CN104597241A - 一种检测天然多克隆抗癌抗体的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测天然多克隆抗癌抗体的组合物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测天然多克隆抗癌抗体(NPAA)的组合物、由该组合物制成的试剂盒、使用该组合物或该试剂盒检测血浆中NPAA浓度的方法、以及该组合物或该试剂盒在检测血浆NPAA中的应用。本发明利用与目标NPAA完全互补的4种线性抗原多肽实现对血浆中NPAA的定性、定量检测，可用于区分富含NPAA和不含NPAA的血浆。

Description

一种检测天然多克隆抗癌抗体的组合物、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，涉及四种肽类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法(ELISA)抗体检测试剂盒，用以检测血浆中天然多克隆抗癌抗体(NPAA)浓度。
背景技术
恶性肿瘤是威胁整个人类健康的最主要杀手之一。基于灰霾雾霾等环境污染状况的持续存在，中国人群主要癌症的发病率呈逐年上升趋势。据统计，目前我国癌症平均每年发病率高达3/1000以上。虽然肿瘤早期治疗手段，如手术切除或放射线治疗已发展的比较成熟，能够明显延长病人的存活时间，但大约60％的癌症患者在接受局部治疗后仍有可能在一年内复发，大约90％的病人最终死于肿瘤的复发和转移。因此，如何在肿瘤治疗领域探索一种创新的控制肿瘤复发和转移的免疫支持手段，是本发明技术的主要目的之一。
近年来的研究表明，检测肿瘤相关抗原或抗体具有指导靶向治疗价值。例如，临床上已广泛应用的曲妥株单抗(Trastuzumab)和贝伐株单抗(Bevacizumab)就是以人上皮细胞生长因子二型受体(human epidermalgrowth factor receptor 2，HER2)和血管内皮细胞生长因子A(Vascularendothelial growth factor A，VEGF-A)为标靶，成为临床治疗中晚期肿瘤的重要手段。然而，由于副作用太大，这两种单克隆抗体只能做为三线治疗药物。因此，发展可用于防止肿瘤局部治疗后转移和复发、且副作用低的新型手段是目前亟待解决的问题。从免疫治疗领域解决这个难题的关键在于设计具有创新性的标靶技术实施方案，然后发展能有效防治肿瘤的新型技术。
血管内皮细胞生长因子一型受体(Vascular endothelial growthfactor receptor 1,VEGFR1)是一种跨膜蛋白，也是一种公认的癌细胞表达的特异性蛋白。大量的研究工作发现，许多人类实体肿瘤可大量表达VEGFR1，如肝癌，肺癌，肾癌，肠癌及乳腺癌等。因为VEGFR1抗原表位多肽主要位于肿瘤细胞表面，可成为相应抗体直接攻击杀伤肿瘤的靶点(如贝伐株单抗治疗原理)，也可间接地影响其功能而限制肿瘤的生长与发展。
HER2是受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases)家族成员之一，也是一种跨膜醣蛋白。目前发现，多种实体肿瘤可表达HER2，包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌及头颈部癌肿等。在现有技术中，曲妥株单抗对治疗HER2表达阳性的乳腺癌具有显著的疗效。
上皮粘蛋白1(Mucin 1,MUC1)是一种醣化的细胞膜蛋白，多数常见上皮恶性肿瘤细胞均大量表达MUC1，且与恶性细胞的快速增生有关。故MUC1是非常重要的肿瘤标靶，在发展癌症免疫疗法中具有重大意义。基于MUC1蛋白为靶标的肿瘤疫苗技术目前已在国外进入临床试验阶段。可以预见，全新的化疗手段未来在肿瘤治疗中的地位将越来越重要。
越来越多的临床研究表明，许多恶性肿瘤可能存在原发耐药性(intrinsic resistance)，即对初始化疗药物不敏感，因而导致化疗失败。原发耐药性形成的主要机理之一，是因为肿瘤细胞表达耐药蛋白，例如ATP结合盒(ABC)转运蛋白。这种转运蛋白发挥泵功能，可以将进入肿瘤细胞内的化疗药物转移到细胞外，进而保护细胞免受药物的杀伤。基因表达谱筛查及大量临床病理研究证实，多种肿瘤细胞表达ABCC3转运蛋白，其中包括乳腺癌、食道癌、肺癌、肾癌及头颈部癌肿等。据此，ABCC3转运蛋白可以成为针对具有原发耐药性肿瘤的免疫治疗标靶。
众所周知，由于细胞在增殖和发育过程中可能发生突变，健康人的体内每天都会出现一定数量的癌细胞。但是，由于免疫监视功能的存在，这些癌细胞可被人体中的各种抗体和免疫细胞及时清除。本发明正是基于免疫监视功能的原理，建立筛查存在正常人体内的天然抗癌抗体技术，为进一步发展癌症防治方法和预测肿瘤发病风险奠定基础。
发明内容
本发明人发现，健康人体内会自然形成与前述HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种癌细胞特异性蛋白的抗原表位序列相对应的特异性抗体，并单独或与免疫细胞协同作用抑杀癌细胞。本发明中将这类人体内自然形成的、能识别其中一种或多种癌细胞特异性蛋白的抗原表位的抗癌抗体统称为“天然多克隆抗癌抗体”(natural polyclonalanti-cancer antibody,NPAA)。人血浆中NPAA可以认为是一类天然抗肿瘤抗体，在人体内执行免疫监视和免疫清除功能，防止肿瘤的形成与发展。
因此，本发明的主要目的是提供一组用于检测健康人血浆中NPAA浓度的线性抗原多肽和由此制备的试剂盒，以及使用该组抗原多肽或该试剂盒检测人血浆中NPAA的方法。所述抗原多肽为HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种癌细胞特异性蛋白的抗原表位。这些抗原表位能够与人血浆中针对HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3的特异性抗体结合。
