大于70％。37个自身抗体在早期乳腺癌患者中灵敏度为31.25％-61.30％阳性率显著高于对照组阳性率(<15％)，其特异度均超过80％，另外42个自身抗体为乳腺癌分子亚型相关性自身抗体，其筛选原则为：1.早期乳腺癌的四个亚型之间两两进行Fisher确切检验符合P<0.05；2.亚型之间阳性率的比值降序排列排名约前30％。基于筛选的79个自身抗体联合文献及数据库查询的21个自身抗体靶向定制了涵盖100个蛋白的低通量蛋白质芯片，并扩大样本在249例早期乳腺癌(Luminal A型49例，Luminal B型113例，HER2+38例，三阴性型47例，未知型2例)及158例对照中(58例乳腺良性疾病对照及100例健康对照)进行初步验证，通过249例早期乳腺癌组与158例对照组进行Wilcoxon检验选择P<0.05的18个差异性自身抗体，18个自身抗体在早期乳腺癌组中的水平显著高于对照组(BBD和NHC)，同时其中的8个自身抗体水平在不同分子亚型之间存在显著差异。最后通过常规的ELISA方法在245例早期乳腺癌(Luminal A型70例，Luminal B型70例，HER2+47例，三阴性型58例)及128例对照(48例乳腺良性疾病对照及80例健康对照)中的独立队列中验证了5个新的乳腺癌诊断相关的自身抗体(抗-KJ90125，抗-FAM49B，抗-HYI，抗-GARS，抗-CRLF3)，5个自身抗体在早期乳腺癌与乳腺良性疾病组/健康对照组分别进行Wilcoxon检验均符合P<0.05，
单个自身抗体的水平在早期乳腺癌患者中均显著高于乳腺良性疾病组/健康对照组。同时，5个自身抗体在Luminal B型及HER2+型中自身抗体水平较高而在三阴性型中的水平较低，抗-KJ901215，抗-CRLF3在三阴性型与非三阴性型(Luminal A型+Luminal B型+HER2+型)的Wilcoxon检验中存在显著差异(P<0.05)，抗-FAM49B,抗-HYI存在边缘显著差异(0.05<P<0.1)。5个自身抗体在早期乳腺癌中的灵敏度从20.41％到28.57％不等，特异度均超过90％，其中抗-KJ90125在三阴性型以及抗-CRLF3在Luminal B型中的灵敏度均超过30％，当5个自身抗体组合作时区分早期乳腺癌组与对照组的灵敏度可达39.78％，特异度达85.94％。此外，基于5个自身抗体的ELISA数据，我们还建立了区分早期乳腺癌和对照组的随机森林诊断分类器模型，模型的灵敏度为76.3％，特异度为86.8％，受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.870，将5个自身抗体与影像学检查的BI-RADS评分结合同时建立分类器模型，模型的灵敏度为87.8％，特异度为93.0％，AUC为0.967。同时基于4个自身抗体(抗-KJ90125，抗-FAM49B，抗-HYI，抗-CRLF3H)建立的随机森林诊断分类器模型可区分三阴性亚型和非三阴性亚型的早期乳腺癌患者，模型的灵敏度为77.2％，特异度为76.9％，受AUC为0.874。
表1.高通量芯片阶段筛选的37个差异性自身抗体
表2.高通量芯片阶段筛选的42个差异性自身抗体
表3.ELISA 阶段验证的5个自身抗体在早期诊断中的表现
表4.ELISA 阶段验证的5个差异性自身抗体在不同亚型中的表现
注：non-TN，非三阴性型；TN，三阴性型；BBD，乳腺良性疾病对照；NHC，健康对照；Control，总对照。
我们利用蛋白质芯片技术筛选及多阶段验证的研究策略逐步验证了5个此前在乳腺癌中从未被报道的新自身抗体，其具有较高的特异度，且其中的4个自身抗体可区分出预后较差的非三阴性型早期乳腺癌。同时这些自身抗体是利用可推广的常规ELISA方法即可检测的微创血液分子标志物，是对早期乳腺癌血液分子标志物研究的有益补充。
Claims (10)
1.区分早期乳腺癌与良性疾病对照或健康对照的血液分子标志物，所述血液分子标志物选自自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS、抗-CRLF3或其任何组合，特别是自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS和抗-CRLF3的组合。
2.区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌的血液分子标志物，所述血液分子标志物是自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3H或其任何组合，特别是自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3H的组合。
3.检测选自以下血液分子标志物的产品在制备用于区分早期乳腺癌与良性疾病对照或健康对照的工具中的应用：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS、抗-CRLF3中的一种或多种。
4.检测选自以下血液分子标志物的产品在制备用于区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌的工具中的应用：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3中的一种或多种。
5.一种用于区分早期乳腺癌与良性疾病对照或健康对照的工具，所述工具包含检测选自以下血液分子标志物的产品：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-GARS、抗-CRLF3中的一种或多种。
6.一种用于区分三阴性型早期乳腺癌与非三阴性型早期乳腺癌的工具，所述工具包含检测选自以下血液分子标志物的产品：自身抗体抗-KJ90125、抗-FAM49B、抗-HYI、抗-CRLF3中的一种或多种。
7.根据权利要求3或4所述的应用或者根据权利要求5或6所述的工具，其中所述产品包括检测所述自身抗体的试剂，例如定性或定量地检测所述自身抗体的试剂，诸如特异性地结合所述自身抗体的物质。
8.根据权利要求3或4所述的应用或者根据权利要求5或6所述的工具，其中所述工具是试剂盒、芯片或试纸，例如用于高通量蛋白质平台和/或ELISA方法的试剂盒、芯片或试纸。
9.根据权利要求3或4所述的应用或者根据权利要求5或6所述的工具，其中用于所述检测的生物样品是从受试者获得的血液标本，例如血液、血浆、血清或其级分或经过处理的样本及材料，特别是血浆；
所述受试者是哺乳动物，例如人、猴、犬、兔或鼠，特别是人；
所述早期乳腺癌是TNM分期中的0期、I期、II期的乳腺癌。
10.一种确定用于区分早期乳腺癌及分子亚型的血液分子标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)高通量蛋白质芯片筛选步骤：利用高通量蛋白质芯片检测包含Luminal A、LuminalB、HER2+或三阴性亚型的早期乳腺癌以及包括良性疾病对照和健康对照的总对照的血浆样本，每个亚型及对照样本的例数各自在20例以上，以筛选符合以下条件的自身抗体：在早期乳腺癌组与良性疾病对照组/健康对照组的Fisher确切检验中符合P<0.05，早期乳腺癌组灵敏度至少大于20％，特异度至少大于70％且早期乳腺癌血浆样本中阳性率高于对照阳性率；或者在早期乳腺癌的不同亚型之间两两进行Fisher确切检验符合P<0.05且亚型之间阳性率的比值按降序排列时的排名约前30％；
2)定制芯片初步验证步骤：利用在步骤1)中筛选的自身抗体定制的低通量蛋白质芯片，在扩大的200例以上早期乳腺癌及100例以上的总对照样本中进行初步验证，在早期乳腺癌与总对照比较中利用Wilcoxon检验选择P<0.05的差异性自身抗体；以及
3)ELISA验证步骤：利用ELISA方法在200例以上早期乳腺癌及100例以上总对照的独立队列中验证以得到最终的自身抗体标志物。
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