CN102603892B - 一种肿瘤标志物foxp3抗原多肽及应用 - Google Patents
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Abstract
一种肿瘤标志物FOXP3抗原多肽及应用，属于免疫学技术领域，本发明提供了一种免疫应答调节基因FOXP3的抗原氨基酸序列。应用FOXP3多肽抗原检测肺癌和食管癌患者血中相应的特异性抗原表位，这种抗原表位可作为为肿瘤标志物评估肺癌和食管癌发生的危险度。这种抗原多肽及其抗体可用于制备肿瘤早期诊断试剂和开发治疗肿瘤的靶向药物。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，是一种用于制备肿瘤早期诊断试剂和开发治疗肿瘤的靶向药物。
背景技术
大量研究表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生自身抗体, 在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原,也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此， 既可以利用抗体检测肿瘤抗原, 也可以利用抗原检测肿瘤自身抗体，但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而自身抗体在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内自身抗体水平明显增高，则表明体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加重。
近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。 是肿瘤临床诊断领域的重点发展方向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的自身抗体，然后与现有已知的自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。
肿瘤可通过各种直接或间接的机制来逃避机体免疫系统的监控。一系列的研究已经证明， 调节性Treg 细胞与肿瘤免疫逃避机制密切相关。在肺癌、 乳腺癌、 卵巢癌以及出现淋巴结转移的黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中， 存在Treg细胞 比例增高现象。Treg 通过细胞与细胞直接接触或通过细胞因子的释放, 对效应性CD4+/ CD8+T 细胞活化和增殖发挥抑制作用。其效应机制主要是抑制CD4+T 细胞增生、 抑制肿瘤特异性抗原激活的CD4+效应细胞分泌 IL-2，抑制CD8+IFN 2C和TNF2A产生，并在肿瘤微环境中能限制 CTLs细胞毒性颗粒释放，使肿瘤细胞逃逸免疫杀伤。本发明中的FOXP3为Treg 细胞的主要表面标志物。
FOXP3是叉头样转录因子家族中的成员 ，早期被发现特异地表达在 CD4+CD25+调节性 Treg细胞表面，与其发育和功能密切相关，在一定程度上可以反映 CD4+/CD25+调节性 Treg细胞的水平和功能活性。随后的研究发现 FOXP3在肺癌、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞等肿瘤细胞中都有表达。同时FOXP3是 Treg细胞发育的一个关键转录因子，虽然有个别研究显示 FOXP3在少量的 CD4+/ CD25-T细胞和 CD8+ Treg细胞上也有表达，但目前 FOXP3仍然被认为是 CD4+/CD25+调节性 Treg细胞的一个最特异标志。越来越多的证据表明 CD4+/CD25+调节性 Treg细胞可能在肿瘤免疫逃逸中起了关键作用。本发明通过自行设计的FOXP3抗原表位多肽，检测肿瘤患者血清及血浆中自身抗体水平并开发相应的试剂，预测肿瘤发生的危险性，并为肿瘤新药研究提供可靠的数据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是公开一种肿瘤标志物FOXP3抗原多肽 。
本发明同时公开了FOXP3抗原多肽 的用途。
本发明提供的一种肿瘤标志物FOXP3抗原多肽 的氨基酸序列为：
EIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKD 纯度>95%, pH>7.0。
本发明所述的FOXP3抗原多肽在制备预测肿瘤早期诊断试剂盒中的应用。
本发明利用自行设计的FOXP3蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测肺癌和食管癌患者血清及血浆中抗FOXP3蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体内FOXP3蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肿瘤，可以预测肿瘤发生与复发的危险性，指导临床医生对肿瘤的早期诊断。
蛋白质氨基酸序列见Tab.1
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程，蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。另外，ELISA法的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro，但有1-2个Pro利于肽链结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原(HLA)系统的限制性表位，包括HLA-DR, HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90%以上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。
基于以上抗原设计原则及FOXP3蛋白的生物学特性，本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了的线性氨基酸序列（见Tab.1）。加框部分是多肽片段在蛋白质中的位置。
由以上蛋白序列可知，FOXP3线性多肽抗原由32个氨基酸残基组成，共含12个重叠表位，可检测至少12种单克隆抗体，具有高度的特异性。
ELISA法检测自身抗体
（1）酶标板设计：每份血浆样本各设人FOXP3抗原多肽双复孔，山羊多肽对照抗原（gAg）双复孔和阴性对照双复孔（NC）。gAg抗原与人类蛋白质组无同源性，目的是减低非特异性结合反应的干扰，gAg的工作浓度范围10-20μg/ml。
（2）包被：抗原多肽用包被液（pH7.0～7.4 0.01M PBS/0.1%NaN3）包被于96孔酶标板（COSTAR,美国），每孔100μl， FOXP3抗原多肽包被浓度7.5～15.0μg/ml，gAg包被浓度为15～20μg/ml， 4℃过夜。
（3）一抗/血浆孵育：0.01M PBS/0.005% TWEEN-20清洗每孔3遍，利用分析液（0.01M PBS+1%BSA+2%羊血浆）将血浆1:500稀释，每孔100μl,25℃孵育 2～3h；