如本发明所定义的“天然多克隆抗癌抗体(NPAA)”是天然存在于健康人体内的，能识别一种或多种癌细胞特异性蛋白抗原表位的抗体或多克隆抗体混合物，或者说优选能识别HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种癌细胞特异性蛋白抗原表位的一种或多种抗体或多克隆抗体混合物。在本发明的特定实施方案中，所述NPAA是指能识别SEQ IDNO:1-4中的一个或多个表位序列的抗体或多克隆抗体混合物。
本发明人利用免疫信息学方法和计算机软件，在HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3蛋白序列上进行人类白细胞二类抗原(Human leukocyte antigenII,HLA-II)表位制图，甄别具有高度亲和力的序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。
已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。因此，两者在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高，因此，目标抗体(待检测抗体)及其结合位点结构是先决因素，抗原决定簇影响整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。
本发明根据HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种蛋白的生物学特性，针对这四种蛋白的多个表位进行免疫信息学预测和模拟，经分析与抗原性相关的各种参数，分别设计了四种在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性抗原多肽，其氨基酸序列见表1。
表1.检测人血浆中NPAA的线性抗原多肽序列
经固相化学法合成上述4种抗原多肽，并按比例混合后制备ELISA抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测健康个体血浆中天然多克隆抗癌抗体(NPAA)浓度。上述4种抗原多肽在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，4℃环境下可保存6个月以上。简言之，可将四种多肽抗原混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板在45度(45℃)烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。优选4种多肽抗原均为纯度>95％的制品。
因此，根据本发明之一，提供了一种用于检测NPAA的组合物，其包括如下4种抗原多肽：
H-LCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASP-OH；
H-GEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSI-OH；
H-VQLTLAFREGTINVDVETQFNQYKTEAASRYNLTISD-OH；
H-LLYVGQSAAAIGANVWLSAWTNDAMADSRQNNTSL-OH。
在一些实施方案中，所述4种抗原多肽为高纯度制品，优选为纯度>95％的化学合成制品。
在一些实施方案中，所述组合物中4种抗原多肽的比例为1:1:1:1(浓度比或体积比)。
根据本发明的另一个方面，提供一种用上述组合物制成的试剂盒。
在一些实施方案中，在所述试剂盒中，将4种抗原多肽混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装。
在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。
在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述组合物或上述试剂盒检测待测样品中的NPAA的方法，所述方法为体外的、非诊断目的的检测技术。
在一些实施方案中，所述方法包括将上述组合物中的4种抗原多肽等比混合，然后通过抗原抗体结合反应检测待测样品中的NPAA浓度。
在优选的实施方案中，所述“通过抗原抗体结合反应检测个体血浆中的NPAA浓度”是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法实现的。
在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法ELISA。
在更优选的实施方案中，将上述组合物中的4种抗原多肽等比混合后，包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，放置4度过夜孵育，洗板，再对待测样品进行检测分析。
在更优选的实施方案中，所述对待测样品进行检测包括分步加样分析，所述分步加样分析包括将待测样品设双复孔，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl终止液10％硫酸溶液(10％H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
在更优选的实施方案中，所述待测样品为个体血浆。
在更优选的实施方案中，个体血浆为来自健康个体的血浆。
在更优选的实施方案中，所述方法的具体操作步骤为：
1、操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5毫克/ml储存液,然后等体积混合并放置-20℃(误差在±2℃范围内)冰箱中保存。
2、操作开始时，首先将表1中所列4种抗原多肽的混合液用包被液稀释为10～50微克/ml的工作液，该包被液为含0.15M氯化钠和10mMEDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。
3、用工作液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(Thermo Scientific,美国)，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。
4、然后按一下步骤分步加样和分析：
