CN101988087A - 一种p16基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种p16基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种p16基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测外阴鳞癌疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种p16基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种p16基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【背景技术】

鳞癌，又称表皮样癌，是发生在皮肤、附属器或粘膜的恶性肿瘤。鳞癌多发于50岁以上的男性，常见于面部、头皮、下唇、手背、前臂、阴部等处。尤其是皮肤与粘膜交界处更易发生。初起为暗红色坚硬的疣样小结节，表面毛细血管扩张，中央有角质物附着，不易剥离，用力剥后可出血。皮损逐渐扩大，形成坚硬的红色斑块，表面有少许鳞屑，边境清楚，向周围浸润，触之较硬，迅速扩大形成溃疡，溃疡向周围及深部侵犯，可深达肌肉与骨骼，损害互相粘连形成坚硬的肿块，不易移动，溃疡基底部为肉红色，有坏死组织，有脓液、臭味，易出血。溃疡边缘隆起外翻，有明显炎症，自觉疼痛。如发生在皮肤与粘膜交界处，固潮湿与摩擦更易出血，发展更快，可形成菜花状，破坏性大，有明显疼痛，易转移，预后不良。

p16基因序列号NM-000077 1163bp mRNA CDS：213…….683bp，在染色体9p21”。P16基因是抑制癌症基因，它在正常人中有非常高的表达，在临床各种类型癌症中都有表达降低或缺失。临床研究人员采用PCR方法对P16基因在外阴鳞癌、外阴基底细胞癌、外阴疣状癌、外阴上皮肉瘤变III(VINIII)、正常外阴皮肤中的表达情况进行研究，结果是P16在正常外阴皮肤中的阳性表达率为100％，外阴上皮肉瘤变III(VINIII)中为61.9％，外阴鳞癌中为27.91％，外阴基底细胞癌和外阴疣状癌中零表达，它们之间的差异有显著性(P＜0.05)，P16基因的表达量与临床分期分型及转移程度有关。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种p16基因的原位杂交检测试剂盒的用途。

本发明的再一的目的是，提供一种p16基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的另一的目的是，提供一种p16基因的原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种p16基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测外阴鳞癌等肿瘤疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的疾病是外阴基底细胞癌或外阴疣状癌及其它类型的肿瘤。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种p16基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种p16基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

3、本发明能及早做到p16基因表达异常的信息采集，给临床外阴鳞癌病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施外阴鳞癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治外阴鳞癌恶疾。

【附图说明】

图1是正常人p16基因表达图；

图2是外阴上皮肉瘤变病人p16基因表达图；

图3是外阴疣状癌病人的p16基因表达图

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种p16基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液         100μl/管  1管/盒    无色透明液体

保护液         100μl/管  1管/盒    无色透明液体

预杂交液       1300μl/管 2管/盒    无色透明液体

正义杂交液     10μl/管   1管/盒    无色透明液体

反义杂交液     10μl/管   1管/盒    无色透明液体

封闭液         1000μl/管 1管/盒    无色透明液体

碱性磷酸酶抗体 1μl/管    1管/盒    无色透明液体

显色剂A        175μl/管  1管/盒    黄色液体

显色剂B        320μl/管  1管/盒    无色透明液体

缓冲液I 10x    90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x   80ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x  20m/瓶     3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x   90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

固定液         90ml/瓶    1瓶/盒    无色透明液体

阳性对照标本   6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H₂O 360g

KCl 2g

KH₂PO₄2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl 175.3g

柠檬酸钠88.2g

HCl几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris 121.1g

NaCl 87.66g

HCl 60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种p16基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；

按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％1封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测外阴皮肤细胞中的p16基因表达量，用来确定外阴鳞癌。临床研究表明，P16在正常外阴皮肤中的阳性表达率为100％，外阴上皮肉瘤变III(VINIII)中为61.9％，外阴鳞癌中为27.91％，外阴基底细胞癌和外阴疣状癌中零表达。本发明实施例采样为：正常对照组5名，外阴上皮肉瘤变病人5名，外阴疣状癌病人5名。结果表示，所有正常人的p16基因有过度表达，细胞染色；外阴上皮肉瘤变病人p16基因有表达，细胞染色；所有外阴疣状癌病人的p16基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1是正常人p16基因表达图；图2是外阴上皮肉瘤变病人p16基因表达图；图3是外阴疣状癌病人的p16基因表达图。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种p16基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1163

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

ctcctccgag cactcgctca cggcgtcccc ttgcctggaa agataccgcg gtccctccag     60

aggatttgag ggacagggtc ggagggggct cttccgccag caccggagga agaaagagga    120

ggggctggct ggtcaccaga gggtggggcg gaccgcgtgc gctcggcggc tgcggagagg    180

gggagagcag gcagcgggcg gcggggagca gcatggagcc ggcggcgggg agcagcatgg    240

agccttcggc tgactggctg gccacggccg cggcccgggg tcgggtagag gaggtgcggg    300

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ccaactgcgc cgaccccgcc actctcaccc gacccgtgca cgacgctgcc cgggagggct    480

tcctggacac gctggtggtg ctgcaccggg ccggggcgcg gctggacgtg cgcgatgcct    540

ggggccgtct gcccgtggac ctggctgagg agctgggcca tcgcgatgtc gcacggtacc    600

tgcgcgcggc tgcggggggc accagaggca gtaaccatgc ccgcatagat gccgcggaag    660

gtccctcaga catccccgat tgaaagaacc agagaggctc tgagaaacct cgggaaactt    720

agatcatcag tcaccgaagg tcctacaggg ccacaactgc ccccgccaca acccaccccg    780

ctttcgtagt tttcatttag aaaatagagc ttttaaaaat gtcctgcctt ttaacgtaga    840

tatatgcctt cccccactac cgtaaatgtc catttatatc attttttata tattcttata    900

aaaatgtaaa aaagaaaaac accgcttctg ccttttcact gtgttggagt tttctggagt    960

gagcactcac gccctaagcg cacattcatg tgggcatttc ttgcgagcct cgcagcctcc   1020

ggaagctgtc gacttcatga caagcatttt gtgaactagg gaagctcagg ggggttactg   1080

gcttctcttg agtcacactg ctagcaaatg gcagaaccaa agctcaaata aaaataaaat   1140

aattttcatt cattcactca aaa                                           1163

Claims (10)

1.一种p16基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测外阴鳞癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种p16基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种p16基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

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