（4）二抗孵育：0.01M PBS/0.005% TWEEN-20清洗每孔5遍，利用分析液（同前）稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（美国，Sigma），每孔加200μl，25℃孵育 2h；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG ELISA工作范围：1:30000～1:50000。
（5）显色：0.01M PBS/0.005% TWEEN-20清洗每孔5遍，利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）过氧化物酶的底物（Invtrogen，美国），每孔加100μl，室温避光15～30min。
（6）检测：每孔加50μl 10%H2SO4为反应终止液，10min内使用酶标仪（BioTeck ELx800，美国）检测OD 值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
质控 各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=OD1-OD2/OD1+OD2，离散度≤0.1，为有效结果；离散度>0.1,为无效结果。取100份健康人血清等体积混合作为质控血（Quality control,QC），代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血浆孔，以QC血浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔 SD/所有批次QC孔 OD均值<20%。 批内变异CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值<10%。
数据分析 采用SPSS17.0 for windows进行统计学分析。采用特异结合指数（Specific binding index， SBI)来判定FOXP3抗原多肽与血浆自身抗体的结合程度，SBI= FOXP3 OD值 – NC OD/ gAg OD值 – NC OD，NC为各样本的阴性对照。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式（分界值或决定阈），以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AU>0.5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该发明采用Analyse-it for Microsoft Excel软件绘制ROC曲线，计算曲线下面积（AU），以健康人SBI平均值+2SD判为阳性，判定灵敏度和特异度；进行秩和（Z）检验，检验一类错误水准为a=0.05。
本发明应用FOXP3抗原多肽检测到肺癌及食管癌患者血清及血浆中的特异性自身IgG抗体, 并且该反应具有高特异性和高灵敏性，FOXP3抗原多肽可用于制备肿瘤早期诊断试剂盒。
附图说明
附图为FOXP3抗原多肽与血浆IgG结合的SBI曲线图。
具体实施方式
实施例1
FOXP3抗原多肽与血清及血浆IgG结合的过程
由图1可知，FOXP3浓度5～12.5μg/ml时，随着浓度的增大，SBI值逐渐下降，当FOXP3抗原多肽浓度12.5～15μg/ml时，随着浓度的增大，SBI值逐渐上升。此SBI结合曲线表明，当FOXP3抗原多肽为5μg/ml（0.5μg/well）的较低浓度时，96孔酶标板的板底没有被铺满，导致非特异性反应高，所以此时SBI值偏高，为假阳性结果；随着FOXP3抗原多肽浓度增高，抗原逐渐铺满整个板底，其阻断作用显现，非特异性反应逐渐减小，到12.5 μg/ml时非特异性反应最低，此时FOXP3抗原多肽与IgG抗体的特异性结合开始出现，并随着抗原浓度的增高逐渐增强，至15μg/ml时结合力最强，之后趋于平稳。此SBI结合曲线充分展现了FOXP3抗原多肽与血浆中自身IgG抗体的特异性结合反应过程。
实施例2
试剂盒制备
1 试剂 试剂配制见Tab.2～9。
| Tab.2抗原包被缓冲液 |
| 叠氮钠0.1g |
| PBS(0.01M， pH7.4) 100ml 4℃保存 |
2 操作
（1）包被：工作抗原及参比抗原用包被液稀释至工作浓度，包被于酶标板， 4℃过夜。
（2）加血浆(一抗):酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用分析液将血浆稀释至合适浓度，一般为1:200～1:500，每孔100μl,25℃或室温孵育 2～3h；
（3）二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3～5遍，利用分析液稀释二抗标准液IgG，每孔加200μl，25℃/室温孵育 2h；
（4）显色：洗涤缓冲液清洗3～5遍，每孔加100μl底物显色液，室温避光15～30min。
（5）检测：每孔加50μl终止液，10min检测，波长为450nm，参考波长为630nm。
实施例3
肺癌患者的FOXP3自身IgG抗体检测
1样本收集：收集501份肿瘤患者及健康人血浆样本。健康组227例，平均年龄为57.07±10.36岁, 其中男134例，女92例。肺癌组274例，平均年龄为57.5±9.2岁, 其中男177例，女97例。健康组与肺癌组在性别、年龄匹配，具有可比性（P>0.05）
2检测结果：由Tab.10-11可知，肺癌患者血浆中FOXP3抗原多肽的IgG抗体ROC曲线下面积（AU）为0.7，灵敏度为20.4%，特异度为90.3%。肺癌患者血浆中与FOXP3多肽抗原结合的IgG抗体阳性率明显高于健康组（Z= -7.68，P<0.001）。以上数据充分表明，利用本发明所设计的抗原多肽检测得到的肺癌患者自身抗体IgG水平与正常健康组比较有显著性统计学差异。
实施例4
食管癌患者FOXP3自身IgG抗体检测
1样本来源：收集501份肿瘤患者及健康人血浆样本。健康组227例，年龄, 平均年龄为57.07±10.36岁，其中男134例，女92例。食道癌95例。食道癌组95例,平均年龄为58.62±7.46岁,其中男48例，女47例。健康组与食管癌组在性别、年龄匹配，具有可比性（P>0.05）。
2检测结果：由Tab.10-11可知，食管癌患者血浆中FOXP3抗原多肽的IgG抗体ROC曲线下面积（AU）为0.7，灵敏度为31.6%，特异度为90.3%。食管癌患者血浆中与FOXP3多肽抗原结合的IgG抗体阳性率明显高于健康组（Z= -7.11，P<0.001）。以上数据充分表明，利用本发明所设计的抗原多肽检测得到的食管癌患者自身抗体IgG水平与正常健康组比较有显著性统计学差异。
Tab.10食道癌与肺癌患者中FOXP3自身IgG抗体检测ROC曲线分析结果
Tab.11食道癌与肺癌患者中FOXP3自身IgG抗体检测对比分析结果
Claims (2)
1.一种肿瘤标志物FOXP3抗原多肽，其特征在于：氨基酸序列为
EIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKD，其纯度>95%, pH>7.0。
2.根据权利要求1所述的肿瘤标志物FOXP3抗原多肽在制备肺癌和食管癌早期诊断试剂盒中的应用。
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