a、待测血浆样品设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为不含抗HER2抗体、抗VEGFR1抗体、抗MUC1抗体和抗ABCC3抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)，藉此可反映表1所述的4种多肽抗原在NPAA阴性反应体系中的实验指标值)和2个阳性对照孔(PC，参照物为人抗HER2抗体、人抗VEGFR1抗体、人抗MUC1抗体和人抗ABCC3抗体的等比混合物，藉此可反映表1所述的4种多肽抗原在NPAA阳性反应体系中的实验指标值)。
b、用分析液将待测血浆样品1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间，每孔加100μl,25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍。
c、用分析液(即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度为7.0～7.4之间)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(用以验证血浆中被检测的物质是否是特异性抗体)，抗体稀释比例为1:10000～1:50000，每孔加100μl，25℃孵育1-2小时。
d、用洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟。
e、每孔加50μl终止液10％硫酸溶液(10％H2SO4)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此定量分析个体血浆中NPAA水平。
在一些实施方案中，在进行群体随机抽样分析时，可针对每一个体检测所得数据进行分析，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定血浆中NPAA的相对水平。PSR计算方法如下：
PSR＝[待测样品OD值–NC OD值]/[阳性标准品OD值–NC OD值]。
在本发明的另一个方面，提供上述组合物或试剂盒在体外的、非诊断目的检测人血浆NPAA中的应用。
在优选的实施方案中，所检测的NPAA来自个体血浆。
在更优选的实施方案中，个体血浆为来自健康个体的血浆。
基于以上方案，本发明提供了精度高、操作简易、成本适中的NPAA检测技术，并在此基础上，进一步提供了对NPAA的半定量(或相对定量)的分析和应用方案，进而为发展基于健康人血浆NPAA的全新且副作用低的肿瘤免疫治疗策略奠定重要基础。
本发明提供了一种简便的人血浆NPAA检测手段，可用于辅助定性、定量检测NPAA这类天然抗肿瘤抗体，辅助量化测定不同个体的血浆NPAA水平，区分富含NPAA和不含NPAA的血浆，富含NPAA的血浆对肿瘤具有治疗作用。因此，本发明为血浆生物制品公司研发新产品和临床医学发展防治肿瘤的新措施提供了重要工具。由于本发明的抗原多肽合成手段相对简单而成本适中，为下一步应用富含NPAA血浆防治肿瘤和评估不含血浆NPAA个体的肿瘤发病风险的临床实践奠定了重要基础。血浆生物制品公司可利用本发明技术辅助筛选血浆，制备富含NPAA的丙种球蛋白，用于临床防治肿瘤；临床也可以直接给接受局部治疗后(如手术或放疗后)的早期肿瘤病人输入利用本发明技术筛选的富含NPAA的健康人血浆，提高其免疫监视功能，预防肿瘤的复发和转移。此外，用本发明产品检测出的血浆NPAA阴性个体，可能具有较高的肿瘤发病风险，可以对其进行临床随访和追踪，达到早期发现肿瘤和早期实施治疗的目的。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。
具体实施方式
下面结合实施例阐释本发明的原理。
实施例1 使用表1所述4种抗原多肽检测血浆中NPAA水平
1.样本收集：由广东省某血站提供102份正常成年人献血者的新鲜血浆样品。所述献血者均为临床体检确定的未曾患有任何类肿瘤的个体。操作前所有血浆样品均在4度(4℃)条件下保存，经核实保存时间未超过48小时。
2.样本检测：本实验所采用的表1中所列四种多肽抗原均由英国SEVERN BIOTECH有限公司合成，纯度为95％，具体操作步骤如下：
(1)操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5.0mg/ml储存液,然后等体积混合并放置-20℃(误差在±2℃范围内)冰箱中保存。
(2)操作开始时，首先将4种抗原混合液用包被液稀释为40微克/ml，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH值)为7.3。
(3)然后包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(Thermo Scientific,美国)，4℃过夜(16.5小时)孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度pH值为7.3。
(4)然后分步加样分析如下：
a、待测血浆样品设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)和2个阳性对照孔(PC，参照物为人抗HER2抗体、人抗VEGFR1抗体、人抗MUC1抗体和人抗ABCC3抗体的等比混合物)。
b、用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度(pH)为7.3，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
c、以洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度为7.3)洗板3遍后，用分析液(含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度(pH)为7.3)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗体稀释比例为1:25000，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。
d、以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测酸碱度PH值为7.3)洗板3遍后，每孔加100μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液(由LifeTechnologies公司提供)，室温避光25分钟。
e、每孔加50μl终止液10％硫酸溶液(10％H2SO4，)，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤可以依据此结果针对每一个体进行NPAA的定量对比分析。
(5)针对前述检测所得数据进行分析，采用阳性样品比值(Positivesample ratio，PSR)判定血浆中NPAA水平，PSR计算公式为：PSR＝[待测样品OD值–NC OD值]/[阳性标准品OD值–NC OD值]，应用95百分位数法确定富含NPAA血浆和不含NPAA血浆的阈值(cut-off)。
3.实验结果：本实施例随机抽取的102份正常成年人血浆样品中，其NPAA浓度平均值为PSR＝0.528，变异系数为47％。应用95百分位数法确定富含NPAA血浆的阈值为0.98，不含NPAA血浆的阈值为0.20，如表2所示。
表2.某血站102份正常成年人血浆样品NPAA浓度检测结果
由表2可知，在受检的102份正常成年人血浆样品中富含NPAA的人数为5例(4.9％)，不含NPAA的人数也为5例(4.9％)。
4.结果评价：上述4种线性抗原多肽与血浆中NPAA可发生特异性结合，即这4种线性抗原抗原多肽的氨基酸序列在空间结构和构型上与NPAA蛋白是完全互补的。
实施例2 富含NPAA的血浆对肿瘤细胞的效果
A549肺癌细胞株系源于肺胞基底上皮腺癌，属于传代细胞系；A549肺癌细胞株可稳定地传代培养，已广泛用于筛查抗肿瘤药物和验证肿瘤治疗方法，是非常理想的肿瘤前临床研究材料。本实施例中使用富含NPAA和不含NPAA的血浆培养A549肺癌细胞株，观察NPAA对该细胞株增殖的抑制作用。
1.用于细胞培养的血浆制备：随机抽取实施例1检测获得的富含NPAA和不含NPAA的血浆各3袋。在无菌条件下分别混合，分装后放置负20度(-20℃)冰箱中保存。
2.肿瘤细胞株的培养：将A549肺癌细胞株(得自广东医学院细胞库)分为两组，一组用10％富含NPAA的人血浆培养48小时，另一组用10％不含NPAA的人血浆培养48小时。另设对照组，用10％小牛血浆(对照血浆)培养A549肺癌细胞株48小时。采用CCK8比色法测量肺癌细胞的增殖情况，并比较两组之间的差异。CCK8比色法简述如下：
(1)将A549肺癌细胞株接种在96孔培养板上，用10％的人血浆培养48小时后，加入CCK-8溶液10微升。
(2)继续培养箱孵育1小时后，用酶标仪测定450nm波长时的各孔吸光度(OD)。
(3)计算细胞活度(％)＝(人血浆组OD值-试剂空白OD值)/(对照血浆组OD值-试剂空白OD值)。
3.实验结果：如表3所示，富含NPAA的人血浆对肺癌细胞增殖有明显的抑制作用。经统计学检验，两组之间的差别高度显著(p<0.05)。
表3.富含NPAA的人血浆对肺癌细胞增殖影响的实验结果
1数据为平均值±标准差,n为样本量；2统计学t检验；3自由度；4显著性差异水平。
4.结果评价：用上述富含NPAA血浆培养A549肺癌细胞株48小时，其增殖速度比不含NPAA血浆培养的细胞增殖速度明显减缓。这一结果说明，富含NPAA血浆对于临床治疗肺癌具有现实的进一步开发价值。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于检测NPAA抗体的组合物，其包括如下4种抗原多肽:
H-LCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASP-OH；
H-GEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSI-OH；
H-VQLTLAFREGTINVDVETQFNQYKTEAASRYNLTISD-OH；
H-LLYVGQSAAAIGANVWLSAWTNDAMADSRQNNTSL-OH。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物中各抗原多肽的比例为1:1:1:1(浓度比或体积比)。
3.由权利要求1或2的组合物制成的试剂盒。
4.根据权利要求3的试剂盒，将4种抗原多肽混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料真空密封包装，制成试剂盒。
5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述材料为玻璃或医用塑料。
6.一种体外的、非诊断目的检测个体血浆中的NPAA方法，其包括使用权利要求1或2所述的组合物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒对个体血浆中的NPAA进行检测。
7.根据权利要求6的方法，包括将所述4种抗原多肽等比混合，然后包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，4度过夜孵育，洗板，再进行分步加样分析。
8.权利要求6所述的方法，其中所述分步加样分析包括将待测血浆样品双复孔检测，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔；用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl终止液10％硫酸溶液，然后用酶标仪检测光密度值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
9.权利要求1或2所述的组合物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒在体外非诊断目的检测NPAA中的应用。
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